生產(chǎn)二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸組合物及其制作方法與用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及分離的微生物以及其菌株與突變株、生物質(zhì)、微生物油、組合物及培養(yǎng)物；生產(chǎn)所述微生物油、生物質(zhì)和突變株的方法；以及使用分離的微生物、生物質(zhì)及微生物油的方法。
【專利說明】生產(chǎn)二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸組合物及其制作方法
與用途
[0001]發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及分離的微生物以及其菌株與突變株、生物質(zhì)、微生物油、組合物及培養(yǎng)物；生產(chǎn)微生物油、生物質(zhì)及突變株的方法；以及使用分離的微生物、生物質(zhì)及微生物油的方法。
【背景技術(shù)】
[0003]脂肪酸的分類是基于碳鏈的長(zhǎng)度與飽和特性。根據(jù)鏈中所存在的碳數(shù)目，脂肪酸被稱作短鏈、中鏈或長(zhǎng)鏈脂肪酸，當(dāng)碳原子之間無雙鍵存在時(shí)稱作飽和脂肪酸，當(dāng)有雙鍵存在時(shí)稱作不飽和脂肪酸。當(dāng)僅存在一個(gè)雙鍵時(shí)，不飽和的長(zhǎng)鏈脂肪酸是單不飽和的；當(dāng)存在一個(gè)以上的雙鍵時(shí)，則是多不飽和的。
[0004]多不飽和脂肪酸(TOFAs)的分類是基于自脂肪酸甲基端開始的第一個(gè)雙鍵的位置:ω-3(η_3)脂肪酸在第三個(gè)碳上具有第一個(gè)雙鍵，而ω_6(η_6)脂肪酸則在第六個(gè)碳上具有第一個(gè)雙鍵。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是一種具有22個(gè)碳的鏈長(zhǎng)度和6個(gè)雙鍵的ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，通常命名為“22:6η-3”。其它ω-3LC_PUFAs包括命名為“20:5n-3”的二十碳五烯酸(1?八”)，和命名為“22:511-3”的ω-3 二十二碳五烯酸(“DPA η-3”)。DHA及EPA已被稱作“必需”脂肪酸。co-6LC_PUFAs包括命名為“20:4n_6”的二十碳四烯酸(“ARA ”)和命名為“22:5n-6”的ω-6 二十二碳五烯酸(“DPAn-6”)。
[0005]由于位于細(xì)胞膜中，ω-3脂肪酸是影響細(xì)胞生理功能的重要的生物學(xué)分子，它能調(diào)節(jié)生物活性化合物的產(chǎn)生與基因表達(dá)，并起到生物合成底物的作用。Roche，H.Μ.，Proc.Nutr.Soc.58:397-401 (1999)。例如，DHA占人類大腦皮層中脂質(zhì)的約15%至20%，占視網(wǎng)膜中脂質(zhì)的30%至60%，在睪丸與精子中富集，并且是母乳中的一個(gè)重要組分。Berg6，J.P.和 Barnathan,G..Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.96:49-125 (2005)。DHA 占腦中 ω-3脂肪酸的至多97%，并且占視網(wǎng)膜中ω-3脂肪酸的至多93%。此外，DHA是胎兒與嬰兒發(fā)育以及維持成人認(rèn)知功能所必需的。引用同上。因?yàn)樵谌梭w中無法從頭合成ω-3脂肪酸，因此這些脂肪酸必須從營(yíng)養(yǎng)來源獲取。
[0006]亞麻仁油與魚油被認(rèn)為是良好的ω-3脂肪酸膳食來源。亞麻仁油不含有ΕΡΑ、DHA, DPA或ARA，但卻含有亞麻酸(C18: 3η_3)，其是使機(jī)體能夠制造EPA的一種結(jié)構(gòu)單元。然而有證據(jù)顯示代謝轉(zhuǎn)換的速率緩慢且多變，特別在健康不佳的那些個(gè)體中。根據(jù)具體的物種及其飲食，魚油在脂肪酸組成的類型與水平方面存在顯著的差異。例如，與野生魚類相t匕，水產(chǎn)養(yǎng)殖所飼養(yǎng)的魚的ω-3脂肪酸水平較低。此外，魚油具有含環(huán)境污染物的風(fēng)險(xiǎn)，并且可能伴隨著穩(wěn)定性問題和魚的腥臭或味道。
[0007]破囊壺菌(Thraustochytrids)是破囊壺菌目(Thraustochytriales)的微生物。破囊壺菌包括裂殖壺菌屬(Schizochytrium)與破囊壺菌屬(Thraustochytrium)的成員，并且已經(jīng)確認(rèn)為包括DHA與EPA在內(nèi)的ω-3脂肪酸的一種替代來源。參見第5130242號(hào)美國(guó)專利。與相應(yīng)的魚油或微藻油相比，由這些海生異養(yǎng)型微生物所生產(chǎn)的油通常具有更簡(jiǎn)單的多不飽和脂肪酸分布(profiles)。Lewis, T.Ε.，Mar.Biotechnol.1:580-587(1999)。已報(bào)導(dǎo)破囊壺菌物種的菌株所生產(chǎn)的ω-3脂肪酸，在該生物體所生產(chǎn)的總脂肪酸中占很高的百分比。第5130242號(hào)美國(guó)專利；Huang，J.等的J.Am.0il.Chem.Soc.78:605-610(2001) ；Huang, J.等的 Mar.Biotechnol.5:450-457 (2003)。然而，分離的破囊壺菌在所生產(chǎn)的LC-PUFAs的種類和量方面不同，這使得一些先前所述的菌株在培養(yǎng)中可能具有不期望的ω-6脂肪酸水平和/或會(huì)表現(xiàn)低的生產(chǎn)力。因此，一直存在對(duì)展現(xiàn)出高生產(chǎn)力和所期望的LC-PUFA分布的微生物的分離的需求。
[0008]發(fā)明概述
[0009] 申請(qǐng)人:已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，可以通過在微生物發(fā)酵時(shí)改變發(fā)酵液的水相中溶解的二氧化碳(CO2)的量來調(diào)控破囊壺菌所產(chǎn)生的EPA和DHA的量，其中所述破囊壺菌產(chǎn)生具有至少3%EPA的生物質(zhì)。本文中提供制備具有脂肪酸和一定濃度的EPA的微生物生物質(zhì)的方法，其包含:在具有溶解有氣體的發(fā)酵液的發(fā)酵罐容器中發(fā)酵微生物，以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；并且調(diào)節(jié)所溶解的氣體中溶解的CO2水平。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以調(diào)節(jié)溶解的CO2水平，來在生物質(zhì)中實(shí)現(xiàn)所期望的EPA和/或DHA水平。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在發(fā)酵液的水相中溶解的CO2的量在總?cè)芙鈿怏w的約38至約600ppm范圍內(nèi)、并且具體地在總?cè)芙鈿怏w的約38至約135ppm范圍內(nèi)。
[0010]本文還提供制備具有脂肪酸和一定濃度的EPA的微生物生物質(zhì)的方法，其包含:在含有氣體的發(fā)酵罐容器中發(fā)酵微生物，以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA 的生物質(zhì)的破囊壺菌；并且用CO2補(bǔ)充氣體。補(bǔ)充指的是以相對(duì)于細(xì)胞發(fā)酵所產(chǎn)生的量而言額外的量或者以環(huán)境條件下的量，向容器中加入或充入co2。在一個(gè)實(shí)施方式中，向容器中補(bǔ)充C02，從而在生物質(zhì)中實(shí)現(xiàn)所期望的EPA和/或DHA量。
[0011]本文也提供了制備具有脂肪酸和一定濃度的EPA的微生物生物質(zhì)的方法，其包含:在發(fā)酵罐容器中發(fā)酵微生物，以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中該微生物包含生產(chǎn)具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；并調(diào)節(jié)容器中生物質(zhì)的量。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)生物質(zhì)，從而在生物質(zhì)中實(shí)現(xiàn)所期望的EPA或DHA水平。
[0012]制備具有脂肪酸和一定濃度的EPA的微生物的方法，其包含:在發(fā)酵罐容器中發(fā)酵微生物以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中該微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；并且調(diào)節(jié)生物質(zhì)上的壓強(qiáng)，例如但不限于控制容器的背壓(backpressure)。在一個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)壓強(qiáng)，從而在生物質(zhì)中實(shí)現(xiàn)所期望的EPA或DHA水平。
[0013]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本文提供了制造具有脂肪酸和一定濃度的EPA的微生物的方法，其包含:在發(fā)酵罐容器中發(fā)酵微生物以產(chǎn)生發(fā)酵液和生物質(zhì)，其中該微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；并且調(diào)節(jié)發(fā)酵液中的溫度。在一個(gè)實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)溫度，從而在生物質(zhì)中實(shí)現(xiàn)所期望的EPA或DHA水平。
[0014]在多個(gè)實(shí)施方式中，也可以通過提高或降低容器中CO2的量來調(diào)節(jié)容器的水相或發(fā)酵液中溶解的CO2的量，從而調(diào)控EPA和DHA的量?？梢酝ㄟ^額外調(diào)節(jié)發(fā)酵的生物質(zhì)的量，來調(diào)節(jié)溶解的CO2的量。例如，通過在瓶和較大的發(fā)酵容器中發(fā)酵細(xì)胞。也可以通過改變溫度，根據(jù)本文中所提供的實(shí)施方式來改變EPA和DHA。例如可以通過調(diào)節(jié)容器中溫度來額外地調(diào)節(jié)溶解的CO2的量。例如，較低的容器溫度會(huì)產(chǎn)生較高濃度的EPA和較低濃度的DHA。還可以通過調(diào)節(jié)容器中壓強(qiáng)，來調(diào)節(jié)溶解的CO2的量。例如升高的壓強(qiáng)很可能增加溶解的CO2，這會(huì)增加生物質(zhì)中EPA的量并降低DHA的量。上述的每一種調(diào)節(jié)諸如補(bǔ)充CO2、增加或減少生物質(zhì)、提高或降低溫度、或者提高或降低壓強(qiáng)，均可以與其他調(diào)節(jié)中的任意一個(gè)結(jié)合，從而在生物質(zhì)以及由生物質(zhì)所提取的任何油中實(shí)現(xiàn)所期望的EPA和DHA水平。還可以通過pH的改變來調(diào)節(jié)溶解的CO2。
[0015]在一些實(shí)施方式中，與脂肪酸和ω-3脂肪酸總重量的量相比，EPA和DHA的總量(以重量計(jì))保持相對(duì)恒定。
[0016]在其他實(shí)施方式中，在對(duì)補(bǔ)充的CO2的量、壓強(qiáng)、溫度、或者生物質(zhì)進(jìn)行調(diào)節(jié)之前，測(cè)量生物質(zhì)的EPA或DHA含量。
[0017]雖然不希望受任何理論約束，但是推測(cè)EPA或DHA的量的增加或減少與發(fā)酵液的水相中溶解的CO2的量直接相關(guān)，并且對(duì)CO2、壓強(qiáng)和溫度的上述調(diào)節(jié)會(huì)改變生物質(zhì)中溶解的CO2的量。
[0018]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備具有升高濃度的EPA的微生物生物質(zhì)的方法，該方法包含:使微生物在含有小于0.lmg/L維生素Β12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以產(chǎn)生生物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含小于0.01mg/L維生素B12。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含小于0.00lmg/L維生素B12。在另一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含小于0.000lmg/L維生素B12。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基不包含維生素B12。
[0019]在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基還包含以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于Ig的酵母提取物。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基還包含以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.5g的酵母提取物。在另一些實(shí)施方式中，培 養(yǎng)基還包含以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.1g的酵母提取物。
