用于通過添加交替電子受體改善微生物中的產品收率和產量的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了減少或消除甘油產生并且增加產物形成的新型代謝途徑。更具體地，本發(fā)明提供了重組微生物，所述微生物包含一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶以及在一個或多個工程化代謝途徑中用于將碳水化合物源例如木質纖維素轉化成產物例如乙醇的一種或多種天然和/或異源酶，其中所述一種或多種天然和/或異源酶被激活、上調或下調。本發(fā)明還提供了重組微生物，所述微生物包含一種或多種用于調節(jié)甘油合成的異源酶和/或用于在一個或多個工程化代謝途徑中用于將碳水化合物源轉化成乙醇的一種或多種天然和/或異源酶，其中所述一種或多種天然和/或異源酶被激活、上調或下調。
【專利說明】用于通過添加交替電子受體改善微生物中的產品收率和產
量的方法
[0001]發(fā)明背景
[0002]生物質例如玉米、甘蔗或其它能源作物以及單糖至乙醇的轉化是通過使用酵母發(fā)酵常規(guī)完成的。然而，在酵母代謝過程中，發(fā)酵的主要副產品是甘油。甘油在厭氧生長過程中形成，作為酵母平衡其氧化還原狀態(tài)和再生在糖酵解過程中用作輔因子的NAD+的方式。已顯示甘油的功能不可能作為代謝物本身而是作為電子冷阱(electron sink)，捕獲電子，從而允許進一步的生長關聯(lián)代謝繼續(xù)進行。由于甘油是低價值副產品，因此其可以是不期望的發(fā)酵副產品。減少或消除該副產品和進一步將更多的碳導向期望的終產物例如乙醇將是有益的。
[0003]在本領域有幾個策略，通過生物化學或其它方法將甘油轉化成更高價值的產物，但對于除去或減少甘油并且提高至乙醇或其它期望的代謝終產物的總的產糖率而言，實例甚少。通過工程化替代途徑，潛在地同時減少或缺失甘油途徑，可在酵母代謝過程中使用用于再生NAD+的交替或替代電子受體。這樣的交替或替代電子受體可以是分子例如甲酸或氫。
[0004]甘油合成基因的消除已被證明，但該途徑的去除完全完全阻斷了酵母的厭氧生長，在工業(yè)過程中阻止了有用的應用。Ansell，R.，等人，EMBO J.16:2179-87 (1997)；Pahlman, A-K.，等人，J.Biol.Chem.276: 3555-63 (2001) ;Guo, ZP.，等人，Metab.Eng.13:49-59(2011)。繞過甘油發(fā)酵的其它方法需要共利用另外的碳源例如木糖或乙酸來用作電子受體。Liden, G.,等人，Appl.Env.Microbiol.62:3894-96 (1996) ；Medina, V.G.,等人，Appl.Env.Microbiol.76:190-195 (2010)。通過包含甲酸途徑作為交替電子受體，可繞過甘油形成并且可增加乙醇產率。已對來自大腸桿菌(E.coli)的丙酮酸甲酸裂解酶(其能夠將丙酮酸轉化成甲酸)進行工程化來增加甲酸產量。Waks，Z.和Silver，P.A.，Appl.Env.Microbiol.75:1867-1875(2009)。在 Waks 和 Silver 中進行了甲酸工程化，以在釀酒酵母中提供甲酸來源，以通過第二微生物大腸桿菌產生氫。Waks和Silver未將甲酸產生與甘油形成的除去組合，并且甲酸用作用于甘油還原的交替電子受體的用途未被提出或評價。因此，盡管先前做了繞過和/或消除甘油產生的努力，但仍然存在對細胞中交替或替代電子受體的工程化以將更多的碳導向期望的終產物例如乙醇的需要。
[0005]工程化交替或或替代電子受體的重要性在玉米糖化醪發(fā)酵的過程中得到舉例說明。每年產生約160億加侖的基于玉米的乙醇，因此即使乙醇產率的少量增加例如5-10%，亦可轉化成高于當前產量額外10億左右加侖的乙醇。從玉米糖化醪產生乙醇通常導致范圍在10_12g/L內的甘油產率。參見Yang, R.D.，等人，"Pilot plant studies ofethanol production from whole ground corn,corn flour, and starch, 〃Fuel AlcoholU.S.A.,FebruarylS-16, 1982 (報導的甘油水平高至7.2%w/w的正常玉米糖化醪發(fā)酵中消耗的初始糖，或在使用20%的糖的情況下約1.4g/100mL)。通過在從玉米產生乙醇中減少或消除甘油產率以及再工程化 代謝過程，可獲得增加的乙醇產率?？稍趶挠衩桩a生乙醇中獲得額外的益處。玉米糖化醪是富含營養(yǎng)物的培養(yǎng)基，在一些情況下，包含可超過3%的總發(fā)酵體積的脂質和蛋白質含量。作為這些組分中包含的能量的結果，甚至可獲得比使用例如純糖預期的更高的乙醇產率。額外的增加可來自玉米糖化醪培養(yǎng)基中的脂質或氨基酸的代謝。本發(fā)明的重組細胞和方法使得能夠通過減少或消除甘油而從生物質發(fā)酵增加乙醇產率。
[0006]發(fā)明概述
[0007]本發(fā)明總地來說涉及宿主細胞中的甘油產生的減少或去除以及用于再生NAD+的替代電子受體的工程化。
[0008]本發(fā)明的一個方面涉及重組微生物，所述微生物包含:一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失；和在一個或多個工程化代謝途徑中用于將碳水化合物源轉化成乙醇的一種或多種天然和/或異源酶，其中所述一種或多種天然和/或異源酶被激活、上調或下調。在一些實施方案中，重組微生物產生比不具有所述一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的對照更少的甘油。在一些實施方案中，糖源是生物質。在一些實施方案中，生物質包括選自如下物質的木質纖維素材料:草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、混合草原禾草、芒草、糖加工殘渣、甘蔗渣、甘蔗桿、農業(yè)廢物、稻桿、稻殼、大麥桿、玉米穗軸、谷類桿、小麥桿、蕓苔桿、燕麥桿、燕麥殼、玉米纖維、稻桿、大豆稻桿、玉米秸桿、林業(yè)廢物、再循環(huán)木漿纖維、紙污泥、鋸屑、硬木、軟木、龍舌蘭及其組合。在一些實施方案中，生物質是玉米是玉米糖化醪或或玉米淀粉。
[0009]在具體方面，一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸、gpd2多核苷酸或gpdl多核苷酸和gpd2多核 苷酸編碼。在某些實施方案中，重組微生物還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸。在其它方面，一種或多種用于產生甘油的天然酶由gppl多核苷酸、gpp2多核苷酸或gppl多核苷酸和gpp2多核苷酸編碼。
[0010]在具體的方面，一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼。
[0011]在其它方面，工程化代謝途徑包含丙酮酸至乙酰-C0A和甲酸的轉化。在某些實施方案中，丙酮酸通過丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)轉化成乙酰-CoA和甲酸。在一些實施方案中，PFL具有原核生物或真核生物來源。在一些實施方案中，PFL是雙歧桿菌屬，埃希氏菌屬、好熱厭氧桿菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、衣藻屬、單鞭毛菌屬、新麗鞭毛菌屬或芽孢桿菌屬的一種或多種。在一些實施方案中，PFL來自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、青春雙岐桿菌(Bifidobacterium adolescentis)、角軍纖維素梭菌(Clostridium cellulolyticum)、大腸桿菌(Escherichia coli)、萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)PflA、單鞭毛菌屬 E2或新麗鞭毛菌(Neocallimastix frontalis)的一種或多種。在一個實施方案中，PFL來自青春雙岐桿菌。
[0012]在另外的方面，工程化代謝途徑包括乙酰-CoA至乙醇的轉化。在某些實施方案中，乙酰-CoA通過乙醛脫氫酶轉化成乙醛，乙醛通過醇脫氫酶轉化成乙醇。在某些實施方案中，乙酰-CoA通過雙功能乙醛/醇脫氫酶轉化成乙醇。在一些實施方案中，乙醛脫氫酶、醇脫氫酶或雙功能乙醛/醇脫氫酶具有原核或真核生物來源。在一些實施方案中，乙醛脫氫酶來自C.phytofermentans。在一些實施方案中，雙功能乙醒/醇脫氫酶來自埃希氏菌屬、梭菌屬、衣藻屬、單鞭毛菌屬或雙歧桿菌屬。在一些實施方案中，雙功能乙醛/醇脫氫酶來自大腸桿菌、Clostridium phytofermentans、萊茵衣藻、單鞭毛菌屬E2或青春雙岐桿菌。在一個實施方案中，雙功能乙醛/醇脫氫酶來自青春雙岐桿菌或單鞭毛菌屬E2。
[0013]在其它方面，重組微生物包含一種或多種由fdhl多核苷酸、fdh2多核苷酸或fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
[0014]在某些實施方案中，重組微生物的碳水化合物源是木質纖維素。在某些實施方案中，重組微生物產生乙醇。在某些實施方案中，重組微生物產生甲酸。
[0015]在某些實施方案中，重組微生物選自釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、馬克思克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、解脂耶羅維亞酵母、多形漢森酵母、紅發(fā)夫酵母、實用假絲酵母、Arxula adeninivorans、樹干畢赤酵母、漢遜德巴利酵母、多型德巴利酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和西方許旺酵母。在一個實施方案中，重組微生物是釀酒酵母。
[0016]在某些實施方案中，重組微生物包含一種或多種由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼的用于產生甘油的天然酶，包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化的工程化代謝途徑和包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化的工程化代謝途徑，并且重組微生物還包含一種或多種由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
[0017]在某些實施方案中，重組微生物包含一種或多種由gppl多核苷酸和gpp2多核苷酸編碼的用于產生甘油的天然酶，包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化的工程化代謝途徑。在其它實施方案中，重組微生物的一個工程化代謝途徑通過雙功能乙醛/醇脫氫酶 將乙酰-CoA轉化成乙醇，并且重組微生物還包括一種或多種由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
[0018]在某些實施方案中，重組微生物包含一種或多種由fpsl多核苷酸編碼的用于調節(jié)甘油合成的天然酶，包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化的工程化代謝途徑。在其它實施方案中，重組微生物的一個工程化代謝途徑通過雙功能乙醛/醇脫氫酶將乙酰-CoA轉化成乙醇，并且重組微生物還包括一種或多種由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
[0019]在某些實施方案中，重組微生物包含由一種或多種由fpsl多核苷酸編碼的用于調節(jié)甘油合成的天然酶以及一種或多種由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼的用于產生甘油的天然酶，和包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化的工程化代謝途徑以及包含通雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-Cok至乙醇的轉化的工程化代謝途徑，并且重組微生物還包含一種或多種由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