[0020]在一些實(shí)施方式中，與由包含大于0.lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度相比，EPA濃度增加了至少400%。在一些實(shí)施方式中，與由來自包含大于0.0 lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度相比，EPA濃度增加了至少300 %。在另一些實(shí)施方式中，與來自包含大于0.001mg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度相比，EPA濃度增加了至少200%。在一些實(shí)施方式中，與來自包含大于0.000lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度相比，EPA濃度增加了至少100%。
[0021]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備具有升高濃度的EPA的微生物生物質(zhì)的方法，其包含:使微生物在含有小于0.lmg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以產(chǎn)生生物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含小于0.0 lmg/L鈷。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含小于0.00 lmg/L鈷。在另一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含小于0.0001mg/L鈷。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基不包含鈷。
[0022]在一些實(shí)施方式中，微生物是破囊壺菌。在一些實(shí)施方式中，微生物產(chǎn)生脂肪酸總重量的至少3% EPA。
[0023]在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基具有至少5%的溶解的CO2的水平。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基具有至少10%的溶解的CO2的水平。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基具有至少15%的溶解的CO2的水平。
[0024]本發(fā)明還提供分離的生物質(zhì)以及由本文的任意一種方法的生物質(zhì)所提取得到的微生物油。
[0025]附圖簡(jiǎn)要說明
[0026]從下文的發(fā)明詳述、附圖和附帶的序列描述中可較充分地理解本發(fā)明的各個(gè)實(shí)施方式，它們形成本專利申請(qǐng)的一部分。
[0027]圖1示出了 PTA-9695在硫胺素梯度中的性能。
[0028]圖2示出了 PTA-9695在維生素B12梯 度中的性能。
[0029]圖3示出了 PTA-9695在生物素梯度中的性能。
[0030]圖4示出了 PTA-9695在泛酸鈣梯度中的性能。
[0031]圖5示出了 PTA-9695在TSFM標(biāo)準(zhǔn)品(standards)中的性能。
[0032]圖6-圖19示出了在10% CO2下PTA-9695在維生素B12梯度中的性能。
[0033]圖20-圖49示出了在10% CO2下PTA-10208在維生素B12梯度中的性能。
[0034]發(fā)明詳述
[0035]本文所提供的方法和組合物尤其適用于破囊壺菌，該破囊壺菌產(chǎn)生具有其產(chǎn)生的脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)。本文所提供的產(chǎn)生具有至少3% EPA的生物質(zhì)的具體的破囊壺菌是在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏物種的分離的微生物。與ATCC登錄號(hào)PTA-10212有關(guān)的分離的微生物按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美國(guó)維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學(xué)大道(UniversityBoulevard) 10801 號(hào)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(Patent Depository)。
[0036]產(chǎn)生具有至少3 % EPA的生物質(zhì)的具體的破囊壺菌選自在ATCC登錄號(hào)PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210 或PTA-10211下所保藏的分離的微生物。
[0037]本文所提供的【具體實(shí)施方式】涉及包含18s rRNA的分離的微生物，所述18s rRNA含有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或與SEQ ID NO:1具有至少94%同一性的多核苷酸序列。
[0038]本文所提供的【具體實(shí)施方式】涉及分離的微生物，其包含與在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏的微生物的18s rRNA多核苷酸序列具有至少94%同一性的18s rRNA多核苷酸序列。
[0039]本文所提供的產(chǎn)生具有至少3% EPA的生物質(zhì)的具體的破囊壺菌涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏的物種的分離的微生物。
[0040]本文所提供的【具體實(shí)施方式】涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏的物種的分離的微生物，其中該微生物所產(chǎn)生的總脂肪酸包含超過約10重量％的二十碳五烯酸。
[0041]本發(fā)明中產(chǎn)生具有至少3% EPA的生物質(zhì)的具體破囊壺菌涉及具有在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下保藏的物種的特性的分離的微生物，其中該微生物所生產(chǎn)的總脂肪酸包含超過約10重量％的二十碳五烯酸。本文所提供的產(chǎn)生具有至少3% EPA的生物質(zhì)的具體破囊壺菌選自分離的微生物，該分離的微生物選自在ATCC登錄號(hào)PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211下保藏的突變株。與ATCC登錄號(hào)PTA-10209, PTA-10210和PTA-10211有關(guān)的微生物按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年9月25日保藏于美國(guó)維吉尼亞州 20110-2209 馬納沙斯(Manassas)大學(xué)大道(University Boulevard) 10801 號(hào)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(PatentDepository)。
[0042]本文所提供的各個(gè)實(shí)施方式涉及上面所描述的微生素、它們的突變株和第12/729013號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)中所認(rèn)定的微生物，其通過引用全部并入本文。
[0043]本文所提供的一個(gè)實(shí)施方式涉及生產(chǎn)甘油三酯部分的分離的微生物，其中該甘油三酯部分的二十碳五烯酸含量是至少約12重量％。
[0044]本文所提供的一個(gè)實(shí)施方式涉及分離的生物質(zhì)，其中該生物質(zhì)的細(xì)胞干重中的至少約20重量％為脂肪酸，其中超過約10重量％的脂肪酸為二十碳五烯酸，并且其中該脂肪酸包含各低于約5重量％的二十碳四烯酸和二十二碳五烯酸n-6。在一些實(shí)施方式中，至少約25重量％的脂肪酸為二十二碳六烯酸。
[0045]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含甘油三酯(triacylglycerol)的分離的生物質(zhì)，其中至少約12重量％的甘油三酯為二十碳五烯酸。
[0046]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的任意一種分離的生物質(zhì)，其中該脂肪酸還包含各低于約5重量％的油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳烯酸和芥子酸。
[0047]本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下保藏的破囊壺菌物種的分離的破囊壺菌微生物或由其衍生的菌株，其中所述微生物或由其衍生的菌株所產(chǎn)生的總脂肪酸包含約10重量％或更少的二十碳五烯酸。本文所提供的實(shí)施方式涉及上述微物生或由其衍生的菌株以及第US2010/0239533號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)中所描述的其他相關(guān)微生素，該專利通過引用全部并入本文。
[0048]本文還提供了在具有脂肪酸和一定濃度的EPA的微生物的生物質(zhì)中提高EPA濃度的方法，其包含:在含有氣體的發(fā)酵罐容器中發(fā)酵微生物，以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；并且以足以提高生物質(zhì)中EPA濃度的量用CO2補(bǔ)充氣體?？梢詫PA濃度的升高與例如未補(bǔ)充CO2的類似地發(fā)酵的微生物中的EPA濃度相比、或者與環(huán)境條件下類似地發(fā)酵的微生物的EPA濃度相比。
[0049]在另一個(gè)實(shí)施方式中，足以提高EPA濃度的CO2的量大于或等于容器中總氣體的2%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，容器中CO2的量大于或等于容器中總氣體的約5%到至多約20%。在另一個(gè)實(shí)施方式中，容器中CO2的量大于或等于容器中總氣體的約5%到至多約15%。
[0050]在另一個(gè)實(shí)施方式中，補(bǔ)充的CO2的量大于或等于容器中總氣體的2%，以提高生物質(zhì)中EPA濃度到大于脂肪酸總重量的約4重量％、更具體地大于脂肪酸總重量的約4重量％到至多約45重量％、更具體地大于脂肪酸總重量的約4重量％到至多約40重量％。
[0051]在另一個(gè)實(shí)施方式中，補(bǔ)充的CO2的量足以將EPA水平從脂肪酸總重量的約4重量％提高到約6-30重量％的范圍內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所提供的CO2的量足以將EPA濃度從脂肪酸總重量的約15重量％提高到至多約40重量％。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所提供的CO2的量足以將EPA濃度提高到大于脂肪酸總重量的約20重量％。在另一個(gè)實(shí)施方式中，CO2是以足以將EPA濃度從約20%提高到至多約25%的量提供的。
[0052] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，本文所提供的是提高具有脂肪酸和一定濃度EPA的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度的方法，其包含:在發(fā)酵罐容器中發(fā)酵微生物來生產(chǎn)生物質(zhì)；在生物質(zhì)上提供足以提高生物質(zhì)中EPA濃度的壓強(qiáng)。可以將EPA濃度的升高與例如未提供壓強(qiáng)的類似地發(fā)酵的微生物中的EPA濃度相比、或者與環(huán)境條件下類似地發(fā)酵的微生物的EPA濃度相比。在另一個(gè)實(shí)施方式中，在生物質(zhì)上所提供的壓強(qiáng)高于大氣壓強(qiáng)約0.5psi。在另一個(gè)實(shí)施方式中，容器具有大于或等于約0.4ps1、更具體地約0.4psi到至多約30ps1、甚至更具體地約I到至多約30psi的頂空壓強(qiáng)(head pressure或背壓)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，容器具有約I到至多約20psi的頂空壓強(qiáng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，將所提供的壓強(qiáng)提供足以調(diào)節(jié)生物質(zhì)中EPA的量的時(shí)間、具體地至多120個(gè)小時(shí)。
[0053]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本文所提供的是制備生產(chǎn)脂肪酸和一定濃度的EPA的微生物生物質(zhì)的方法，其包含在足以提高生物質(zhì)中EPA濃度的溫度下在發(fā)酵容器中發(fā)酵微生物來生產(chǎn)生物質(zhì)，其中微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌。在一些實(shí)施方式中，足以提高EPA水平的溫度小于約30°C、更具體地小于或等于約22°C、并且更具體地該溫度為小于或等于約21°C?？梢詫PA濃度的升高與例如未調(diào)節(jié)溫度的類似地發(fā)酵的微生物中的EPA濃度相比、或者與環(huán)境條件下類似地發(fā)酵的微生物的EPA濃度相比。
[0054]在另一個(gè)實(shí)施方式中，本文所提供的方法改變發(fā)酵時(shí)所產(chǎn)生的EPA的量，來生產(chǎn)生物質(zhì)和所提取的油，其中所提供的EPA的量大于脂肪酸總重量的4重量％、具體地從大于約4重量％到至多約45重量％、更具體地從大于約4重量％到至多約40重量％。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過本文提供的方法所產(chǎn)生的EPA的量為脂肪酸總重量的約6重量％到至多約30重量％的量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過本文提供的方法所產(chǎn)生的EPA的量為脂肪酸總重量的約15重量％到至多約40重量％的量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過本文提供的方法所產(chǎn)生的EPA的量為脂肪酸總重量的大于約20重量％的量、更具體地從約20重量％到至多約25重量％的量。
[0055]在另一個(gè)實(shí)施方式中，所提供的期望的EPA水平為脂肪酸總重量的大于4重量％、具體地從大于約4重量 ％到至多約45重量％、更具體地從大于約4重量％到至多約40重量％的量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過本文提供的方法所產(chǎn)生的期望的EPA水平為脂肪酸總重量的約6重量％到至多約30重量％的量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過本文提供的方法所產(chǎn)生的期望的EPA水平為脂肪酸總重量的約15重量％到至多約40重量％的量。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過本文提供的方法所產(chǎn)生的期望的EPA水平為脂肪酸總重量的大于約20重量％、更具體地從約20重量％到至多25重量％的量。
[0056]提高具有脂肪酸和一定濃度的EPA的微生物生物質(zhì)的方法，其包含:在發(fā)酵罐容器中發(fā)酵微生物來生產(chǎn)生物質(zhì)，其中微生物是產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；并且以足以提高生物質(zhì)中EPA濃度的量增加生物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，足以提高EPA濃度的量的生物質(zhì)具有大于或等于10g/l的密度。在一些實(shí)施方式中，足以提高EPA濃度的量的生物質(zhì)具有約10g/l到至多250g/l的密度?？梢詫PA濃度的升高與例如其中未增加生物質(zhì)的類似地發(fā)酵的微生物中的EPA濃度相比。
[0057]在一些實(shí)施方式中，在包含較高的CO2水平(例如在以容器中總氣體的大于或等于2%、大于或等于5%、大于或等于10%、大于或等于15%、大于或等于20%、5%至20%、或5%至15%的量含有CO2的容器中)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比由包含較低的CO2水平(例如分別在以容器中總氣體的小于2%、小于5%、小于10%、小于15%、小于20%、0%至4%、或1%至3%的量含有CO2的容器中)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少10 %、至少50 %、至少100 %、至少250 %、至少500 %、至少750 %、至少 1000%、至少 1100%、至少 1200%、至少 1300%、至少 1400%、至少 1500%、至少 1600%,至少1700%、至少1800%、至少1900%、或至少2000%。例如，包含較高的CO2水平(例如在以容器中總氣體的大于或等于2%、大于或等于5%、大于或等于10%、大于或等于15%、大于或等于20%、5%至20%、或5%至15%的量含有CO2的容器中)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比由環(huán)境CO2水平下容器中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少10%、至少50%、至少100%、至少250%、至少500%、至少750%、至少1000%、至少1100 %、至少 1200%、至少 1300%、至少 1400 %、至少 1500%、至少 1600 %、至少 1700%、至少1800%、至少1900%、或至少2000%。
[0058]培養(yǎng)基中維生素B12
[0059]本文中使用時(shí)術(shù)語“維生素B12”指的是天然存在和合成形式的、化學(xué)相關(guān)的一類化合物，包括但不限于維生素B12、鈷胺素、氰鈷胺素和羥鈷胺。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了通過使生產(chǎn)EPA的微生物在具有低水平維生素B12的培養(yǎng)基中或不含維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，來提高微生物生物質(zhì)EPA濃度的方法。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備具有提高的EPA濃度的微生物的生物質(zhì)的方法，其包含在含有小于0.lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)微生物來生產(chǎn)生物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含小于0.05mg/L、小于0.005mg/L、小于0.001mg/L、小于0.0005mg/L、小于0.000lmg/L的維生素B12或者不含維生素B12。
[0060]在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于Ig的維生素B12源(例如酵母提取物、玉米浸潰固體(corn steep solids)、大豆粉以及其他復(fù)合氮源)。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.8g、小于0.5g、小于0.3g、小于0.lg、小于0.05g或小于0.0 1g的這種維生素B12源。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基還包含以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于Ig酵母提取物、以每50g的無脂生物質(zhì)中0.Sg酵母提取物、以每50g的無脂生物質(zhì)中小于0.5g酵母提取物、以每50g的無脂生物質(zhì)中小于0.3g酵母提取物、以每50g的無脂生物質(zhì)中小于0.1g酵母提取物、以每50g的無脂生物質(zhì)中小于0.05g酵母提取物、或者以每50g的無脂生物質(zhì)中小于0.01g酵母提取物。本文使用時(shí)，術(shù)語“無脂生物質(zhì)”指的是培養(yǎng)后微生物的目標(biāo)無脂肪的細(xì)胞干重。
[0061]在一些實(shí)施方式中，在包含較低的維生素B12水平的培養(yǎng)基中(例如在含有小于0.lmg/L、小于 0.05mg L、小于 0.01mg/L、小于 0.005mg/L、小于 0.001mg/L、小于 0.0005mg/L、小于0.0001mg/L的維生素B12、或者不含維生素B12的培養(yǎng)基中)生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比由包含較高的維生素B12水平的培養(yǎng)基中(例如分別包含至少0.1mg L、至少0.05mg/L、至少 0.01mg L、至少 0.005mg L、至少 0.001mg/L、至少 0.0005mg L、至少 0.0001mg/L、或至少0.00005mg/L維生素B12的培養(yǎng)基中)生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少10%、至少25%、至少50%、至少75%、至少100%、至少150%、至少200%、至少250%、至少300 %、至少350 %、至少400 %、至少450 %、至少500 %、至少550 %、至少600 %、至少650%或至少700%。例如，在不包含維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比由包含維生素B12(例如至少0.000lmg/L維生素B12)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少10%、至少25%、至少50%、至少75%、至少100%、至少150%、至少200%、至少250%、至少300%、至少350%、至少400%、至少450%、至少500 %、至少550 %、至少600 %、至少650 %、或至少700 %。[0062]在一些實(shí)施方式中，在環(huán)境CO2水平下包含較低的維生素B12水平的培養(yǎng)基中(例如在含有小于 0.lmg/L、小于 0.05mg L、小于 0.01mg/L、小于 0.005mg/L、小于 0.001mg/L、小于0.0005mg/L、小于0.000lmg/L的維生素B12、或者不含維生素B12的培養(yǎng)基中)生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在環(huán)境CO2水平下由包含較高的維生素B12水平的培養(yǎng)基中(例如分別包含至少0.1mg L、至少0.05mg/L、至少0.01mg L、至少0.005mg L、至少0.001mg/L、至少0.0005mg L、至少0.0001mg/L、或至少0.00005mg/L維生素B12的培養(yǎng)基中)生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、或至少500%。在一些實(shí)施方式中，在環(huán)境CO2水平下包含較低的維生素B12水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在環(huán)境CO2水平下由包含較高的維生素B12水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高100 %至700 %、150 %至650 %、200 %至600 %、250%至550%、或300%至500%。在一些實(shí)施方式中，在高CO2水平下(例如至少5%、至少10%、至少15%、或至少20%的溶解的CO2水平)包含較低的維生素B12水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在高CO2水平下由包含較高的維生素B12水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少100%。在一些實(shí)施方式中，在高CO2水平下(例如至少5%、至少10%、至少15%、或至少20%的溶解的CO2水平)包含較低的維生素B12水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在高CO2水平下由包含較高的維生素B12水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中 EPA濃度高 5%至 200%、10%至 175%、15%至 150%、20%至 125%、或 25%至 100%。例如，在環(huán)境CO2水平下在不含維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在環(huán)境CO2水平下由包含維生素B12 (例如至少0.000lmg/L維生素B12)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少100 %、至少200 %、至少300 %、至少400 %、或至少500 %。另一個(gè)例子是，在至少10%的溶解的CO2水平下在不含維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在至少10%的溶解的CO2水平下由包含維生素B12 (例如至少0.000lmg/L維生素B12)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至 少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、或至少100%。