[0020]在某些實施方案中，重組微生物包含一種或多種由fpsl多核苷酸編碼的用于調節(jié)甘油合成的天然酶，包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化的工程化代謝途徑，和包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化的工程化代謝途徑，并且重組微生物還包含一種或多種由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
[0021]在某些實施方案中，重組微生物包含一種或多種由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼的產生甘油的天然酶，包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化的工程化代謝途徑以及包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化的工程化代謝途徑，并且重組微生物還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸。
[0022]在某些實施方案中，重組微生物包含一種或多種由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼的用于產生甘油的天然酶，以及包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化的工程化代謝途徑和包含通雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化的工程化代謝途徑，還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸以及一種或多種由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
[0023]在某些實施方案中，重組微生物包含一種或多種由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼的用于產生甘油的天然酶和一種或多種由fpsl多核苷酸編碼的用于調節(jié)甘油合成的天然酶，以及包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化的工程化代謝途徑和包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化的工程化代謝途徑，還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸。
[0024]在某些實施方案中，重組微生物包含一種或多種由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼的用于產生甘油的天然酶和一種或多種由fpsl多核苷酸編碼的用于調節(jié)甘油合成的天然酶，以及包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化的工程化代謝途徑和包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化的工程化代謝途徑，還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸和一種或多種由fdhl多核 苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
[0025]在一些實施方案中，一種或多種用于在重組微生物中產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失使甘油形成減少:超過約10%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；超過約20%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；超過約30%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；超過約40%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；超過約50%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；超過約60%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；超過約70%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；超過約80%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；超過約90%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；超過約95%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；或超過約99%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油。
[0026]在一些實施方案中，重組微生物產生選自如下的量的甲酸:在24小時內至少約0.012g/L ;在48小時內至少約0.022g/L或在142小時內至少約2.5g/L。[0027]在一些實施方案中，重組微生物產生選自如下的甲酸產率:比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約0.05倍的甲酸；t匕由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約0.1倍的甲酸；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約0.5倍的甲酸；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約1.0倍的甲酸；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約5.0倍的甲酸；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約10.0倍的甲酸；t匕由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約20.0倍的甲酸；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約30.0倍的甲酸；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約40.0倍的甲酸；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約50.0倍的甲酸；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約75.0倍的甲酸；或比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約100倍的甲酸。
[0028]在一些實施方案中，重組微生物產生選自如下的乙醇產率:比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約1%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約2%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約3%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約4%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生 的多至少約5%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約10%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約20%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約30%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約40%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約50%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約60%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約70%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約80%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約90%的乙醇；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約95%的乙醇；或比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約99%的乙醇。
[0029]在一些實施方案中，通過重組微生物或其中工程化的酶進行的碳水化合物源至乙醇的轉化是在缺氧條件下進行的。
[0030]在一些實施方案中，重組微生物在缺氧條件下具有選自如下的乙酸攝取(g/L)；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約1%的乙酸攝??；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約10%的乙酸攝?。槐扔刹痪哂幸环N或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約20%的乙酸攝??；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約30%的乙酸攝?。槐扔刹痪哂幸环N或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約40%的乙酸攝??；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約50%的乙酸攝??；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約60%的乙酸攝??；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約70%的乙酸攝?。槐扔刹痪哂幸环N或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約80%的乙酸攝?。缓捅扔刹痪哂幸环N或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約90%的乙酸攝取。
[0031]在一些實施方案中，重組微生物以相較于無一種或多種天然酶(其用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成)的缺失的重組微生物更低的葡萄糖利用率產生更多的乙醇，其中葡萄糖利用率選自:比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約1%的每小時使用的葡萄糖；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約5%的每小時使用的葡萄糖；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約10%的每小時使用的葡萄糖；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約20%的每小時使用的葡萄糖；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約30%的每小時使用的葡萄糖斗匕由不具有一種或多種天 然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約40%的每小時使用的葡萄糖；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約50%的每小時使用的葡萄糖；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約60%的每小時使用的葡萄糖；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約70%的每小時使用的葡萄糖；比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約80%的每小時使用的葡萄糖；和比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約90%的每小時使用的葡萄糖。
[0032]本發(fā)明的另一個方面涉及重組微生物，所述微生物包含:一種或多種用于調節(jié)甘油合成的酶，其中所述一種或多種異源酶被激活、上調或下調；和一種或多種在一個或多個工程化代謝途徑中用于將碳水化合物源轉化成乙醇的天然和/或異源酶，其中所述一種或多種天然和/或異源酶被激活、上調或下調。在某些實施方案中，一種或多種用于調節(jié)甘油合成的異源酶由fpsl多核苷酸編碼。在一個實施方案中，fpsl多核苷酸來自大腸桿菌。
[0033]在一些實施方案中，上述重組微生物的工程化代謝途徑之一包括丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化。在某些實施方案中，丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)轉化成乙酰-CoA和甲酸。在一些實施方案中，PFL具有原核生物或真核生物來源。在一些實施方案中，PFL來自雙歧桿菌屬、埃希氏菌屬、好熱厭氧桿菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、衣藻屬、單鞭毛菌屬、新麗鞭毛菌屬或芽孢桿菌屬的一種或多種。在一些實施方案中，PFL來自地衣芽胞桿菌、嗜熱鏈球菌、胚芽乳桿菌、干酪乳桿菌、青春雙岐桿菌、解纖維素梭菌、大腸桿菌、萊茵衣藻PflA、單鞭毛菌屬E2或新麗鞭毛菌的一種或多種。在一個實施方案中，PFL來自青春雙岐桿菌。
[0034]在一些實施方案中，上述重組微生物的工程化代謝途徑之一包括乙酰-CoA至乙醇的轉化。在一些實施方案中，乙酰-Cok被乙醛脫氫酶轉化成乙醛，乙醛被醇脫氫酶轉化成乙醇。在其它實施方案中，乙酰-CoA被雙功能乙醛/醇脫氫酶轉化成乙醇。在一些實施方案中，乙醛脫氫酶、醇脫氫酶或雙功能乙醛/醇脫氫酶具有原核生物或真核生物來源。在一個實施方案中，乙醒脫氫酶來自C.phytofermentans。在某些實施方案中，雙功能乙醒/醇脫氫酶來自埃希氏菌屬、梭菌屬、衣藻屬、單鞭毛菌屬或雙歧桿菌屬。在一些實施方案中，雙功能乙醒/醇脫氫酶來自大腸桿菌、Clostridium phytofermentans、萊茵衣藻、單鞭毛菌屬E2或青春雙岐桿菌。在一個實施方案中，雙功能乙醛/醇脫氫酶來自青春雙岐桿菌或單鞭毛菌屬E2。
[0035]在其它方面，重組微生物包含一種或多種由fdhl多核苷酸、fdh2多核苷酸或fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
[0036]在一些實施方案中，重組微生物產生乙醇。在其它實施方案中，重組微生物產生甲酸。在一些實施方案中，重組微生物選自釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、馬克思克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、解脂耶羅維亞酵母、多形漢森酵母、紅發(fā)夫酵母、實用假絲酵母、Arxulaadeninivorans、樹干畢赤酵母、漢遜德巴利酵母、多型德巴利酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和西方許旺酵母。在 一個實施方案中，重組微生物是釀酒酵母。
[0037]在一些實施方案中，本發(fā)明的重組微生物還包含一種或多種天然和/或異源酶，所述酶在一個或多個工程化代謝途徑中用于將木糖轉化成木酮糖-5-磷酸和/或將阿拉伯糖轉化成木酮糖-5-磷酸，其中一種或多種天然和/或異源酶被激活、上調或下調。
[0038]在一些實施方案中，本發(fā)明的重組微生物還包含一種或多種天然和/或異源酶，所述酶編碼糖解酶，包括淀粉酶，纖維素酶，半纖維素酶，纖維素分解酶和淀粉分解輔助酶、菊糖酶，果聚糖酶和戊糖利用酶。在一個方面，糖解酶是淀粉酶，其中淀粉酶選自灰腐質霉(H.grisea)、嗜熱子囊菌(T.aurantiacus)、埃默森籃狀菌(T.emersonii)、里氏木霉(T.reesei)、澳洲乳白蟻(C.lacteus)、臺灣乳白蟻(C.formosanus)、高山象白蟻(N.takasagoensis)、澳大利亞矛顎家白蟻(C.acinaciformis)、達爾文澳白蟻(M.darwinensis)、Ν.walker1、扣囊復膜酵母(S.fibuligera)、C.lucknowense、黃胸散白蟻(R.speratus)、嗜熱放線菌(Thermobfida fusca)、熱纖梭菌(Clostridum thermocellum)、解纖維素梭菌、約氏梭菌(Clostridum josui)、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilis)、糞堿纖維單胞菌(Cellulomonas fimi)、多糖降解菌(Saccharophagus degradans)、Piromycesequi1、Neocallimastix patricarum 或擬南芥(Arabidopsis thaliana)。在另一個方面，糖酶解是來自扣囊復膜酵母菌的淀粉酶葡糖淀粉酶(glu-0111-C0)。
[0039]本發(fā)明的另一個方面涉及用于減少細胞甘油的方法，包括將生物質與本發(fā)明的重組微生物接觸。本發(fā)明的其它方面涉及用于增加細胞質甲酸的方法，包括將生物質與本發(fā)明的重組微生物接觸。本發(fā)明的另一個方面涉及用于將生物質轉化成乙醇的方法，包括將生物質與本發(fā)明的重組微生物接觸。在一些實施方案中，生物質包括木質纖維素生物質。在一些實施方案中，木質纖維素生物質選自草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、混合草原禾草、芒草、糖加工殘渣、甘蔗渣、甘蔗桿、農業(yè)廢物、稻桿、稻殼、大麥桿、玉米穗軸、谷類桿、小麥桿、蕓苔桿、燕麥桿、燕麥殼、玉米纖維、秸桿、大豆秸桿、玉米秸桿、林業(yè)廢物、再循環(huán)木漿纖維、紙污泥、鋸屑、硬木、軟木、龍舌蘭及其組合。在一些實施方案中，生物質是玉米糖化醪或玉米淀粉。
[0040]在另一個方面，本發(fā)明還描述了表達用于從玉米淀粉產生燃料乙醇的酶的工業(yè)酵母菌株。
[0041]附圖概述
[0042]圖1顯不了聞廣率代謝的不意圖。
[0043]圖2描述糖酵解途徑。
[0044]圖3顯示糖酵解/發(fā)酵途徑的示意圖。
[0045]圖4顯示描述用于產生GPDl的標記的缺失的引物的位置的圖譜。
[0046]圖5顯示描述用于從GPDl基因座除去標志物的引物的位置的圖譜。
[0047]圖6顯示描述用于產生GPD2的標記的缺失的引物的位置的圖譜。
[0048]圖7顯示描述用于從GPD2基因座除去標志物的引物的位置的圖譜。
[0049]圖8顯示描述用于產生FDHl的標記的缺失的引物的位置的圖譜。
[0050]圖9顯示描述用于從FDHl基因座除去標志物的引物的位置的圖譜。
[0051]圖10顯示描述用于產生FDH2的標記的缺失的引物的位置的圖譜。
[0052]圖11顯示描述用于從FDH2基因座除去標志物的引物的位置的圖譜。
[0053]圖12顯示來自不同生物的PFL酶的比對。
[0054]圖13顯示48小時過程中甲酸產量的圖。
[0055]圖14顯示微氧和缺氧條件下142小時結束時甲酸產量的圖。
[0056]圖15顯示通過OD測量的72小時過程中本發(fā)明的菌株的生長的圖。
[0057]圖16顯示72小時過程中本發(fā)明的菌株的甘油產量(g/L)的圖。
[0058]圖17顯示72小時過程中本發(fā)明的菌株的乙醇產量(g/L)的圖。
[0059]圖18顯示72小時過程中本發(fā)明的菌株的葡萄糖利用(g/L)的圖。
[0060]圖19顯示通過OD測量的142小時過程中本發(fā)明的菌株的生長的圖。
[0061]圖20顯示本發(fā)明的菌株的相對生長率(mOD/min)的圖。
[0062]圖21顯示在50小時的發(fā)酵后本發(fā)明的菌株的乙醇產量(g/L)的圖。
[0063]圖22顯不在50小時的發(fā)酵后本發(fā)明的菌株的乙醇產量(g/L)的圖。
[0064]圖23顯示在50小時的發(fā)酵后本發(fā)明的菌株的甘油產量(g/L)的圖。
[0065]圖24顯示在50小時的發(fā)酵后本發(fā)明的菌株的甘油產量(g/L)的圖。
[0066]圖25顯示在72小時的發(fā)酵后葡萄糖利用(g/L)、甘油產量(g/L)和乙醇產量(g/U的圖。
[0067]圖26顯示描述大腸桿菌AADH在GPDl基因座上的整合的簡圖。
[0068]圖27顯示描述大腸桿菌AADH在FCYl基因座上的整合的簡圖。
[0069]圖28顯示用于PCR構建以及KT-MX和NT-MX整合盒至靶基因座的兩個染色體中的整合的策略的示意圖。[0070]圖29顯不用于在祀基因座的兩個染色體上用Mascoma Assembly替代整合的KT-MX和NT-MX選擇盒的策略的示意圖。
[0071]圖30顯示在M3625的FDHl位點整合的MA0370的分子圖譜和基因分型。
[0072]圖31顯示包含用于對MA0370位點基因分型和測序的PCR產物的瓊脂糖凝膠的圖
像。
[0073]圖32顯示在MA3625的FDH2位點整合的MA0280的分子圖譜和基因分型。
[0074]圖33顯示包含用于對MA0280位點基因分型和測序的PCR產物的瓊脂糖凝膠的圖像。
[0075]圖34顯示在M3625的GPD2位點整合的MA0289的分子圖譜和基因分型。
[0076]圖35顯示包含用于對MA0370位點基因分型和測序的PCR產物的瓊脂糖凝膠的圖像。
[0077]圖36顯示在M3625的FCYl位點整合的MA0317的分子圖譜和基因分型。
[0078]圖37顯示包含用于對MA0317位點基因分型和測序的PCR產物的瓊脂糖凝膠的圖像。
[0079]圖38顯示描述利用菌株M2390、M2519、M2691、M3498和M3625進行的淀粉測定的結果的圖。
[0080]圖39顯示細胞提取物(PflA、PflB, AdhE)和好氧培養(yǎng)物上清液(AE9)的抗肽Western印跡分析。
[0081]圖40顯示描述利用工程化的菌株M3465、M3625、M3679、M3680和M2390進行的甲
酸裂解酶測定的結果的圖。
[0082]圖41顯示描述利用工程化的菌株M3465、M3625、M3679和M3680進行的醇脫氫酶測定的結果的圖。
[0083]圖42顯示描述描利用工程化的菌株M3625和M3680，使用50 μ g/mL AE9在室溫(~25°C )對玉米淀粉進行的葡糖淀粉酶活性測定的結果的圖。
[0084]圖43A是顯示用于表達GPD2和青春雙岐桿菌pflA、pflB和adhE的啟動子和終止子在M3624和M3515的GPDl基因座上的插入的示意圖。
[0085]圖43B是顯示用于表達GPDl和青春雙岐桿菌pflA、pflB和adhE的啟動子和終止子在M3624和M3515的GPD2基因座上的插入的示意圖。
[0086]圖43C是顯示M3624和M3515中的FDHl基因的缺失的示意圖。
[0087]圖43D是顯示用于表達青春雙岐桿菌pf 1A、pflB和adhE的啟動子和終止子在M3624和M3515的FDH2基因座上的的插入的示意圖。
[0088]圖44A顯示在由28%固體玉米糖化醪的發(fā)酵過程中由甘油還原菌株產生的甲酸的HPLC分析。
[0089]圖44B顯示在由28%固體玉米糖化醪的發(fā)酵過程中由甘油還原菌株產生的甘油的HPLC分析。
[0090]圖44C顯示在由28%固體玉米糖化醪的發(fā)酵過程中由甘油還原菌株產生的乙醇的HPLC分析。
[0091]圖45A是顯示用于表達青春雙岐桿菌pf 1A、pflB和adhE的啟動子和終止子在M3465的GPD2基因座上的插入的示意圖。[0092]圖45B是顯示M3465的FDHl基因的缺失的示意圖。
[0093]圖45C是顯示用于表達青春雙岐桿菌pf 1A、pflB和adhE的啟動子和終止子在M3465的FDH2基因座上的插入的示意圖。
[0094]圖46A是顯示用于表達青春雙岐桿菌pf 1A、pflB和adhE的啟動子和終止子在M3469的GPDl基因座上的插入的示意圖。