[0063]在一些實(shí)施方式中，與具有大于0.lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的相同微生物相比，在具有小于0.lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度升高至少100 %、至少200 %、至少300 %、至少400 %、或至少500 %。在一些實(shí)施方式中，與具有大于0.0 lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的相同微生物相比，在具有小于0.0 lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度升高至少100%、至少200%、至少300 %、至少400 %、或至少500 %。在一些實(shí)施方式中，與具有大于0.00lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的相同微生物相比，在具有小于0.001mg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度升高至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、或至少500%。在另外一些實(shí)施方式中，與具有大于0.0001mg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的相同微生物相比，在具有小于0.000lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度升高至少100 %、至少200 %、至少300 %、至少400 %、或至少500 %。在一些實(shí)施方式中，與具有一定量維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的相同微生物相比，在不含維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度升高至少100%、至少200%、至少300%、至少400%、或至少500%?？梢酝ㄟ^使微生物在具有較高量維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、使相同微生物在具有較低量維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并比較每個(gè)培養(yǎng)物中所得到的生物質(zhì)中EPA的濃度，來測(cè)定生物質(zhì)中EPA濃度的升高。在該測(cè)定中，除了它們的維生素B12水平之外，具有較低或較高量的維生素B12的培養(yǎng)基的內(nèi)容物相同。
[0064]在一些實(shí)施方式中，在包含至少0.lmg/L、至少0.05mg/L、至少0.01mg/L、至少0.005mg/L、至少0.001mg/L、至少0.0005mg/L、或至少0.000lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)的EPA濃度為總脂肪酸的至少I重量％、至少2重量％、至少3重量％、至少4重量％、或至少5重量％的EPA。在一些實(shí)施方式中，在包含至少0.lmg/L、至少 0.05mg/L、至少 0.01mg/L、至少 0.005mg/L、至少 0.001mg/L、至少 0.0005mg/L、或至少0.0001mg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)的EPA濃度為總脂肪酸的1%至 50%、1%至 40%、1%至 30%、1%至 20%、2%至 50%、2%至 40%、2%至 30%、或 2%至20% 的 EPA。
[0065]培養(yǎng)基中鈷
[0066]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供制備具有升高的EPA濃度的微生物的生物質(zhì)的方法，其包含使微生物在含有小于0.lmg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)來生產(chǎn)生物質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基包含小于0.05mg/L、小于0.01mg/L、小于0.005mg/L、小于0.001mg/L、小于0.0005mg/L、小于0.000lmg/L的鈷、或不含鈷。
[0067]在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基還包含以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于Ig的酵母提取物、以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.Sg的酵母提取物、以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.5g的酵母提取物、以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.3g的酵母提取物、以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.1g的酵母提取物、以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.05g的酵母提取物、或者以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.01g的酵母提取物。
[0068]在一些實(shí)施方式中，在含有較低鈷水平的培養(yǎng)基中(例如在包含小于0.lmg/L、小于 0.05mg/L、小于 0.0 lmg/L、小于 0.005mg/L、小于 0.00 lmg/L、小于 0.0005mg/L、小于0.000lmg/L的鈷、或不含鈷的培養(yǎng)基中)生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比含有較高鈷水平的培養(yǎng)基中(例如在分別包含至少0.lmg/L、至少0.05mg/L、至少0.01mg/L、至少0.005mg/L、至少0.001mg/L、至少0.0005mg/L、至少0.0001mg/L、或至少0.00005mg/L鈷的培養(yǎng)基中)生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少10%、至少25%、至少50%、至少75%、至少100%、至少150%、至少200%.、至少250%、至少300%、至少350%、至少400%、至少450 %、至少500 %、至少550 %、至少600 %、至少650 %、或至少700 %。例如，在不含鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比包含鈷(例如至少0.0001mg/L鈷)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少10 %、至少25 %、至少50 %、至少75 %、至少100 %、至少150%、至少200%、至少250%、至少300%、至少350%、至少400%、至少450%、至少500 %、至少550 %、至少600 %、至少650 %或至少700 %。
[0069]在一些實(shí)施方式中，在環(huán)境CO2水平下在包含較低鈷水平的培養(yǎng)基中(例如，在包含小于 0.lmg/L、小于 0.05mg/L、小于 0.01mg/L、小于 0.005mg/L、小于 0.001mg/L、小于0.0005mg/L、小于0.000lmg/L或不含鈷的培養(yǎng)基)生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在環(huán)境CO2水平下包含較高鈷水平的培養(yǎng)基中(例如，在分別包含至少0.lmg/L、至少0.05mg/L、至少 0.01mg/L、至少 0.005mg/L、至少 0.001mg/L、至少 0.0005mg/L、至少 0.000lmg/L 或至少0.00005mg/L鈷的培養(yǎng)基中)生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少100%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。在一些實(shí)施方式中，在環(huán)境CO2水平下在包含較低鈷水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在環(huán)境CO2水平下在包含較高鈷水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高100%至700%、150%至650%、200%至600%、250%至550%或300%至500%。在一些實(shí)施方式中，在高CO2水平(例如，至少5%、至少10%、至少15%或至少20%的溶解的CO2水平)下在包含較低鈷水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在高CO2水平下在包含較高鈷水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或至少100 %。在一些實(shí)施方式中，在高CO2水平(例如，至少5%、至少10%、至少15%或至少20%的溶解的CO2水平)下在包含較低鈷水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在高CO2水平下在包含較高鈷水平的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高5%至200%、10%至175%、15%至150%、20%至125%或25%至100%。例如，在環(huán)境CO2水平下不含鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在環(huán)境CO2水平下包含鈷(例如至少0.0OOlmg/L鈷)的培養(yǎng)基中高至少100%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。另一個(gè)例子是，另一個(gè)例子是，在至少10%的溶解的CO2水平下不含鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的生物質(zhì)的EPA濃度比在至少10%的溶解的CO2水平下包含鈷(例如至少0.000lmg/L鈷)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度高至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%。
[0070]在一些實(shí)施方式中，與在具有大于0.lmg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的相同微生物相t匕，在具有小于0.lmg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度提高了至少100%、至少200%、至 少300%、至少400%或至少500%。在一些實(shí)施方式中，與在具有大于0.01mg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的相同微生物相比，在具有小于0.01mg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度提高了至少100%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。在一些實(shí)施方式中，與在具有大于0.001mg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的相同微生物相比，在具有小于0.001mg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度提高了至少100%,至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。在一些實(shí)施方式中，與在具有大于0.0001mg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的相同微生物相比，在具有小于0.0001mg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度提高了至少100%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%。在一些實(shí)施方式中，與在具有一定量鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的相同微生物相比，在不含鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)中EPA濃度提高了至少100%、至少200%、至少300%、至少400%或至少500%?？梢酝ㄟ^使微生物在具有較高量鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、使相同微生物在具有較低量鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并比較每個(gè)培養(yǎng)物中所得到的生物質(zhì)中的EPA濃度，來測(cè)定生物質(zhì)中EPA濃度的升高。在該測(cè)定中，除了它們的鈷水平之外，具有較低或較高量的鈷的培養(yǎng)基的內(nèi)容物相同。
[0071]在一些實(shí)施方式中，在包含至少0.lmg/L、至少0.05mg/L、至少0.01mg/L、至少
0.005mg/L、至少0.001mg/L、至少0.0005mg/L或至少0.000lmg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)的EPA濃度為總脂肪酸的至少I重量％、至少2重量％、至少3重量％、至少4重量％或至少5重量^^^EPA。在一些實(shí)施方式中，在包含至少0.lmg/L、至少0.05mg/L、至少 0.01mg/L、至少 0.005mg/L、至少 0.001mg/L、至少 0.0005mg/L 或至少 0.000lmg/L 鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物的生物質(zhì)的EPA濃度是總脂肪酸的I重量％至50重量％、I重量％至40重量％、I重量％至30重量％、I重量％至20重量％、2重量％至50重量％、2重量％至40重量％、2重量％至30重量％或2重量％至20重量％的EPA。