[0095]圖46B是顯示M3469的FDHl基因的缺失的示意圖。 [0096]圖46C是顯示用于表達青春雙岐桿菌pf 1A、pflB和adhE的啟動子和終止子在M3469的FDH2基因座上的插入的示意圖。
[0097]圖47顯示在30%固體玉米糖化醪的發(fā)酵過程中由甘油還原菌株產生的乙醇滴度的HPLC分析。
[0098]圖48顯示在30%固體玉米糖化醪的發(fā)酵過程中由甘油還原菌株產生的甘油滴度的HPLC分析。
[0099]圖49顯示通過青春雙岐桿菌雙功能醇脫氫酶(AdhE)催化的逆反應，其中乙醇被轉化成乙醛。
[0100]圖50顯示通過AdhE進行的乙醒至乙酰CoA的轉化的反應的圖。
[0101]圖51是顯示用于表達青春雙岐桿菌pflA、pflB和adhE的啟動子和終止子在TB655的GPPl基因座上的插入的示意圖。
[0102]圖52是顯示用于表達青春雙岐桿菌pflA、pflB和adhE的啟動子和終止子在TB656的GPP2基因座上的的插入的示意圖。
[0103]圖53是描述菌株TB655和TB656相較于菌株M3297的減少的甘油形成的圖。
[0104]圖54是描述菌株TB655和TB656相較于菌株M3297的增加的乙醇產率的圖。
[0105]圖55是描述菌株TB655、TB656和M3297的甲酸產生的圖。
[0106]發(fā)明詳述
[0107]定義
[0108]術語〃異源的〃，當用于指多核苷酸、基因、多肽或酶時，是指通常不在宿主生物中發(fā)現(xiàn)的多核苷酸、基因、多肽或酶?！ó愒吹摹ㄟ€包括天然編碼區(qū)或其部分，所述天然編碼區(qū)或其部分以不同于對應的天然基因的形式(例如，不在其在生物體的基因組中的天然位置中)被引入源生物。異源多核苷酸或基因可通過例如基因轉移引入宿主生物。異源基因可包括作為嵌合基因(其包含被重新引入天然宿主的非天然調控區(qū))的部分的天然編碼區(qū)。外來基因可包括插入非天然生物體的天然基因或嵌合基因。
[0109]術語"異源多核苷酸"意欲包括編碼一個或多個多肽或多肽的部分或片段的多核苷酸。異源多核苷酸可來源于任何來源，例如真核生物、原核生物、病毒或合成多核苷酸片段。
[0110]術語〃啟動子〃或〃替代啟動子〃意欲包括可轉錄地控制其在天然狀態(tài)下不轉錄地控制的目的基因的多核苷酸。在某些實施方案中，替代啟動子的轉錄控制導致目的基因表達的增加。在某些實施方案中，替代啟動子置于目的基因的5’。替代啟動子可用于替代天然啟動子，或除天然啟動子外，還可使用替代啟動子。替代啟動子相對于其中使用其的宿主細胞可以是內源的，或其可以是引入宿主細胞的異源多核苷酸序列，例如相對于其中使用其的宿主細胞是外源的。[0111]術語〃基因”或“多核苷酸”或“多核苷酸序列〃意欲包括核酸分子，例如多核苷酸，其包括編碼多肽的開放閱讀框架和可進一步包括非編碼調控序列和內含子。此外，該術語意欲包括一個或多個被定位至功能基因座的基因。此外，該術語意欲包括用于選擇的目的的特定基因。基因對于宿主細胞可以是內源的或可被重組地引入宿主細胞，例如作為以附加型形式維持的質粒或被穩(wěn)定地整合進入基因組的質粒(或其片段)。除了質粒形式以外，基因還可以以例如線性DNA的形式存在。在某些實施方案中，基因或多核苷酸參與生物質至例如乙醇的生物轉化的至少一個步驟。因此，該術語意欲包括任何編碼多肽的基因，所述多肽是例如乙酸激酶(ACK)、磷酸乙酸轉移酶(PTA)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)、醛脫氫酶(ADH)和/或醇脫氫酶(ADH)、乙酰-CoA轉移酶(ACS)、乙醛脫氫酶(ACDH)、乙醛/醇脫氫酶(AADH)、甘油-3-磷酸脫氫酶(GPD)、甘油3-磷酸酶(GPP)、乙酰-Cok合成酶、硫解酶、CoA轉移酶、乙酰乙酸脫羧酶、醇乙酰轉移酶，D-木糖途徑中的酶例如木糖異構酶和木酮糖激酶，L-阿拉伯糖途徑中的酶例如L-阿拉伯糖異構酶和L-核酮糖-5-磷酸4-差向異構酶。術語基因還意欲包括特定基因的全部拷貝，例如細胞中編碼特定基因產物的全部DNA序列。
[0112]術語〃轉錄控制〃意欲包括在轉錄的水平上調芐基因表達的能力。在某些實施方案中，轉錄，從而基因表達，通過在目的基因的編碼區(qū)的5’末端附近替代或添加的替代啟動子調節(jié)，從而導致改變的基因表達。在某些實施方案中，工程化一個或多個基因的轉錄控制以導致這樣的基因的最佳(例如，以期望的比率)表達。該術語還包括本領域認識到的誘導型轉錄控制。
[0113]術語〃表達〃意欲包括至少在mRNA產量的水平上的基因的表達。
[0114]術語〃表達產物〃意欲 包括表達的基因的所得產物，例如多肽。
[0115]術語〃增加的表達〃意欲包括至少在增加的mRNA產生的水平上，優(yōu)選在多肽表達的水平上的基因表達的改變。術語"增加的產量"意欲包括相較于多肽的天然產量或酶促活性，在表達的多肽的量上、在多肽的酶促活性的水平上的升高或其組合。
[0116]術語〃活性〃和〃酶促活性〃可互換使用并且意欲包括當在有利的條件下產生時通常歸功于選擇的多肽的任何功能活性。通常地，選擇的多肽的活性包括與產生的多肽相關的總的酶促活性。由宿主細胞產生的并且具有酶促活性的多肽可位于細胞的細胞內空間、與細胞結合、分泌進入細胞外環(huán)境或其組合。用于測定相較于分泌的活性的總活性的技術描述于本文中并且在本領域是已知的。
[0117]術語"木聚糖降解活性"意欲包括水解寡聚戊糖和多聚戊糖中的糖苷鍵的能力。
[0118]術語"阿拉伯糖降解活性"意欲包括水解寡聚戊糖和多聚戊糖中的糖苷鍵的能力。
[0119]術語〃纖維素分解活性〃意欲包括水解寡聚己糖和多聚己糖中的糖苷鍵的能力。纖維素分解活性還可包括使纖維素和半纖維素解聚或脫支的能力。
[0120]如本文中所用，術語〃乳酸脫氫酶”或“LDH"意欲包括能夠將丙酮酸轉化成乳酸的酶。應理解，LDH還可催化羥基丁酸的氧化。LDH包括對應于酶委員會編號1.1.1.27的那些酶。
[0121]如本文中所用，術語〃醇脫氫酶”或“ADH"意欲包括能夠將乙醛轉化成醇例如乙醇的酶。ADH還包括能夠將丙酮轉化成異丙醇的酶。ADH包括對應于酶委員會編號1.1.1.1的那些酶。
[0122]如本文中所用，術語〃磷酸乙酸轉移酶”或“PTA"意欲包括能夠將乙酰磷酸鹽轉化成乙酰-CoA的鹽。PTA包括對應于酶委員會編號2.3.1.8的那些酶。
[0123]如本文中所用，術語〃乙酸激酶”或“ACK"意欲包括能夠將乙酸轉化成乙酰磷酸的酶。ACK包括對應于酶委員會編號2.7.2.1的那些酶。
[0124]如本文中所用，術語〃丙酮酸甲酸裂解酶”或“PFL"意欲包括能夠將丙酮酸轉化成乙酰-CoA和甲酸的酶。PFL包括對應于酶委員會編號2.3.1.54的那些酶。
[0125]如本文中所用，術語〃甲酸脫氫酶”或“FDH"意欲包括能夠將甲酸和NAD+轉化成NADH和CO2的酶。FDH包括對應于酶委員會編號1.2.1.2的那些酶。 [0126]如本文中所用，術語〃乙醛脫氫酶”或“A⑶H"意欲包括能夠將乙酰-CoA轉化成乙醛的酶。A⑶H包括對應于酶委員會編號1.2.1.3的那些酶。
[0127]如本文中所用，術語〃乙醛/醇脫氫酶〃意欲包括能夠將乙酰-CoA轉化成乙醇的酶。乙醒/醇脫氫酶包括對應于酶委員會編號1.2.1.10和1.1.1.1的那些酶。
[0128]如本文中所用，術語〃甘油-3-磷酸-脫氫酶”或“GPD"意欲包括能夠將二羥丙酮磷酸轉化成甘油-3-磷酸的酶。GPD包括對應于酶委員會編號1.1.1.8的那些酶。
[0129]如本文中所用，術語〃甘油3-磷酸酶”或“GPP"意欲包括能夠將甘油3-磷酸轉化成甘油的酶。GPP包括對應于酶委員會編號3.1.3.21的那些酶。
[0130]如本文中所用，術語〃乙酰-CoA合成酶”或“ACS"意欲包括能夠將乙酸轉化成乙酰-CoA的酶。乙酰-CoA合成酶包括對應于酶委員會編號6.2.1.1的那些酶。
[0131]如本文中所用，術語〃硫解酶〃意欲包括能夠將乙酰-CoA轉化成乙酰乙酰-CoA的酶。硫解酶包括對應于酶委員會編號2.3.1.9的那些酶。
[0132]如本文中所用，術語"CoA轉移酶〃意欲包括能夠將乙酸和乙酰乙酰-CoA轉化成乙酰乙酸和乙酰-CoA的酶。CoA轉移酶包括對應于酶委員會編號2.8.3.8的那些酶。
[0133]如本文中所用，術語〃乙酰乙酸脫羧酶〃意欲包括能夠將乙酰乙酸轉化成丙酮和二氧化碳的酶。乙酰乙酸脫羧酶包括對應于酶委員會編號4.1.1.4的那些酶。
[0134]如本文中所用，術語〃醇乙酰轉移酶〃意欲包括能夠將乙酰-CoA和乙醇轉化成乙酸乙酯的酶。醇乙酰轉移酶包括對應于酶委員會編號2.3.1.84的那些酶。
[0135]術語〃丙酮酸脫羧酶活性〃意欲包括多肽酶促地將丙酮酸轉化成乙醛和二氧化碳的能力(例如，〃丙酮酸脫羧酶”或“roc")。通常地，選擇的多肽的活性包括與產生的多肽相關的總的酶促活性，包括例如酶的優(yōu)良的底物親和力、熱穩(wěn)定性、不同PH下的穩(wěn)定性或這些屬性的組合。PDC包括對應于酶委員會編號4.1.1.1。
[0136]術語〃產乙醇的〃意欲包括微生物從碳水化合物產生乙醇作為發(fā)酵產物的能力。該術語意欲包括但不限于天然存在的產乙醇生物體、具有天然存在的或誘導的突變的產乙醇生物體以及已被遺傳修飾的產乙醇生物體。
[0137]術語〃發(fā)酵〃意欲包括籍以從碳水化合物產生乙醇(特別是作為發(fā)酵的產物)的酶促過程(例如，細胞或無細胞的，例如裂解物或純化的多肽混合物)。
[0138]術語〃分泌的〃意欲包括多肽至周質空間或細胞外環(huán)境的移動。該術語〃增加的分泌〃意欲包括其中給定的多肽以升高的水平(即，以超過天然存在的分泌量)分泌的狀況。在某些實施方案中，術語〃增加的分泌〃是指相較于天然存在的分泌水平為至少約10%或至少約 100%、200%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000% 或更多的給定多肽的分泌的增加。
[0139]術語〃分泌多肽〃意欲包括單獨地或與其它多肽組合地促進另一種多肽從細胞的細胞內空間至細胞外環(huán)境的運輸?shù)娜魏味嚯?。在某些實施方案中，分泌多肽包括所有足以賦予革蘭陰性或革蘭陽性宿主細胞或酵母宿主細胞分泌活性的必需分泌多肽。通常地，分泌蛋白質在單個區(qū)域或基因座中編碼，可使用基因工程從一個宿主細胞分離并且轉移至另一個宿主細胞。在某些實施方案中，分泌多肽來源于任何具有分泌活性的細菌細胞或任何具有分泌活性的酵母細胞。在某些實施方案中，分泌多肽來源于具有II型分泌活性的宿主細胞。在某些實施方案中，宿主細胞是嗜熱細菌細胞。在某些實施方案中，宿主細胞是酵母細胞。 [0140]術語〃來源于〃意欲包括從指定的來源分離(完整地或部分地)多核苷酸區(qū)段，或從指定的來源純化多肽。該術語意欲包括例如從與指定的多核苷酸來源結合的序列或基于所述序列直接克隆、PCR擴增或人工合成。
[0141]術語〃重組微生物”或“重組宿主細胞〃意欲包括本發(fā)明的重組微生物的后代或衍生物。因為某些修飾可因突變或環(huán)境影響而在后續(xù)代中發(fā)生，這樣的后代或衍生物實際上可以與親代細胞不完全相同，但仍然包括在本文中使用的術語的范圍內。
[0142]〃嗜熱的〃意指在約45°C或更高的溫度旺盛生長的生物。
[0143]〃嗜溫的〃意指在約20_45°C的溫度旺盛生長的生物。
[0144]術語〃有機酸〃是本領域承認的。〃有機酸〃，如本文中所用，還包括某些有機溶劑例如乙醇。術語〃乳酸〃是指以游離酸或鹽形式存在的有機酸2-羥基丙酸。乳酸的鹽形式稱為〃乳酸鹽"，無論中和劑是什么，即碳酸鈣或氫氧化銨。術語〃醋酸〃是指以游離酸或鹽形式存在的有機酸甲烷羧酸，也稱為乙酸。醋酸的鹽形式稱為“乙酸鹽”。
[0145]本發(fā)明的某些實施方案提供了某些基因或特定多核苷酸序列在嗜熱或嗜溫微生物內的“插入”(例如，添加、整合或引入)，所述基因或特定多核苷酸序列的插入可被理解為包括"遺傳修飾”或“轉化〃，以便所述嗜熱或嗜溫微生物的所得菌株可被理解為被"遺傳修飾的”或“轉化的"。在某些實施方案中，菌株可以是細菌、真菌或酵母來源。
[0146]本發(fā)明的某些實施方案在嗜熱或嗜溫微生物中提供了某些基因或特定多核苷酸序列的"滅活”或“缺失"，所述基因或特定多核苷酸序列的"滅活”或“缺失"可被理解為包括"遺傳修飾”或“轉化〃，以便所述嗜熱或嗜溫微生物的所得菌株可被理解為被“遺傳修飾的”或“轉化的”。在某些實施方案中，菌株可以是細菌、真菌或酵母來源。
[0147]術語〃聯(lián)合生物加工”或“CBP"是指牽涉酶促或微生物水解的生物質加工方案，所述方案通常包括4個生物介導的轉化:(I)糖解酶(淀粉酶、纖維素酶和半纖維素酶)的產生；(2)存在于預處理的生物質中的碳水化合物組分至糖的水解；(3)己糖(例如，葡萄糖、甘露糖和半乳糖)的發(fā)酵；和⑷戊糖(例如，木糖和阿拉伯糖)的發(fā)酵。這4個轉化在稱為CBP的工藝配置(process configuration)中在單個步驟中發(fā)生,這與其它不太高度整合的配置的區(qū)別在于其不包括用于纖維素酶和/或半纖維素酶產生的專門處理步驟。
[0148]術語〃CBP生物〃意欲包括本發(fā)明的微生物，例如具有適合進行CBP的性質的微生物。
[0149]在本發(fā)明的一個方面，基因或特定多核苷酸序列被插入以激活它們編碼的活性，例如酶的表達。在某些實施方案中，可將編碼參與乙醇的代謝產生的酶(例如，代謝戊糖和/或己糖的酶)的基因添加至嗜溫或嗜熱生物中。在本發(fā)明的某些實施方案中，酶可賦予代謝戊糖的能力并且參與例如D-木糖途徑和/或L-阿拉伯糖途徑。
[0150]在本發(fā)明的一個方面，基因或特定多核苷酸序列被部分、大部分或完全缺失、沉默、滅活或下調以使它們編碼的活性例如酶的表達失活。缺失提供最大的穩(wěn)定性，因為不存在恢復功能的回復突變的可能性?；蛘?，可通過插入破壞基因的功能和/或表達的核酸序列(例如，Pi轉導或本文中已知的其它方法)將基因部分、大部分或完全缺失、沉默、滅活或下調。術語〃消除〃和〃敲除〃可與術語〃缺失"、〃部分缺失"、〃大部分缺失”或“完全缺失"互換使用。在某些實施方案中，可通過定向同源重組(以敲除有機酸的產生)來工程化目的嗜熱或嗜溫微生物的菌株。在其它實施方案中，RNAi或反義DNA(asDNA)可用于部分、大部分或完全沉默、滅活或下調特定目的基因。
[0151]在某些實施方案中，如本文中所述被靶向缺失或滅活的基因對于微生物的天然菌株可以是內源性的，從而可被理解為稱為"天然基因”或“內源基因〃。如果生物未曾進行遺傳工程化或通過人工以有意地改變生物的遺傳和/或表型構成的方式操作時，生物以“天然狀態(tài)”存在。例如，野生型生物體可被認為以天然狀態(tài)存在。在其它實施方案中，被靶向缺失或滅活的基因對于生物體可以是非天然的。
[0152]類似地，本文中描述的本發(fā)明的酶對于微生物的天然菌株可以是內源性的，從而可被理解為稱為〃天然的”或“內源的〃。
[0153]術語〃上調的〃意 指相較于天然宿主生物中的活性，活性的增加，例如酶的酶促活性的增加。
[0154]術語"下調的"意指相較于天然宿主生物中的活性，活性的減小，例如酶的酶促活性的減小。
[0155]術語〃激活的〃意指表達的或代謝上具有功能的。
[0156]術語〃經改造適合于生長的〃意指在其中生物不然不生長或其中生物生長緩慢或最低限度地生長的條件下對生長的生物的選擇。因此，被認為經改造適合于在選擇的條件下生長的生物比未經改造來適合在選擇的條件下生長的生物生長更好。生長可通過本領域已知的任何方法來測量，包括但不限于光密度或比生長速率的測量。
[0157]術語〃碳水化合來源〃意欲包括碳水化合物的任何來源，包括但不限于生物質或碳水化合物例如糖或糖醇。"碳水化合物"包括但不限于單糖(例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖或核糖)、糖衍生物(例如，山梨醇、甘油、半乳糖醛酸、鼠李糖、木糖醇)、二糖(例如，蔗糖、纖維二糖、麥芽糖或乳糖)、寡糖(例如，木寡聚糖，纖維糊精或麥芽糊精)和多糖(例如，木聚糖、纖維素、淀粉、甘露聚糖、藻酸鹽或果膠)。
[0158]如本文中所用，〃淀粉水解酶〃可以是參與淀粉降解、代謝和/或水解的任何酶。術語"淀粉酶"是指將淀粉分解成糖的酶。淀粉酶存在于人唾液中，在唾液中其開始化學降解過程。包含許多淀粉但少量糖的食物例如米和馬鈴薯當它們被咀嚼時味道有點甜，因為淀粉酶將其一些淀粉在口中轉化成糖。胰腺也產生淀粉酶(α-淀粉酶)來將飲食淀粉水解成可被其它酶轉化成葡萄糖來為身體提供能量的二糖和三糖。植物和一些細菌也產生淀粉酶。所有淀粉酶是糖苷水解酶并且作用于α-1，4_糖苷鍵。一些淀粉酶例如Y-淀粉酶(葡糖淀粉酶)還作用于α -1, 6-糖苷鍵。淀粉酶包括α -淀粉酶(EC3.2.1.1)、β -淀粉酶(EC3.2.1.2)和y -淀粉酶(EC3.2.1.3)。α -淀粉酶是在鈣不存在的情況下不能起作用的鈣金屬酶。通過在沿著淀粉鏈的隨機位置上作用，α-淀粉酶分解長鏈碳水化合物，最終從直鏈淀粉產生麥芽三糖和麥芽糖，或從支鏈淀粉產生麥芽糖、葡萄糖或"極限糊精〃。因為其可作用于底物上的任何地方，因此α -淀粉酶傾向于比β -淀粉酶更快速地作用。在動物中，其是主要的消化酶并且其最適PH為約6.7-7.0。淀粉酶的另一種形式β_淀粉酶還被細菌、真菌和植物合成。從非還原末端開始作用，β -淀粉酶催化第二個α-1，4糖苷鍵的水解，一次切掉兩個葡萄糖單元(麥芽糖)。許多微生物產生淀粉酶來降解細胞外淀粉。除了切割直鏈淀粉和支鏈淀粉的非還原末端上的最后一個α (1-4)糖苷鍵，產生葡萄糖外，Y-淀粉酶還切割α (1-6)糖苷鍵。另一種淀粉水解酶是作用于麥芽糖和由α-、β-和Y-淀粉酶產生的其它短的麥芽低聚糖、將它們轉化成葡萄糖的α-葡糖苷酶。另一種淀粉水解酶是支鏈淀粉酶。支鏈淀粉酶是特定種類的葡聚糖酶，一種淀粉水解外酶，其降解芽霉菌糖。芽霉菌糖被認為是通過α-1,6-糖苷鍵連接的麥芽三糖單元的鏈。支鏈淀粉酶(EC3.2.1.41)也稱為芽霉菌糖-6-葡聚糖水解酶(脫支酶)。另一種淀粉水解酶異支鏈淀粉酶，將芽霉菌糖水解成異葡糖基麥芽糖(6- α -麥芽糖基葡萄糖)。異支鏈淀粉酶(EC3.2.1.57)也稱為芽霉菌糖4-葡聚糖水解酶?！ǖ矸勖浮梢允菂⑴c淀粉降解、代謝和/或水解的任何酶，包括α -淀粉酶、β -淀粉酶、葡糖淀粉酶、支鏈淀粉酶、異支鏈淀粉酶和α -葡糖苷酶。 [0159]如本文中所用，"糖解酶"可以是參與碳水化合物降解、代謝和/或水解的任何酶，包括淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、纖維素分解和淀粉分解輔助酶、菊糖酶、果聚糖酶和戊糖利用酶。
[0160]生物質
[0161]生物質可包括本領域已知的或本文中描述的任何類型的生物質。例如，生物質可包括但不限于淀粉、糖和木質纖維素材料。淀粉材料可包括但不限于醪液例如玉米、小麥、黑麥、大麥、稻或高粱。糖材料可包括但不限于甜菜、朝鮮薊根莖、甜高粱或藤條(cane)。術語"木質纖維素材料"、"木質纖維素底物"和"纖維質生物質"意指包含纖維素、半纖維素、木質素或其組合的任何類型的生物質，例如但不限于木質生物質，牧草，草本能源作物、非木本植物生物質、農業(yè)廢物和/或農業(yè)殘余物，林業(yè)廢棄物和/或林業(yè)廢物，造紙污泥和/或廢紙污泥、廢水處理污泥、城市固體廢棄物，來自濕和干粉碎的玉米乙醇植物的玉米纖維和糖加工殘渣。術語"半纖維素"、"半纖維素部分"和"半纖維素級分"意指木質纖維素材料的非木質素、非纖維素組分，例如但不限于半纖維素(即，包含木糖葡聚糖、木聚糖、葡糖醛酸聚糖、阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、葡萄糖甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖等等)、果膠(例如，聚半乳糖醒酸(homogalacturonan)、鼠李半乳醒聚糖I和II以及木半乳糖醒酸)和蛋白聚糖(例如，阿拉伯半乳聚糖-蛋白質、伸展蛋白和富含脯氨酸的蛋白質)。
[0162]在非限定性實例中，木質纖維素材料可包括但不限于，木質生物質例如廢棄木質紙漿纖維、鋸屑、硬木、軟木及其組合；草，例如柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、芒草或其組合；糖加工殘渣，例如但不限于甘蔗渣；農業(yè)廢物、例如但不限于稻桿、稻殼、大麥桿、玉米穗軸、谷類桿、小麥桿、蕓苔桿、燕麥桿、燕麥殼和玉米纖維；稻桿，例如但不限于大豆稻桿、玉米秸桿；肉質植物，例如但不限于龍舌蘭；和林業(yè)廢物，例如但不限于再循環(huán)木漿纖維、鋸屑、硬木(例如，白楊、橡木、楓木、樺木、柳樹)、軟木或其任意組合。木質纖維素材料可包含一個物種的纖維；或者，木質纖維素材料可包含源自不同木質纖維素材料的纖維的混合物。其它木質纖維素材料是農業(yè)廢物，例如谷類桿，包括小麥桿，大麥桿，蕓苔桿和燕麥桿；玉米纖維；秸桿，例如玉米秸桿和大豆秸桿；草，例如柳枝稷、草廬、大米草和芒草；或其組合。
[0163]紙污泥也是用于乳酸或乙酸生產的有機原料。紙污泥是從制漿和造紙產生的固體殘渣，通常從初沉池中的處理廢水取出。以$30/濕噸的處理成本，污泥處理的成本相當于$5/噸的被生產來銷售的紙。濕污泥的處理成本極大地促使將材料轉向其它用途，例如至乙醇的轉化。本發(fā)明提供的處理是可廣泛應用的。此外，糖化和/或發(fā)酵產物可用于產生乙醇或更高附加值的化學品，例如有機酸、芳族化合物、酯、丙酮和聚合物中間體。
[0164]甘油還原
[0165]厭氧生長條件需要內源電子受體的產生，例如輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(MD+)。在細胞氧化還原反應中，NAD+/NADH這一對作為還原當量的儲存庫和載體起著至關重要的作用。Ansell, R.，等人，EMBO J.16:2179-87 (1997)。產生NAD+的細胞甘油的產生用作在酵母的厭氧發(fā)酵過程中除去過量還原力的氧化還原閥(redox valve) 0然而，甘油的產生是消耗ATP的浪費能量的過程并且導致還原的三碳化合物的損失。Ansell，R.，等人，EMBO J.16:2179-87(1997)。為了從起始葡萄糖分子產生甘油，甘油3-磷酸脫氫酶(GPD)將二羥丙酮磷酸還原成甘油3-磷酸，甘油3-磷酸酶(GPP)使甘油3-磷酸脫磷酸成甘油。盡管是浪費能量的，但甘油的產生是厭氧生長所必需的代謝過程，因為刪除GH)活性在厭氧條件下完全抑制生長。參見Ansell, R.，等人，EMBO J.16:2179-87 (1997)。
[0166]GPD由兩個同基因(isogene) gpdl和gpd2編碼。GPDl在厭氧生長細胞中編碼主要同種型，而GPD2是在氧氣 不存在的情況下(這刺激其表達)甘油產生所必需的。Pahlman, A-K.，等人，J.Biol.Chem.276:3555-63(2001)。GPD 將二羥丙酮磷酸轉化成甘油的第一步驟是速率控制性的。Guo, Z.P.,等人，Metab.Eng.13:49-59(2011)。GPP也由兩個同基因gppl和gpp2編碼。當轉換至厭氧條件時，GPP基因的缺失阻止生長，這表明GPP對于細胞對滲透和缺氧脅迫的耐受性是重要的。參見Pahlman, A-K.，等人，J.Biol.Chem.276:3555-63(2001)。
[0167]因為甘油是乙醇的厭氧產生的主要副產品，所以已進行了許多努力來除去甘油的細胞產生。然而，由于通過甘油合成產生的還原當量的原因，因此在不補償該有價值的代謝功能的情況下不能進行甘油合成途徑的刪除。已進行了消除甘油產生和工程化交替電子受體的努力。Liden, G.,等人，Appl.Env.Microbiol.62:3894-96 (1996) ；Medina, V.G.,等人,Appl.Env.Microbiol.76:190-195 (2010)。Liden 和 Medina 都刪除了 gpdl 和 gpd2基因并且嘗試使用另外的碳源來繞開甘油形成。Lid6n將來自樹干畢赤酵母的木糖還原酶工程化進入釀酒酵母gpdl/2缺失菌株。木糖還原酶活性在木糖存在的情況下促進甘油缺失菌株的厭氧生長。參見 Lid6n，G.，等人，Appl.Env.Microbiol.62:3894-96 (1996)。Medina將來自大腸桿菌的乙醒脫氫酶mhpF工程化進入釀酒酵母gpdl/2缺失菌株來將乙酰-CoA轉化成乙醛。乙醛脫氫酶活性在醋酸存在的情況下促進甘油缺失菌株的厭氧生長，但在葡萄糖作為唯一碳源存在的情況下則不。Medina, V.G.，等人，Appl.Env.Microbiol.76:190-195(2010);也參見EP2277989。Medina指出在工業(yè)實現(xiàn)之前需要解決的關于含mhpF菌株的幾個問題，包括相較于含GPDl和GPD2的酵母顯著減弱的生長和產物形成率。
[0168]將流從甘油重新導向乙醇的另外的努力包括通過或不通過GPDl的同時敲除將非磷酸化NADP+-依賴性甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPN)工程化進入酵母。Bro，C.，等人，Metab.Eng.8:102-111 (2006);美國專利申請公布號 US2006/0257983 ；Guo, Z.P.,等人，Metab.Eng.13:49-59(2011)。然而，存在控制甘油的產生和積累的其它細胞機制，包括甘油輸出者例如FPS1，其不需要交替NADP+/NADPH偶聯(lián)的工程化和甘油合成基因的缺失。Tamas, M.J.，等人，Mol.Microbiol.31:1087-1004 (1999)。