[0072]含有少量維生素B12、酵母提取物和/或鈷的培養(yǎng)基還可以包含至少5%、至少10%、至少15%或至少20%的溶解的CO2水平。本發(fā)明涉及本文所公開的方法的分離的生物質(zhì)、以及涉及由這些方法的生物質(zhì)所提取的微生物油。
[0073]本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的任意微生物或其混合物的分離的培養(yǎng)物。
[0074]本發(fā)明涉及非人類的動(dòng)物或人類用的食用產(chǎn)品、化妝品或藥物組合物，其包含本發(fā)明的任意微生物或生物質(zhì)或其混合物。
[0075]本發(fā)明涉及微生物油，其包含至少約20重量％的二十碳五烯酸與各小于約5重量％的二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亞油酸、亞麻酸、二十碳烯酸、芥子酸及十八碳四烯酸。在一些實(shí)施方式中，該微生物油還包含至少約25重量％的二十二碳六烯酸。
[0076]本發(fā)明涉及包含至少約10重量％的甘油三酯部分的微生物油，其中甘油三酯部分中的至少約12重量％的脂肪酸為二十碳五烯酸，其中甘油三酯部分中的至少約25重量％的脂肪酸為二十二碳六烯酸，以及其中甘油三酯部分中的小于約5重量％的脂肪酸為二十碳四烯酸。
[0077]本發(fā)明涉及非人類的動(dòng)物或人類用的食用產(chǎn)品、化妝品或藥物組合物，其包含本發(fā)明的任意微生物油。在一些實(shí)施方式中，食用產(chǎn)品是嬰兒配方奶粉。在一些實(shí)施方式中，嬰兒配方奶粉是適合早產(chǎn)嬰兒使用的。在一些實(shí)施方式中，食用產(chǎn)品是乳、飲料、治療性飲品、營(yíng)養(yǎng)飲品或其組合。在一些實(shí)施方式中，食用產(chǎn)品是用于非人類的動(dòng)物或人類食品的添加劑。在一些實(shí)施方式中，食用產(chǎn)品是營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。在一些實(shí)施方式中，食用產(chǎn)品是動(dòng)物飼料。在一些實(shí)施方式中，該動(dòng)物飼料是水產(chǎn)養(yǎng)殖用飼料。在一些實(shí)施方式中，該動(dòng)物飼料是家畜飼料、動(dòng)物園動(dòng)物飼料、役畜飼料、牲畜飼料或其組合。
[0078]本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)含有ω-3脂肪酸的微生物油的方法，該方法包括:在培養(yǎng)物中培養(yǎng)本發(fā)明的任意分離的微生物或其混合物，以生產(chǎn)含有ω-3脂肪酸的油。在一些實(shí)施方式中，該方法還包含提取(extracting)該油。
[0079]本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)含有ω-3脂肪酸的微生物油的方法，該方法包含從本發(fā)明的任意生物質(zhì)中提取含有ω-3脂肪酸的油。在一些實(shí)施方式中，使用有機(jī)溶劑提取過程諸如己烷提取來提取該微生物油。在一些實(shí)施方式中，使用無溶劑提取過程來提取該微生物油。
[0080]本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的微生物油。
[0081]本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)本發(fā)明的生物質(zhì)的方法，其包括:使本發(fā)明的任意分離的微生物或其混合物在培養(yǎng)物中生長(zhǎng)，以生產(chǎn)生物質(zhì)。
[0082]本發(fā)明涉及通過本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的生物質(zhì)。
[0083] 本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)本發(fā)明的突變菌株的方法，其包括:誘變本發(fā)明的任意微生物，并分離該突變菌株。
[0084]本發(fā)明涉及本發(fā)明的任意分離的微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物用于制造治療發(fā)炎或相關(guān)病況的藥劑的用途。
[0085]本發(fā)明涉及本發(fā)明的任意分離的微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物用于治療發(fā)炎或相關(guān)病況的用途。
[0086]本發(fā)明涉及用于治療發(fā)炎或相關(guān)病況的本發(fā)明的任意分離的微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物。 [0087]本發(fā)明涉及在有需要的個(gè)體中用于治療發(fā)炎或相關(guān)病況的方法，其包括:給該個(gè)體施用本發(fā)明的任意分離的微生物、生物質(zhì)或微生物油或其混合物以及藥學(xué)上可接受的載劑。
[0088]本發(fā)明涉及由本發(fā)明的微生物生產(chǎn)微生物油和生物質(zhì)的方法，以及使用微生物、生物質(zhì)和微生物油的方法。
[0089]微生物
[0090]在一些實(shí)施方式中，用于本發(fā)明用途的微生物細(xì)胞是網(wǎng)粘菌門(PhylumLabyrinthulomycota)的微生物。在一些實(shí)施方式中，網(wǎng)粘菌門的微生物細(xì)胞是破囊壺菌，例如裂殖壺菌屬(Schizochytrium)或破囊壺菌屬(Thraustochytrium)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“破囊壺菌”是指破囊壺菌目(Thraustochytriales)的任何成員，其包括破囊壺菌科(Thraustochytriaceae),并且術(shù)語“網(wǎng)粘菌(Iabyrinthulid) ”是指網(wǎng)粘菌目(Labyrinthulales)的任何成員，其包括網(wǎng)粘菌科(Labyrinthulaceae)。
[0091]網(wǎng)粘菌科的成員從前曾被認(rèn)為是破囊壺菌目的成員，但是在最近此類生物體的分類學(xué)歸類的修訂版中，網(wǎng)粘菌科現(xiàn)在被認(rèn)為是網(wǎng)粘菌目的成員。網(wǎng)粘菌目和破囊壺菌目均被認(rèn)為是網(wǎng)粘菌門的成員。分類學(xué)理論現(xiàn)在通常將這兩個(gè)群的微生物與原生藻菌(Stramenopile)譜系中的藻類或藻樣原生生物放在一起。破囊壺菌和網(wǎng)粘菌當(dāng)前的分類學(xué)地位可以歸納如下:
[0092]界:藻菌界(Stramenopila)(管毛生物界(Chromista))
[0093]門:網(wǎng)粘菌門(Labyrinthulomycota)(不等鞭毛門(Heterokonta))
[0094]綱:網(wǎng)粘菌綱(Labyrinthulomycetes)(Labyrinthulae)
[0095]目:網(wǎng)粘菌目(Labyrinthulales)
[0096]科:網(wǎng)粘菌科(Labyrinthulaceae)
[0097]目:破囊壺菌目(Thraustochytriales)
[0098]科:破囊壺菌科(Thraustochytriaceae)
[0099]對(duì)于本發(fā)明的目的而言，描述為破囊壺菌的微生物細(xì)胞的菌株包括如下生物體:目:破囊壺菌目；科:破囊壺菌科；屬:破囊壺菌屬(種:物種，arudimentale、aureum、benthicola、globosum、kinne1、motivum、multirudimentale、pachydermum、proliferum、roseum 和 striatum)，吾肯氏壺菌屬(Ulkenia)(種:物種，amoeboidea、kerguelensis、minuta、 profunda、 radiata、 sailens、 sarkariana、 schizochytrops、 visurgensis、yorkensis 和物種 BP-5601)，裂殖壺菌屬(種:物種，aggregatum、limnaceum、mangrovei>minutum 和 octosporum)，Japonochytrium 屬(種:物種，marinum)，Aplanochytrium 屬(種:物種，haliotidis,kerguelensis,profunda和 stocchinoi) ,Althornia屬(種:物種，crouchii),或Elina屬(種:物種，marisalba和sinorifica)。出于本發(fā)明的目的，吾肯氏壺菌屬內(nèi)描述的物種將被看作是破囊壺菌屬的成員。Aurantiochytrium和Oblongospora在本發(fā)明中是網(wǎng)粘菌門包括的兩個(gè)額外的屬。在一些實(shí)施方式中，微生物細(xì)胞屬于破囊壺菌屬、裂殖壺菌屬及其混合物。
[0100]本發(fā)明涉及分離的微生物及由其所衍生的菌株。由本發(fā)明的分離的微生物所“衍生”的菌株可以為天然衍生或人工衍生，諸如突變株、變異株或重組菌株。本文中使用時(shí)術(shù)語“分離的”并不一定反映分離物已被純化的程度，而是指從天然形式或天然環(huán)境中分離或隔離。分離物可包括但不限于分離的微生物、分離的生物質(zhì)、分離的培養(yǎng)物、分離的微生物油及分離的序列(諸如本文中所公開的分離的多核苷酸序列)。本文中使用時(shí)術(shù)語“微生物”包括但不限于術(shù)語“微型藻”、“破囊壺菌”及與本文中所述的任意保藏微生物相關(guān)聯(lián)的分類學(xué)分類。與本發(fā)明的任意一種微生物(包括本文中所述的保藏微生物)相關(guān)時(shí)所用的術(shù)語“破囊壺菌目” (“Thraustochytriales”)、“破囊壺菌” (“thraustochytrid”)、“裂殖壺菌屬”(“Schizochytrium”)及“破囊壺菌屬”(“Thraustochytrium”)是以包括了可獲得的系譜信息的目前的分類學(xué)分類為基礎(chǔ)的，并且不意圖限制在本申請(qǐng)的申請(qǐng)日之后修訂分類學(xué)分類的事件。
[0101]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏的物種的分離的微生物。與ATCC登錄號(hào)PTA-10212相關(guān)聯(lián)的分離的微生物在本文中也稱為破囊壺菌屬物種(Thraustochytrium sp.)ATCCPTA-10212。與 ATCC 登錄號(hào) PTA-10212 相關(guān)聯(lián)的分離的微生物按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美國(guó)維吉尼亞州 20110-2209 馬納沙斯(Manassas)大學(xué)大道(University Boulevard) 10801 號(hào)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(PatentDepository)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏的一種分離的菌株。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、P TA-10208、PTA-10209、PTA-10210、或 PTA-10211 下所保藏的分離的菌株。
[0102]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏物種的特性的分離的微生物或由其所衍生的菌株。在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏物種的特性可以包括其生長(zhǎng)性質(zhì)與表型性質(zhì)(表型性質(zhì)的實(shí)例包括形態(tài)學(xué)性質(zhì)與繁殖性質(zhì))、其物理性質(zhì)與化學(xué)性質(zhì)(諸如干重與脂質(zhì)分布)、其基因序列及其組合，其中所述特性使這些物種區(qū)別于先前認(rèn)定過的物種。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏物種的特性的分離的微生物，其中所述特性包括:含有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或與SEQ ID NO:1的同一性至少94%、95%、96%、97%、98%或99%的多核苷酸序列的18s rRNA，在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏物種的形態(tài)學(xué)性質(zhì)與繁殖性質(zhì)，以及在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏物種的脂肪酸分布。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的微生物具有與在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏微生物基本相同的表型性質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的微生物具有與在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏微生物基本相同的生長(zhǎng)性質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及分離的微生物，其所包含具有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列或與SEQ IDNO:1的同一性至少94%、95%、96%、97%、98%或99%的多核苷酸序列的18s rRNA。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及分離的微生物，其包含與在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏微生物的18srRNA多核苷酸序列的同一性至少94%的18s rRNA多核苷酸序列。