[0169]FPSl是位于質膜中的通道蛋白，其在酵母滲透壓調節(jié)中控制甘油的積累和釋放。該菌株的無效突變體積累大量細胞內甘油，生長比野生型慢得多，并且以更慢的速率消耗糖底物。Tamas, M.J.,等人,Mol.Microbiol.31:1087-1004 (1999)。盡管在缺氧條件下生長更慢，但fpsl △菌株可用作消除NAD+-依賴性甘油活性的替代物。fpslA菌株具有減少的甘油形成，但仍然具有完全功能性的NAD+-依賴性甘油合成途徑?；蛘?，不刪除內源FPS1，可將來自其它生物的FPSl或同源物的組成型活性突變體用于調節(jié)甘油合成，同時使NAD+-依賴性甘油活性保持完整。在本發(fā)明的調節(jié)FPSl的實施方案中，重組宿主細胞仍然可合成和保留甘油，并且獲得相較于不能產生甘油的菌株改善的魯棒性。
[0170]下面顯示來自釀酒酵母的示例性FPSl序列。
[0171]釀酒酵母FPS1(核苷酸；編碼序列加以下劃線；SEQ ID N0:1):
[0172]ttgacggcagttctcatagcatctcaaagcaatagcagtgcaaaagtacataaccgtaggaaggtacgcggtaggtatttgagttcgttggtggttatcctccgcaaggcgcttcggcggttatttgttgatagtcgaagaacaccaaaaaaaatgctgttattgctt tctccgtaaacaataaaacccggtagcgggataacgcggctgatgcttttatttaggaaggaatacttacattatcatgagaacattgtcaagggcattctgatacgggccttccatcgcaagaaaaaggcagcaacggactgagggacggagagagttacggcataagaagtagtaggagagcagagtgtcataaagttatattattctcgtcctaaagtcaattagttctgttgcgcttgacaatatatgtcgtgtaataccgtcccttagcagaagaaagaaagacggatccatatatgttaaaatgcttcagagatgtttctttaatgtgccgtccaacaaaggtatcttctgtagcttcctctattttcgatcagatctcatagtgagaaggcgcaattcagtagttaaaagcggggaacagtgtgaatccggagacggcaagattgcccggccctttttgcggaaaagataaaacaagatatattgcactttttccaccaagaaaaacaggaagtggattaaaaaatcaacaaagtataacgcctattgtcccaataagcgtcggttgttcttctttattattttaccaagtacgctcgagggtacattctaatgcattaaaagacatgagtaatcctcaaaaagctctaaacgactttctgtccagtgaatctgttcatacacatgatagttctaggaaacaatctaataagcagtcatccgacgaaggacgctcttcatcacaaccttcacatcatcactctggtggtactaacaacaataataacaataataataataataataacagtaacaacaacaacaacggcaacgatgggggaaatgatgacgactatgattatgaaatgcaagattatagaccttctccgcaaagtRcgcggcctactcccacgtatgttccacaatattctgtagaaagtgggactgctttcccgattcaagaggttattcctagcgcatacattaacacacaagatataaaccataaagataacggtccgccgagtgcaagcagtaatagagcatteaggcctagagggcagaccacagtgtcggccaacgtgcttaacattgaagatttttacaaaaatgcagacgatgcgcataccatcccggagtcacatttatcgagaaggagaagtaggtcgagggctacgagtaatgctgggcacagtgccaatacaggcgccacgaatggcaggactactggtgcccaaactaatatggaaagcaatgaatcaccacgtaacgtccccattatggtgaagccaaagacattataccagaaccctcaaacacctacagtcttgccctccacataccatccaattaataaatggtcttccgtcaaaaacacttatttgaaggaatttttagccgagtttatgggaacaatggttatgattattttcggtagtgctgttgtttgtcaggtcaatgttgctgggaaaatacagcaggacaatttcaacgtggctttggataaccttaacgttaccgggtcttctgcagaaacgatagacgctatgaagagtttaacatccttggtttcatccgttgcgggcggtacctttgatgatgtggcattgggctgggctgctgccgtggtgatgggctatttctgcgctggtggtagtgccatctcaggtgctcatttgaatccgtctattacattagccaatttggtgtatagaggttttcccctgaagaaagttccttattactttgctggacaattgatcggtgccttcacaggcgctttgatcttgtttatttggtacaaaagggtgttacaagaggcatatagcgattggtggatgaatgaaagtgttgcgggaatgttttgcgtttttccaaagccttatctaagttcaggacggcaatttttttccgaatttttatgtggagctatgttacaagcaggaacatttgcgctgaccgatccttatacgtgtttgtcctctgatgttttcccattgatgatgtttattttgattttcattatcaatgcttccatggcttatcagacaggtacagcaatgaatttggctcgtgatctgggcccacgtcttgcactatatgcagttggatttgatcataaaatgctttgggtgcatcatcatcatttcttttgggttcccatggtaggcccatttattggtgcgttaatgggggggttggtttacgatgtctgtatttatcagggtcatgaatctccagtcaactggtctttaccagtttataaggaaatgattatgagagcctggtttagaaggcctggttggaagaagagaaatagagcaagaagaacatcggacctgagtgacttctcatacaataacgatgatgatgaggaatttggagaaagaatggctcttcaaaagacaaagaccaagtcatctatttcagacaacgaaaatgaagcaggagaaaagaaagtgcaatttaaatctgttcagcgcggcaaaagaacgtttggtggtataccaacaattcttgaagaagaagattccattgaaactgcttcgctaggtgcgacgacgactgattctattgggttatccgacacatcatcagaagattcgcattatggtaatgctaagaaggtaacatgagaaaacagacaagaaaaagaaacaaataatatagactgatagaaaaaaatactgcttactaccgccggtataatatatatatatatatatatttacatagatgattgcatagtgttttaaaaagctttcctaggttaagctatgaatcttcataacctaaccaactaaatatgaaaatactgacccatcgtcttaagtaagttgacatgaactcagcctggtcacctactatacatgatgtatcgcatggatggaaagaataccaaacgctaccttccaggttaatgatagtatccaaacctagttggaatttgccttgaacatcaagcagcgattcgatatcagttgggagcatcaatttggtcattggaataccatctatgcttttctcctcccatattcgcaaaagtagtaagggctcgttatatacttttgaatatgtaagatataattctatatgatttagtaatttattttctatacgctcagtatttttctgcagttgtcgagtaggtattaaacgcaaaagaagtccatccttttcatcattcaaatggacatcttggcaaagggcccagttatggaaaatctgggagtcatacaacgattgcagttggctatgccactcctggtaaggaatcatcaagtctgataattctgttttttagccctttttttttttttttcatggtgttctcttctcattgcttttcaattttaagttcgttacctttcatatagagtttcttaacagaaatttcacaacgaaaatataattaactacaggca
[0173]釀酒酵母FPSl (氨基酸；SEQ ID NO: 2):
[0174]丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)
[0175]丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化通過丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)來進行。在大腸桿菌中，PFL是負責產生甲酸的主要酶。PFL是需要激活性酶PflAE (其由pf IA編碼)、活性的S-腺苷甲硫氨酸和單電子供體的PflB的二聚體。參見Waks, Z.和Silver, P.A.，Appl.Env.Microbiol.75:1867-1875 (2009)。Waks和Silver工程化了釀酒酵母的菌株以分泌甲酸(通過添加來自大腸桿菌的PFL和AdhE和缺失內源甲酸脫氫酶)并使用大腸桿菌在兩步驟法中產生氫。然而，Waks和Silver未將甲酸產生與甘油形成的除去組合，甲酸用作用于甘油還原的交替電子受體的用途未被提出或評價。
[0176]用于本發(fā)明的重組宿主細胞的PFL酶可來自細菌或真核生物來源。細菌PFL的實例包括但不限于地衣芽胞桿菌DSM13、地衣芽胞桿菌ATCC14580、嗜熱鏈球菌CNRZ1066、嗜熱鏈球菌LMG18311、嗜熱鏈球菌L MD-9、胚芽乳桿菌WCFSl (基因登錄號lp_2598)、胚芽乳桿菌WCFSl (基因登錄號lp_3313)、胚芽乳桿菌JDMl (基因登錄號JDM1_2695)、胚芽乳桿菌JDMl (基因登錄號JDM1_2087)、干酪乳桿菌bl23、干酪乳桿菌ATCC334、青春雙岐桿菌、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum) NCC2705、長雙歧桿菌DJ010A、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)DSM10140、解纖維素梭菌或大腸桿菌。另外的PFL酶可來自PFLl家族、RNR pfl超家族或PFL2超家族。
[0177]來自細菌的pflA序列包括:
[0178]地衣芽胞桿菌DSMl3 (核苷酸；SEQ ID NO: 3):
[0179]地衣芽胞桿菌DSM13(氨基酸；SEQ ID NO:4):
[0180]地衣芽胞桿菌ATCC14580(核苷酸；SEQ ID NO: 5):
[0181]地衣芽胞桿菌ATCC14580(氨基酸；SEQ ID NO: 6):
[0182]嗜熱鏈球菌CNRZ1066(核苷酸；SEQ ID NO: 7):
[0183]嗜熱鏈球菌CNRZ1066(氨基酸；SEQ ID NO:8):
[0184]嗜熱鏈球菌LMG18311 (核苷酸；SEQ ID NO:9):
[0185]嗜熱鏈球菌LMG18311 (氨基酸；SEQ ID NO: 10):
[0186]嗜熱鏈球菌LMD-9 (核苷酸；SEQ ID NO: 11):
[0187]嗜熱鏈球菌LMD-9 (氨基酸；SEQ ID NO: 12):
[0188]胚芽乳桿菌WCFSl (基因登錄號:lp_2596)(核苷酸；SEQ ID NO: 13):
[0189]胚芽乳桿菌WCFSl (基因登錄號:lp_2596)(氨基酸；SEQ ID NO: 14):