[0103]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏微生物的一種突變型菌株。在另一些實(shí)施方式中，該突變型菌株是在ATCC登錄號(hào)PTA-10213、PTA-10214或PTA-10215下所保藏的菌株。與ATCC登錄號(hào)PTA-10213、PTA-10214及PTA-10215相關(guān)聯(lián)的微生物是按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美國(guó)維吉尼亞州 20110-2209 馬納沙斯(Manassas)大學(xué)大道(University Boulevard) 10801 號(hào)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(PatentDepository)。
[0104]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏物種的分離的微生物。與ATCC登錄號(hào)PTA-10208相關(guān)聯(lián)的分離的微生物在本文中也稱為裂殖壺菌屬(Schizochytrium sp) ATCCPTA-10208。與 ATCC 登錄號(hào) PTA-10208 相關(guān)聯(lián)的微生物是按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年7月14日保藏于美國(guó)維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學(xué)大道(University Boulevard) 10801號(hào)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(Patent Depository)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏的分離的菌株。
[0105]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏物種的分離的微生物，其中該微生物所產(chǎn)生的總脂肪酸包含超過約10重量％、超過約11重量％、超過約12重量％、超過約13重量％、超過約14重量％、超過約15重量％、超過約16重量％、超過約17重量％、超過約18重量％、超過約19重量％或超過約20重量％的EPA。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏物種的一種分離的微生物，其中該微生物所產(chǎn)生的總脂肪酸包含約10重量％至約55重量％、約10重量％至約50重量％、約10重量％至約45重量 ％、約10重量％至約40重量％、約10重量％至約35重量％、約10重量％至約30重量％、約15重量％至約55重量％、約15重量％至約50重量％、約15重量％至約45重量％、約15重量％至約40重量％、約15重量％至約35重量％、約15重量％至約30重量％、約20重量％至約55重量％、約20重量％至約50重量％、約20重量％至約45重量％、約20重量％至約40重量％、約20重量％至約35重量％或約20重量％至約30重量％的EPA。
[0106]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏物種的特性的分離的微生物，其中該微生物所產(chǎn)生的總脂肪酸包含超過約10重量％的二十碳五烯酸。在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏微生物的特性包括其生長(zhǎng)性質(zhì)與表型性質(zhì)(表型性質(zhì)的實(shí)例包括形態(tài)學(xué)性質(zhì)與繁殖性質(zhì))、其物理性質(zhì)與化學(xué)性質(zhì)(諸如干重與脂質(zhì)分布)、其基因序列及其組合，其中所述特性可區(qū)別該物種與先前鑒定的物種。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏物種的特性的分離的微生物，其中該特性包括含有SEQ ID NO:2的多核苷酸序列的18s rRNA、在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏物種的形態(tài)學(xué)性質(zhì)與繁殖性質(zhì)、以及在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏物種的脂肪酸分布。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的微生物所具有的物理性質(zhì)與化學(xué)性質(zhì)與在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏的微生物基本相同。
[0107]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下所保藏微生物的突變型菌株。在另一些實(shí)施方式中，該突變型菌株是在ATCC登錄號(hào)PTA-10209、PTA-10210或PTA-10211下所保藏的菌株。與ATCC登錄號(hào)PTA-10209、PTA-10210及PTA-10211相關(guān)聯(lián)的微生物是按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年9月25日保藏于美國(guó)維吉尼亞州 20110-2209 馬納沙斯(Manassas)大學(xué)大道(University Boulevard) 10801 號(hào)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(PatentDepository)。
[0108]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生甘油三酯部分的本發(fā)明的分離的微生物，其中該甘油三酯部分的EPA含量是至少約12重量％、至少約13重量％、至少約14重量％、至少約15重量％、至少約16重量％、至少約17重量％、至少約18重量％、至少約19重量％或至少約20重量％。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)甘油三酯部分的分離的微生物，其中該甘油三酯部分的EPA含量是約12重量％至約55重量％、約12重量％至約50重量％、約12重量％至約45重量％、約12重量％至約40重量％、約12重量％至約35重量％、約12重量％至約30重量％、約15重量％至約45重量％、約15重量％至約40重量％、約15重量％至約35重量％、約15重量％至約30重量％或約20重量％至約30重量％。
[0109]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生甘油三酯部分的本發(fā)明的分離的微生物的突變株、變異株或重組株，其中該甘油三酯部分的EPA含量是至少約10重量％、至少約11重量％、至少約12重量％、至少約13重量％、至少約14重量％、至少約15重量％、至少約16重量％、至少約17重量％、至少約18重量％、至少約19重量％或至少約20重量％。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及產(chǎn)生甘油三酯部分的本發(fā)明的分離的微生物的突變株、變異株或重組株，其中該甘油三酯部分的EPA含量是約12重量％至約55重量％、約12重量％至約50重量％、約12重量％至約45重量％、約12重量％至約40重量％、約12重量％至約35重量％、約12重量％至約30重量％、約15重量％至約55重量％、約15重量％至約50重量％、約15重量％至約45重量％、約15重量％至約40重量％、約15重量％至約35重量％、約15重量％至約30重量％、約20重量％至約55重量％、約20重量％至約50重量％、約20重量％至約45重量％、約20重量％至約40重量％、約20重量％至約35重量％或約20重量％至約30重量％。可通過公知的程序來產(chǎn)生突變型菌株。常用的程序包括輻射、高溫處理及以誘突變劑處理。變異型菌株可以是本文中所述物種的其它天然存在的分離株和/或亞分離株?？赏ㄟ^分子生物學(xué)中用于表達(dá)外源基因或改變內(nèi)源基因的功能或表達(dá)的任何公知的方法來產(chǎn)生重組型菌株。在一些實(shí)施方式中，突變株、變異株或重組型菌株比野生型菌株生產(chǎn)更高量的ω-3脂肪酸、尤其是EPA。在一些實(shí)施方式中，突變株、變異株或重組型菌株生產(chǎn)較低量的一種或多種脂肪酸，諸如較低量的DHA、ARA, DPA n-6或其組合。在一些實(shí)施方式中，突變株、變異株或重組型菌株比野生型菌株產(chǎn)生每升培養(yǎng)物中更大的細(xì)胞干重。這種突變株、變異株或重組型菌株是由本發(fā)明的分離的微生物所衍生的菌株的實(shí)例。
[0110]本發(fā)明還涉及具有在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下所保藏的破囊壺菌物種的特性的分離的破囊壺菌微生物，其中所述微生物或由其衍生的菌株所產(chǎn)生的總脂肪酸包含約10重量％或更少的二十碳五烯酸。
[0111]本發(fā)明還涉及分離的破囊壺菌微生物或由其衍生的菌株，其包含甘油三酯部分，其中甘油三酯部分的二十二碳六烯酸含量為至少約40重量％，其中甘油三酯部分的二十二碳五烯酸n-6含量為至少約0.5重量％至約6重量％，并且其中所述微生物或由其衍生的菌株所產(chǎn)生的總脂肪酸包含約10重量％或更少的二十碳五烯酸。
[0112]本發(fā)明還涉及具有與在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下所保藏的破囊壺菌或由其衍生的菌株相同的物種的分離的破囊壺菌微生物，其中所述微生物或由其衍生的菌株所產(chǎn)生的總脂肪酸包含約10重量％或更少的二十碳五烯酸。
[0113]在一些實(shí)施方式中，由本發(fā)明的分離的破囊壺菌微生物所衍生的菌株是突變型菌株。
[0114]本發(fā)明還涉及在ATCC 登錄號(hào) PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697 或 PTA-9698 下所保藏的分離的微生物。
[0115]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的任意一種破囊壺菌微生物或其混合物的破囊壺菌生物質(zhì)。
[0116]本發(fā)明還涉及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中至少約50重量％細(xì)胞干重的生物質(zhì)是脂肪酸，并且其中至少約50重量％的脂肪酸是ω-3脂肪酸。在一些實(shí)施方式中，至少約50重量％的脂肪酸是二十二碳六烯酸。本發(fā)明還涉及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中至少約25重量％細(xì)胞干重的生物質(zhì)是二十二碳六烯酸。
[0117]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中約10重量％或更少的脂肪酸是二十碳五烯酸，并且其中二十二碳六烯酸與二十碳五烯酸的重量比為至少約
5: 10
[0118]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其中約1.5重量％或更少的脂肪酸是二十碳四烯酸，并且其中二十二碳六烯酸與二十碳四烯酸的重量比為至少約 20: I。
[0119]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及分離的破囊壺菌生物質(zhì)，其以至少約10: I的重量比包含二十二碳六烯酸和二十二碳五烯酸η-6。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)ΡΤΑ-9695下所保藏物種的破囊壺菌。本文中分離的破囊壺菌也稱為裂殖壺菌屬(Schizochytrium sp)ATCC PTA-9695?與ATCC登錄號(hào)PTA-9695相關(guān)聯(lián)的破囊壺菌按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)下于2009年I月7日保藏于美國(guó)維吉尼亞州20110-2209馬納沙斯(Manassas)大學(xué)大道(University Boulevard) 10801號(hào)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(Patent Depository) ?
[0120]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下保藏的分離的破囊壺菌菌株。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及與在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下保藏的破囊壺菌相同物種的分離的破囊壺菌微生物。
[0121 ] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及具有在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下保藏的物種或由其衍生的菌株的特性的分離的破囊壺菌。在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下保藏的破囊壺菌物種的特性包括其生長(zhǎng)性質(zhì)與表型性質(zhì)(表型性質(zhì)的實(shí)例包括形態(tài)學(xué)性質(zhì)與繁殖性質(zhì))、其物理性質(zhì)與化學(xué)性質(zhì)(諸如干重與脂質(zhì)分布)及其基因序列。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的破囊壺菌具有基本上 與在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下保藏的破囊壺菌的相同的表型性質(zhì)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的破囊壺菌具有基本上與在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下保藏的破囊壺菌的相同的生長(zhǎng)性質(zhì)。
[0122] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的分離的破囊壺菌的突變株、變異株或重組株，其中突變株、變異株或重組株所產(chǎn)生的總脂肪酸包含約10重量％或更少的二十碳五烯酸?？梢酝ㄟ^公知的程序來產(chǎn)生突變型菌株。常用的程序包括輻射、高溫處理及以誘突變劑處理。變異型菌株可以是本文中所述物種的其它天然存在的分離株和/或亞分離株。可以通過分子生物學(xué)中用于表達(dá)外源基因或改變內(nèi)源基因的功能或表達(dá)的任何公知的方法來產(chǎn)生重組型菌株。在一些實(shí)施方式中，突變株、變異株或重組型菌株比野生型菌株生產(chǎn)更高量的ω-3脂肪酸(包括DHA和/或EPA)。在一些實(shí)施方式中，突變株、變異株或重組型菌株生產(chǎn)較低量的一種或多種脂肪酸，諸如較低量的EPA、ARA, DPA n-6或其組合。在一些實(shí)施方式中，突變株、變異株或重組型菌株比野生型菌株產(chǎn)生以每升培養(yǎng)物計(jì)更大的細(xì)胞干重。這種突變株、變異株或重組型菌株是由本發(fā)明的分離的破囊壺菌所衍生的菌株的實(shí)例。
[0123]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下保藏的破囊壺菌的突變型菌株。在另一些實(shí)施方式中，突變型菌株是在ATCC登錄號(hào)PTA-9696、PTA-9697或PTA-9698下保藏的菌株。與ATCC登錄號(hào)PTA-9696、PTA-9697或PTA-9698相關(guān)聯(lián)的破囊壺菌菌株是按照布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于2009年I月7日保藏于美國(guó)維吉尼亞州 20110-2209 馬納沙斯(Manassas)大學(xué)大道(University Boulevard) 10801 號(hào)的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)的專利保藏庫(PatentDepository)。這些保藏的突變型菌株是在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下保藏的破囊壺菌的衍生物。
[0124]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的破囊壺菌(包括其突變株、變異株或重組株)在由破囊壺菌分離的一個(gè)或多個(gè)部分中包含脂肪酸。由破囊壺菌分離的一個(gè)或多個(gè)部分包括總脂肪酸部分、固醇酯部分、甘油三酯部分、游離脂肪酸部分、固醇部分、甘油二酯部分、極性部分(包括磷脂部分)以及它們的組合。
[0125]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的任意破囊壺菌微生物或其混合物的分離的破囊壺菌培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方 式中，培養(yǎng)物包含至少約5%的溶解氧。
[0126]本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的任意一種破囊壺菌微生物或生物質(zhì)或者其混合物的動(dòng)物或人類用的食用產(chǎn)品、化妝品或藥物組合物。
[0127]本發(fā)明還涉及包含至少約70重量％的甘油三酯部分的微生物油，其中甘油三酯部分的二十二碳六烯酸含量為至少約50重量％，并且其中甘油三酯部分的二十二碳五烯酸n-6含量為約0.5重量％至約6重量％。在一些實(shí)施方式中，微生物油還包含約1.5重量％或更少的甘油三酯部分的二十碳四烯酸含量。
[0128]本發(fā)明還涉及包含至少約70重量％的甘油三酯部分的微生物油，其中甘油三酯部分的二十二碳六烯酸含量為至少約40重量％，并且其中甘油三酯部分的二十二碳五烯酸n-6含量為至少約0.5重量％至約6重量％，并且其中二十二碳六烯酸與二十二碳五烯酸n-6的比例大于約6: I。
[0129]本發(fā)明還涉及包含至少約70重量％的甘油三酯部分的微生物油，其中甘油三酯部分的二十二碳六烯酸含量為至少約60重量％。
[0130]在一些實(shí)施方式中，在微生物油的甘油三酯部分中至少約20%的甘油三酯在甘油三酯中選自sn-1、sn-2和sn_3位置的任意二者的二個(gè)位置上含有二十二碳六烯酸。在一些實(shí)施方式中，在微生物油的甘油三酯部分中至少約5%的甘油三酯在甘油三酯中的所有sn_l、sn-2和sn_3三個(gè)位置上均含有二十二碳六烯酸。[0131]在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的分離的微生物(包括其突變株、變異株或重組株)在由該微生物所分離的一個(gè)或多個(gè)部分中包含脂肪酸分布。由該微生物所分離的一個(gè)或多個(gè)部分包括總脂肪酸部分、固醇酯部分、甘油三酯部分、游離脂肪酸部分、固醇部分、甘油二酯部分、極性部分(包括磷脂部分)及其組合。特定部分的脂肪酸分布可以包括與本文中所公開的該特定部分相關(guān)聯(lián)的任意脂肪酸分布。
[0132]本發(fā)明涉及生產(chǎn)突變株的方法，其包括誘變本發(fā)明的任意一種微生物并分離突變型菌株。
[0133]培養(yǎng)物與分離的生物質(zhì)
[0134]本發(fā)明涉及培養(yǎng)物，其包含本發(fā)明的一種或多種分離的微生物。用于接種、生長(zhǎng)及回收微生物區(qū)系(諸如微型藻與破囊壺菌)的各種發(fā)酵參數(shù)在本領(lǐng)域中是已知。參見第5130242號(hào)美國(guó)專利，其通過引用全部并入本文。液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基可以含有天然海水或人造海水。供異養(yǎng)型生長(zhǎng)的碳源包括但不限于葡萄糖、果糖、木糖、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉、糖蜜、海藻糖、葡萄糖胺、葡聚糖、脂肪類、油類、甘油、乙酸鈉和甘露糖醇。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母提取物、聚蛋白胨、麥芽提取物、肉提取物、酪蛋白胺基酸、玉米浸液、有機(jī)氮源、谷氨酸鈉、尿素、無機(jī)氮源、乙酸銨、硫酸銨、氯化銨及硝酸銨。
[0135]用于在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下所保藏微生物生長(zhǎng)的典型的培養(yǎng)基示于表1中:
[0136] 表1:PTA-10212容器培養(yǎng)基
[0137]
【權(quán)利要求】
1.制備具有脂肪酸和一定濃度EPA的微生物的生物質(zhì)的方法，其包含: (a)在發(fā)酵罐容器中發(fā)酵所述微生物，以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中所述微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；和 (b)調(diào)節(jié)容器中生物質(zhì)的量，以在生物質(zhì)中獲得所期望的EPA水平。
2.制備具有脂肪酸和一定濃度EPA的微生物的生物質(zhì)的方法，其包含: (a)在發(fā)酵罐容器中發(fā)酵所述微生物，以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中所述微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；和 (b)調(diào)節(jié)所述生物質(zhì)上壓強(qiáng)，以在生物質(zhì)中獲得所期望的EPA水平。
3.制備具有脂肪酸和一定濃度EPA的微生物的生物質(zhì)的方法，其包含: (a)在發(fā)酵罐容器中發(fā)酵所述微生物，以產(chǎn)生發(fā)酵液和生物質(zhì)，其中所述微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；和 (b)調(diào)節(jié)所述發(fā)酵液中溫度，以在生物質(zhì)中獲得所期望的EPA水平。
4.制備具有脂肪酸和一定濃度EPA的微生物的生物質(zhì)的方法，其包含: (a)在含有氣體的發(fā)酵罐容器中發(fā)酵所述微生物，以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中所述微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；和 (b)調(diào)節(jié)所述氣體中CO2水平，以在生物質(zhì)中獲得所期望的EPA水平。
5.制備具有脂肪酸和一定濃度EPA的微生物的生物質(zhì)的方法，其包含: (a)在發(fā)酵罐容器中發(fā)酵所述微生物，以產(chǎn)生具有水相的發(fā)酵液和生物質(zhì)，其中所述水相具有溶解的氣體，其中所述微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌；和 (b)調(diào)節(jié)所述溶解的氣體中的溶解CO2至>2%。
6.如權(quán)利要求1和3-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其還包含調(diào)節(jié)所述生物質(zhì)上壓強(qiáng)，以在生物質(zhì)中獲得所期望的EPA水平。
7.如權(quán)利要求1、2和4-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其還包含調(diào)節(jié)所述發(fā)酵液中溫度，以在生物質(zhì)中獲得所期望的EPA水平。
8.在具有脂肪酸和一定濃度的EPA的微生物的生物質(zhì)中增加EPA濃度的方法，其包含: (a)在含有氣體的發(fā)酵罐容器中發(fā)酵所述微生物，以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中所述微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌； (b)以足以提高生物質(zhì)中EPA濃度的CO2補(bǔ)充所述氣體。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中CO2的量大于或等于腔室中氣體的2%(摩爾)，并且所述生物質(zhì)中EPA濃度增加至大于脂肪酸總重量的約4重量％。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其中CO2的量大于或等于腔室中氣體的約5%到至多約20% (摩爾)。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中CO2的量大于或等于容器中氣體的約5%到至多約15% (摩爾)。