[0190]胚芽乳桿菌WCFSl (基因登錄號:lp_3314)(核苷酸；SEQ ID NO: 15):
[0191]胚芽乳桿菌WCFSl (基因登錄號:lp_3314)(氨基酸；SEQ ID NO: 16):
[0192]胚芽乳桿菌JDMl (基因登錄號:JDM1_2660)(核苷酸；SEQ ID NO: 17):
[0193]胚芽乳桿菌JDMl (基因登錄號:JDM1_2660)(氨基酸；SEQ ID NO: 18):
[0194]胚芽乳桿菌JDMl (基因登錄號:JDM1_2085)(核苷酸；SEQ ID NO: 19):
[0195]胚芽乳桿菌JDMl (基因登錄號:JDM1_2085)(氨基酸；SEQ ID NO: 20):
[0196]干酪乳桿菌bl23(核苷酸；SEQ ID NO: 21):
[0197]干酪乳桿菌bl23(氨基酸；SEQ ID NO:22):
[0198]干酪乳桿菌ATCC334(核苷酸；SEQ ID NO: 23):
[0199]干酪乳桿菌ATCC334 (氨基酸；SEQ ID NO: 24):
[0200]青春雙岐桿菌(核苷酸；SEQ ID NO:25):
[0201]青春雙岐桿菌(氨 基酸；SEQ ID NO:26):
[0202]長雙歧桿菌NCC2705 (核苷酸；SEQ ID NO: 27):
[0203]長雙歧桿菌NCC2705 (氨基酸；SEQ ID NO: 28):
[0204]長雙歧桿菌DJ010A(核苷酸；SEQ ID NO: 29):
[0205]長雙歧桿菌DJ010A(氨基酸；SEQ ID NO: 30):
[0206]動物雙歧桿菌DSMlO 140(核苷酸；SEQ ID N0:31):
[0207]動物雙歧桿菌DSMlO 140(氨基酸；SEQ ID NO:32):
[0208]解纖維素梭菌(核苷酸；SEQ ID NO:33):
[0209]解纖維素梭菌(氨基酸；SEQ ID NO:34):
[0210]大腸桿菌(核苷酸；SEQ ID NO:35):
[0211]大腸桿菌(氨基酸；SEQ ID NO:36):
[0212]來自細菌的pflB序列包括:[0213]地衣芽胞桿菌DSM13(核苷酸；SEQ ID NO:37):
[0214]地衣芽胞桿菌DSM13(氨基酸；SEQ ID NO:38):
[0215]地衣芽胞桿菌ATCC14580(核苷酸；SEQ ID NO:39):
[0216]地衣芽胞桿菌ATCC14580(氨基酸；SEQ ID NO:40):
[0217]嗜熱鏈球菌CNRZ1066(核苷酸；SEQ ID NO:41): [0218]嗜熱鏈球菌CNRZ1066(氨基酸；SEQ ID NO:42):
[0219]嗜熱鏈球菌LMG18311 (核苷酸；SEQ ID NO:43):
[0220]嗜熱鏈球菌LMG18311 (氨基酸；SEQ ID NO:44):
[0221]嗜熱鏈球菌LMD-9 (核苷酸；SEQ ID NO: 45):
[0222]嗜熱鏈球菌LMD-9 (氨基酸；SEQ ID NO: 46):
[0223]胚芽乳桿菌WCFSl (基因登錄號lp_2598)(核苷酸；SEQ ID NO:47):
[0224]胚芽乳桿菌WCFSl (基因登錄號lp_2598)(氨基酸；SEQ ID NO: 48):
[0225]胚芽乳桿菌WCFSl (基因登錄號:lp_3313)(核苷酸；SEQ ID NO:49):
[0226]胚芽乳桿菌WCFSl (基因登錄號:lp_3313)(氨基酸；SEQ ID NO:50):
[0227]胚芽乳桿菌JDMl (基因登錄號:JDM1_2695)(核苷酸；SEQ ID NO: 51):
[0228]胚芽乳桿菌JDMl (基因登錄號:JDM1_2695)(氨基酸；SEQ ID NO:52):
[0229]胚芽乳桿菌JDMl (基因登錄號:JDM1_2087)(核苷酸；SEQ ID NO: 53):
[0230]胚芽乳桿菌JDMl (基因登錄號:JDM1_2087)(氨基酸；SEQ ID NO:54):
[0231]干酪乳桿菌bl23(核苷酸；SEQ ID NO:55):
[0232]干酪乳桿菌bl23(氨基酸；SEQ ID NO: 56):
[0233]干酪乳桿菌ATCC334(核苷酸；SEQ ID NO:57):
[0234]干酪乳桿菌ATCC334 (氨基酸；SEQ ID NO: 58):
[0235]青春雙岐桿菌(核苷酸；SEQ ID NO:59):
[0236]青春雙岐桿菌(氨基酸；SEQ ID NO:60):
[0237]長雙歧桿菌NCC2705(核苷酸；SEQ ID N0:61):
[0238]長雙歧桿菌NCC2705 (氨基酸；SEQ ID NO: 62):
[0239]長雙歧桿菌DJ010A(核苷酸；SEQ ID NO:63):
[0240]長雙歧桿菌DJ010A(氨基酸；SEQ ID NO:64):
[0241]動物雙歧桿菌DSMlO 140(核苷酸；SEQ ID NO:65):
[0242]動物雙歧桿菌DSMlO 140(氨基酸；SEQ ID NO:66):
[0243]解纖維素梭菌(核苷酸；SEQ ID NO:67):
[0244]解纖維素梭菌(氨基酸；SEQ ID NO:68):
[0245]大腸桿菌(核苷酸；SEQ ID NO:69):
[0246]大腸桿菌(氨基酸；SEQ ID NO:70):
[0247]真核生物PFL的實例包括但不限于萊茵衣藻Pf IAl、單鞭毛菌屬E2或新麗鞭毛菌、Acetabularia acetabulum、雨生紅球藻、團藻(Volvox carteri)、海洋真核微藻、綠色鞭毛藻(Ostreococcus Iucimarinus)、金藻(Micromonas pusilla)、微單胞菌屬(Micromonas sp.)、壇紫菜和藍載藻(Cyanophora paradoxa))、后鞭毛生物(寄生變形毛菌(Amoebidium parasiticum) )、amoebozoan (Mastigamoeba balamuthi)、原生藻菌(stramenopile)(假微型海鏈藻(Thalassiosira pseudonana) (2))和粘著植物(haptophyte)(小定鞭金藻(Prymnesium parvum))、M.pusilla、微單胞菌屬海洋真核微藻(0.tauri)和綠藻(0.lucimarinus)), amoebozoan (M.balamuthi)和原生藻菌(假微型海鏈藻(T.pseudonana)) 0 參見 Stairs, C.W.，等人，〃Eukaryotic pyruvate formate lyaseand its activating enzyme were acquired laterally from a firmicute, 〃Mol.Biol,and Evol.,于 2011 年 2 月 3 日在 http://mbe.0xfordjournals.0rg/ 上在線出版的。
[0248]來自真核生物的pflA序列包括: [0249]萊茵衣藻PflAl (核苷酸；SEQ ID NO: 71):
[0250]萊茵衣藻PflAl (氨基酸；SEQ ID NO:72):
[0251]新麗鞭毛菌(核苷酸；SEQ ID NO:73):
[0252]新麗鞭毛菌(氨基酸；SEQ ID NO:74):
[0253]來自真核生物的pfll序列包括:
[0254]萊茵衣藻PflA(核苷酸；SEQ ID NO: 75):
[0255]萊茵衣藻PflA(氨基酸；SEQ ID NO: 76):
[0256]單鞭毛菌屬E2 (核苷酸；SEQ ID NO: 77):
[0257]單鞭毛菌屬E2 (氨基酸；SEQ ID NO: 78):
[0258]新麗鞭毛菌(核苷酸-部分CDS，失去起始；SEQ ID NO:79):
[0259]新麗鞭毛菌(氨基酸-部分CDS，失去起始；SEQ ID NO:80):
[0260]乙醛/醇脫氫酶
[0261]乙醛脫氫酶、醇脫氫酶和/或雙功能乙醛/醇脫氫酶至細胞中的工程化可增加乙醇的產量。然而，因為乙醇的產生是氧化還原中性的，因此乙醛/醇脫氫酶活性不能用作甘油的產生給無氧代謝中的細胞提供的氧化還原平衡的替代。當Medina試圖在釀酒酵母gpdl/2缺失菌株中表達來自大腸桿菌的乙醒脫氫酶mhpF時，菌株在葡萄糖作為唯一碳源存在的情況下在缺氧條件下不生長。Medina, V.G.，等人，Appl.Env.Microbiol.76:190-195(2010);也參見EP2277989。相反地，甘油缺失菌株的厭氧生長需要醋酸的存在。然而，乙醛脫氫酶從未與PFL組合表達或用本發(fā)明的重組宿主細胞表達。此外，用改善的乙醛脫氫酶或使用雙功能乙醛/醇脫氫酶(AADH)替代內源乙醛脫氫酶可積極地影響反應的體內動力學，從而提供改善的宿主菌株生長。
[0262]用于本發(fā)明的重組宿主細胞的AADH酶可來自細菌或真核細胞來源。細菌AADH的實例包括但不限于Clostridium phytofermentans、大腸桿菌、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、緩慢芽抱桿菌(Bacillus lentus)、地衣芽胞桿菌、短小芽抱桿菌(Bacillus pumilus)、枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)、嗜淀粉擬桿菌(Bacteroides amylophiIus)、多毛擬桿菌(Bacteroides capillosus)、棲瘤胃擬桿菌(Bacteroides ruminocola)、豬擬桿菌(Bacteroides suis)、青春雙岐桿菌、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animalis)、兩岐雙岐桿菌(Bifidobacterium bifidum)、嬰兒雙岐桿菌(Bifidobacterium infantis)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、嗜熱雙歧桿菌(Bifidobacterium thermophilum)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、短小乳桿菌(Lactobacillus brevis)、布赫納乳桿菌(Lactobacillus buchneri)(僅牛)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、干酪乳桿菌、纖維二糖乳桿菌(Lactobacillus cellobiosus)、彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbruekii)、香腸乳桿菌(Lactobacillus farciminis)(僅豬)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、乳酸乳桿菌(Lactobacillus lactis)、胚芽乳桿菌、羅特氏乳桿菌(Lactobacillus reuterii)、腸膜樣明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilacticii)、戍糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、酸丙酸桿菌(Propionibacteriumacidpropionici)(僅牛)、費氏丙酸桿菌(Propionibacterium freudenreichii)、株薛氏丙酸桿菌(Propionibacterium shermanii)、Enterococcus cremoris、二丁酮腸球菌(Enterococcus diacetylactis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)、中間型腸球菌(Enterococcus intermedius)、乳酸腸球菌(Enterococcus lactis)或嗜熱腸球菌(Enterococcus thermophilus)。 [0263]AdhE細菌序列包括:
[0264]Clostridium phytofermentans (核苷酸；SEQ ID N0:81):
[0265]Clostridium phytofermentans (氨基酸；SEQ ID NO:82):
[0266]大腸桿菌(核苷酸；SEQ ID NO:83):
[0267]大腸桿菌(氨基酸；SEQ ID NO:84):
[0268]青春雙岐桿菌(氨基酸；SEQ ID NO: 100):
[0269]凝結芽孢桿菌(氨基酸；SEQ ID NO: 101):
[0270]地衣芽胞桿菌(氨基酸；SEQ ID NO:102):