12.如權(quán)利要求9所述的方法，其中EPA濃度從大于脂肪酸總重量的約4重量％增加到至多約45重量％。
13.如權(quán)利要求11所述的方法，其中EPA濃度從大于脂肪酸總重量的約4重量％增加到至多約40重量％。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中EPA濃度從脂肪酸總重量的約4重量％增加到脂肪酸總重量的約6重量％至約30重量％的范圍。
15.如權(quán)利要求9所述的方法，其中EPA濃度從脂肪酸總重量的約15重量％增加到脂肪酸總重量的至多約40重量％。
16.如權(quán)利要求9所述的方法，其中EPA濃度增加到大于脂肪酸總重量的20重量％。
17.如權(quán)利要求9所述的方法，其中EPA濃度從脂肪酸總重量的約20重量％增加到至多約25重量％。
18.在具有脂肪酸和一定濃度的EPA的微生物的生物質(zhì)中增加EPA濃度的方法，其包含: (a)在發(fā)酵罐容器中發(fā)酵所述微生物，以產(chǎn)生生物質(zhì)； (b)在所述生物質(zhì)上提供大于或等于大氣壓強(qiáng)以上0.5psi的壓強(qiáng)，提供的時(shí)間足以增加所述生物中EPA的濃度。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述容器具有從約0.4psi到至多約30psi的頂空 壓強(qiáng)。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述容器具有從約Ipsi到至多約30psi的頂空壓強(qiáng)。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述容器具有從約Ipsi到至多約20psi的頂空壓強(qiáng)。
22.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述壓強(qiáng)的提供時(shí)間至多約120小時(shí)。
23.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述生物質(zhì)具有大于或等于10g/l的密度。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述生物質(zhì)具有約10g/l到至多約250g/l的密度。
25.如權(quán)利要求3所述的方法，其中將所述溫度被調(diào)節(jié)至小于約30°C。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中所述溫度小于約22°C。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述溫度為約21°C。
28.如權(quán)利要求1至27中任意一項(xiàng)所述的方法制得的生物質(zhì)。
29.由權(quán)利要求28所述的生物質(zhì)提取到的油，其中所述生物質(zhì)由在ATCC登錄號(hào)PTA-10208下保藏的分離的微生物產(chǎn)生，其中所述油包含脂肪酸，其中所述脂肪酸還包含ω-3多不飽和脂肪酸，其中所述ω-3多不飽和脂肪酸以所述ω-3多不飽和脂肪酸總量的大約≤90重量％的量包含DHA和ΕΡΑ，并且EPA的量為EPA和DHA總量的約6重量％到至多約65重量％。
30.如權(quán)利要求29所述的油，其中EPA的量為EPA和DHA總量的約6重量％到至多約.28重量％。
31.如權(quán)利要求29所述的油，其中EPA的量為EPA和DHA總量的約36重量％到至多約65重量％。
32.如權(quán)利要求29所述的油，其中EPA的量為EPA和DHA總量的約28重量％到至多約.36重量％。
33.由權(quán)利要求28所述的生物質(zhì)提取到的油，其中所述生物質(zhì)由在ATCC登錄號(hào)PTA-10212下保藏的分離的微生物產(chǎn)生，其中所述油包含脂肪酸，其中所述脂肪酸還包含DHA和EPA，并且EPA的量為EPA和DHA總量的約15重量％到至多約70重量％。
34.由權(quán)利要求28所述的生物質(zhì)提取到的油，其中所述生物質(zhì)由在ATCC登錄號(hào)PTA-9695下保藏的分離的微生物產(chǎn)生，其中所述油包含脂肪酸，其中所述脂肪酸還包含ω-3多不飽和脂肪酸，其中所述ω-3多不飽和脂肪酸以所述ω-3多不飽和脂肪酸總量的約50至70重量％的量包含DHA和ΕΡΑ，并且EPA的量為EPA和DHA總量的約5重量％到至多約60重量％。
35.如權(quán)利要求34所述的油，其中所述DHA和EPA的量為所述ω-3脂肪酸總量的約.60重量％。
36.制備具有脂肪酸和一定濃度EPA的微生物的生物質(zhì)的方法，其包含: (a)在含有氣體的 發(fā)酵罐容器中發(fā)酵所述微生物，以產(chǎn)生生物質(zhì)，其中所述微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌，其中所述微生物包含產(chǎn)生具有脂肪酸總重量的至少3% EPA的生物質(zhì)的破囊壺菌； (b)用CO2補(bǔ)充所述氣體。
37.如權(quán)利要求2所述的方法，其中在調(diào)節(jié)所述生物質(zhì)上壓強(qiáng)之前測(cè)定所述生物質(zhì)、EPA或DHA的量。
38.如權(quán)利要求3所述的方法，其中在調(diào)節(jié)所述發(fā)酵液中溫度之前測(cè)定所述生物質(zhì)、EPA或DHA的量。
39.如權(quán)利要求4所述的方法，其中在調(diào)節(jié)容器中CO2之前測(cè)定所述生物質(zhì)、EPA或DHA的量。
40.如權(quán)利要求5所述的方法，其中在調(diào)節(jié)溶解的CO2之前測(cè)定所述生物質(zhì)、EPA或DHA的量。
41.生產(chǎn)油的方法，所述方法包含制備如權(quán)利要求1-27和36-40中任意一項(xiàng)所述的生物質(zhì),并且從所述生物質(zhì)中獲得油。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述油從所述生物質(zhì)中提取得到。
43.制備微生物的生物質(zhì)的方法，所述微生物具有增加的濃度的EPA，所述方法包含使所述微生物在含有小于0.lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以產(chǎn)生生物質(zhì)。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含小于0.0 lmg/L維生素B12。
45.如權(quán)利要求44所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含小于0.00lmg/L維生素B12。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含小于0.000lmg/L維生素B12。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述培養(yǎng)基不包含維生素B12。
48.如權(quán)利要求43至47中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于Ig的酵母提取物。
49.如權(quán)利要求43至48中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.5g的酵母提取物。
50.如權(quán)利要求43至49中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包含以每50g的無脂生物質(zhì)計(jì)小于0.1g的酵母提取物。
51.如權(quán)利要求43至50中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述EPA濃度與由含有大于.0.lmg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度相比，增加了至少400%。
52.如權(quán)利要求44至50中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述EPA濃度與由含有大于0.01mg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物得到的生物質(zhì)中EPA濃度相比，增加了至少300%。
53.如權(quán)利要求45至50中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述EPA濃度與由含有大于0.001mg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物得到的生物質(zhì)中EPA濃度相比，增加了至少200%。
54.如權(quán)利要求46至50中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述EPA濃度與由含有大于0.0001mg/L維生素B12的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的微生物所得到的生物質(zhì)中EPA濃度相比，增加了至少100%。
55.制備具有升高濃度的EPA的微生物的生物質(zhì)的方法，其包含使所述微生物在含有小于0.lmg/L鈷的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，以產(chǎn)生生物質(zhì)。
56.如權(quán)利要求55所述的方法,其中所述培養(yǎng)基包含小于0.0 lmg/L的鈷。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含小于0.00lmg/L的鈷。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包含小于0.000lmg/L的鈷。
59.如權(quán)利要求58所述的方法，其中所述培養(yǎng)基不含鈷。
60.如權(quán)利要求43至59中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物是破囊壺菌。
61.如權(quán)利要求43至60中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述微生物產(chǎn)生所述脂肪酸總重量的至少3% EPA。
62.如權(quán)利要求43至61中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基具有至少5%的溶解CO2水平。
63.如權(quán)利要求43至62中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基具有至少10%的溶解CO2水平。
64.如權(quán)利要求43至63中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述培養(yǎng)基具有至少15%的溶解CO2水平。
65.如權(quán)利要求43至64中任意一項(xiàng)所述的分離的生物質(zhì)。
66.由如如權(quán)利要求43至65中任意一項(xiàng)所述的分離的生物質(zhì)提取到的微生物油。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK104011217SQ201280035935
【公開日】2014年8月27日 申請(qǐng)日期:2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月21日
【發(fā)明者】約瑟夫·W·普菲弗三世, 喬恩·米爾頓·漢森, 約瑟·R·加西亞, 董曉, 保羅·沃倫·伯赫恩斯, 柯克·E·阿普特 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司