[0271]屎腸球菌(Enterococcusfaecium) TX1330 (氨基酸；SEQ ID NO: 103):
[0272]真核細胞AdhE的實例包括但不限于萊茵衣藻AdhE、單鞭毛菌屬E2或新麗鞭毛菌。
[0273]來自真核細胞的AdhE序列包括:
[0274]萊茵衣藻AdhE (核苷酸；SEQ ID NO: 85):
[0275]萊茵衣藻AdhE (氨基酸；SEQ ID NO: 86):
[0276]單鞭毛菌屬E2 (核苷酸；SEQ ID NO: 87):
[0277]單鞭毛菌屬E2 (氨基酸；SEQ ID NO: 88):
[0278]聯(lián)合生物加工
[0279]聯(lián)合生物加工(CBP)是纖維質生物質的加工策略，其包括將4個生物介導的事件:酶產生、水解、己糖發(fā)酵和戊糖發(fā)酵合并成單個過程。執(zhí)行該策略需要開發(fā)利用纖維素、半纖維素和其它生物質組分同時還以充分高的產率和濃度產生目的產物的微生物。CBP的可行性得到動力學和生物能分析的支持。參見van Walsum和Lynd(1998)Biotech.Bioeng.58:316。
[0280]CBP提供了相較于以專用糖解酶生產為特征的方法具有更低成本和更高效率的可能性。益處部分產生于避免的資金成本、底物和其它原料以及與糖解酶產生相關的效用。此外，幾個因素支持更高水解率的實現(xiàn)，從而減少的使用CBP的反應器體積和資本投資，包括酶-微生物協(xié)同作用和嗜溫生物和/或復合糖解系統(tǒng)的使用。此外，附著纖維素的分解纖維素微生物可能成功地與非附著微生物例如污染物競爭纖維素水解產物，這可增加基于微生物纖維素利用的工業(yè)過程的穩(wěn)定性。開發(fā)能夠進行CBP的微生物的進展正通過兩個策略來進行:工程化天然存在的糖解微生物以改善產物相關性質，例如產率和滴度；和工程化顯示高成品收率和滴度的非糖解微生物以表達使得能夠利用淀粉、纖維素和半纖維素的異源糖解酶系統(tǒng)。
[0281]淀粉和纖維素降解
[0282]淀粉至組分糖單元的降解通過淀粉分解酶進行。淀粉酶是存在于人唾液中的淀粉分解酶的實例，在唾液中其開始化學降解過程。胰腺也產生淀粉酶(α淀粉酶)來將飲食淀粉水解成二糖和三糖，所述二糖和三糖被其它酶轉化成葡萄糖來給身體提供能量。植物和一些細菌也產生淀粉酶。淀粉酶是糖苷水解酶并且作用于α-1，4_糖苷鍵。 [0283]幾種淀粉分解酶參與淀粉水解。α -淀粉酶(EC3.2.1.1)(另名:1，4_ a -D-葡聚糖葡萄糖水解酶；糖原酶)是鈣金屬酶，即，在鈣不存在的情況下完全不能作用。通過在沿著淀粉鏈的隨機位置上作用，α -淀粉酶分解長鏈碳水化合物，最終從直鏈淀粉產生麥芽三糖和麥芽糖，或從支鏈淀粉產生麥芽糖、葡萄糖和"極限糊精〃。因為其可在底物上任何地方作用，因此α-淀粉酶傾向于比β_淀粉酶更快地作用。淀粉酶的另一種形式β_淀粉酶(EC3.2.1.2)(別名:1，4- a -D-葡聚糖麥芽糖水解酶；糖原酶；糖原淀粉酶)催化第二 α-1，4糖苷鍵水解，一次切除2個葡萄糖單元(麥芽糖)。第三淀粉酶是Y-淀粉酶(EC3.2.1.3)(別名:葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶；淀粉葡糖苷酶；外切_1，4_ α -葡糖苷酶；葡糖淀粉酶；溶酶體α -葡糖苷酶；1，4- a -D-葡聚糖葡糖水解酶)。除了切割直鏈淀粉和支鏈淀粉的非還原末端上的最后一個α (1-4)糖苷鍵，產生葡萄糖外，Y-淀粉酶還將切割α (1-6)糖苷鍵。
[0284]第四酶α-葡糖苷酶作用于由α-、β_和Y _淀粉酶產生的麥芽糖和其它短的麥芽寡糖，將它們轉化成葡萄糖。
[0285]3個主要類型的酶促活性降解天然纖維素。第一類型是內切葡聚糖酶(I, 4-β -D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶；EC3.2.1.4)。內切葡聚糖酶在無定形纖維素的纖維素多糖鏈上隨機切割，從而產生不同長度的寡聚糖和從而新的鏈末端。第二類型是外切葡聚糖酶，包括纖維糊精酶(1，4-β -D-葡聚糖葡聚糖水解酶；EC3.2.1.74)和纖維二糖水解酶(1，4-β -D-葡聚糖纖維二糖水解酶；EC3.2.1.91)。外切葡聚糖酶以持續(xù)方式作用于纖維素多糖鏈的還原或非還原末端，釋放葡萄糖(葡聚糖水解酶)或纖維二糖(纖維二糖水解酶)作為主要產物。外切葡聚糖酶還可作用于微晶纖維素，假定地從微晶結構剝離纖維素鏈。第三類型是β -葡糖苷酶(β -葡糖苷葡糖水解酶；EC3.2.1.21)。β -葡糖苷酶將可溶性纖維糊精和纖維二糖水解成葡萄糖單元。
[0286]即使先前已公開了表達用于從谷?；虻矸郛a生燃料乙醇的酶的酵母菌株，但因所得菌株相對較弱的產生/耐受高水平乙醇的能力，該應用在基于谷粒的燃料乙醇工業(yè)中仍未商業(yè)化。例如，美國專利號7，226，776公開了表達乙醇原的多糖酶可從碳水化合物聚合物直接產生乙醇，但顯示的最大乙醇滴度為3.9g/l。美國專利號5，422，267公開了酵母中的葡糖淀粉酶用于產生酒精性飲料的用途；然而，未公開乙醇的商業(yè)相關滴度。
[0287]異源糖解酶
[0288]根據(jù)本發(fā)明的方面，本發(fā)明的重組微生物的異源糖解酶的表達可有利地用于從生物質來源產生產物例如乙醇。例如，可異源地表達來自多種來源的纖維素酶以成功地增加乙醇產生的效率。糖解酶可來自真菌、酵母、細菌、植物、原生動物或白蟻來源。在一些實施方案中，糖解酶來自灰腐質霉(H.grisea)、嗜熱子囊茵、埃默森籃狀菌(T.emersonii)、里氏木霉、澳洲乳白蟻(C.lacteus)、臺灣乳白蟻(C.formosanus)、高山象白蟻(N.takasagoensis)、澳大利亞矛顎家白蟻(C.acinaciformis)、達爾文澳白蟻(M.darwinensis)、N.walker1、扣囊復膜酵母、C.lucknowense、黃胸散白蟻(R.speratus)、嗜熱放線菌、熱纖梭菌、解纖維素梭菌、約氏梭菌、短小芽孢桿菌、糞堿纖維單胞菌、多糖降角軍菌、Piromyces equi1、Neocallimastix patricarum 或擬南芥。 [0289]在一些實施方案中，用于在本發(fā)明的重組微生物中表達的纖維素酶是共同未決的國際申請?zhí)朠CT/US2011/039192 (通過引用并入本文)的表4或7中公開的任何纖維素酶，或適合用于在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_的任何纖維素酶。在其它實施方案中，用于在本發(fā)明的重組微生物中表達的淀粉酶是任何淀粉酶例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、支鏈淀粉酶或異支鏈淀粉酶旁系同源物或直系同源物、共同未決的國際申請?zhí)朠CT/US2011/039192(通過引用并入本文)的表15-19中(優(yōu)選表19中)公開的任何淀粉酶，或適合用于在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_的任何淀粉酶。在本發(fā)明的一些實施方案中，在相同的重組微生物中共表達來自單個生物體的多個糖解酶。在本發(fā)明的一些實施方案中，在相同的重組微生物中共表達來自不同生物體的多個糖解酶。具體地，可在相同的重組微生物中共表達來自2、3、4、5、6、7、8、9或更多個生物體的糖解酶。類似地，本發(fā)明可包括酵母菌株的共培養(yǎng)，其中酵母菌株表達不同的糖解酶。共培養(yǎng)可包括表達來自相同生物體或來自不同生物體的異源糖解酶的酵母菌株。共培養(yǎng)物可包括來自2、3、4、5、6、7、8、9或更多個生物體的表達糖解酶的酵母菌株。
[0290]用于本發(fā)明的重組微生物中表達的木質纖維素酶包括內切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶。用于在本發(fā)明的重組微生物中表達的其它木質纖維素酶包括可作用于木質纖維素材料的輔助酶。木質纖維素酶可以是例如內切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纖維二糖水解酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、木糖苷酶、木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖酶、半乳糖苷酶、纖維二糖磷酸化酶、纖維糊精磷酸化酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木葡聚糖酶、木聚糖內切酶、葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖水解酶、膨脹素(swollenins)、葡糖醒酸酯酶、擴展蛋白、果膠酶和阿魏酰酯酶。在一些實施方案中，本發(fā)明的木質纖維素酶可以是用于降解期望的木質纖維素材料的任何適當?shù)拿浮?br> [0291]在本發(fā)明的某些實施方案中，木質纖維素酶可以是內切葡聚糖酶、葡糖苷酶、纖維二糖水解酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、木糖苷酶、木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖酶、半乳糖苷酶、纖維二糖磷酸化酶、纖維糊精磷酸化酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、木葡聚糖酶、木聚糖內切酶、葡糖醛酸糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿拉伯呋喃糖水解酶、膨脹素(swollenins)、葡糖醛酸酯酶、擴展蛋白、果膠酶和阿魏酰酯酶旁系同源物或直系同源物。在具體實施方案中，木質纖維素酶來源于共同未決的國際申請?zhí)朠CT/US2011/039192(通過引用并入本文)的表4和7中命名的任何物種。
[0292]木糖代謝
[0293]木糖是可被多種生物代謝成有用的產物的五碳單糖。存在兩個主要的木糖代謝途徑，每一個途徑在它們利用的特征酶上是獨特的。一個途徑稱為〃木糖還原酶-木糖醇脫氫酶"或XR-XDH途徑。木糖還原酶(XR)和木糖醇脫氫酶(XDH)是用于該木糖降解的方法的兩種主要的酶。由XYLl基因編碼的XR負責木糖至木糖醇的還原，并且借助于輔因子NADH或NADPH。隨后木糖醇被XDH (所述XDH通過XYL2基因表達)氧化成木酮糖，并且專門地利用輔因子NAD+來實現(xiàn)。由于該途徑需要不同的輔因子以及它們可被使用所達到的程度，不平衡可導致木糖醇副產品的過量產生以及期望的乙醇的無效產生。已在實驗室中測試了XR和XDH酶水平的不同表達以試圖最優(yōu)化木糖代謝途徑的效率。
[0294]木糖代謝的另一個途徑稱為〃木糖異構酶"(XI)途徑。酶XI負責木糖至木酮糖的直接轉化，并且不通過木糖醇中間產物來進行。兩個途徑都產生木酮糖，盡管使用的酶不同。在木酮糖產生后，XR-XDH和XI途徑通過由基因XKSl編碼的酶木酮糖激酶(XK)進行，以進一步將木酮糖修飾 成木酮糖-5-磷酸，隨后其進入磷酸戊糖途徑以進一步分解代謝。
[0295]關于在木糖代謝過程中通過磷酸戊糖途徑的流的研究已顯示限制該步驟的速度可有益于至乙醇的發(fā)酵的效率?？商岣咭掖籍a量的對該流的修飾包括a)降低磷酸葡糖異構酶活性，b)刪除GNDl基因，和c)刪除ZWFl基因(J印psson等人，Appl.Environ.Microbiol.68:1604-09(2002)) ο由于磷酸戊糖途徑在代謝過程中產生額外的NADPH，因此限制該步驟可幫助修正NAD(P)H與NAD+輔因子之間的已很明顯的不平衡并減少木糖醇副產物。比較兩個木糖代謝途徑的另一個實驗顯示XI途徑最能夠代謝木糖以產生最大乙醇產率，然而XR-XDH途徑達到快得多的乙醇產生速率(Karhumaa等人，Microb CellFact.2007Feb5;6:5)。也參考國際公布號W02006/009434，通過引用將其整體并入本文。
[0296]在一些實施方案中，本發(fā)明的重組微生物具有使用上述酶的一種或多種代謝木糖的能力。
[0297]阿拉伯糖代謝
[0298]阿拉伯糖是可被多種生物代謝成有用的產物的五碳單糖。L-阿拉伯糖經發(fā)現(xiàn)廣泛地分布在不同植物組織的許多雜多糖例如阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖、木聚糖和阿拉伯木聚糖中。土壤中的芽孢桿菌屬的種類參與植物材料分解的早期，枯草芽孢桿菌分泌3種酶，內切阿拉伯聚糖酶和兩種阿拉伯糖苷酶，所述酶能夠從植物細胞釋放阿拉伯糖基寡聚物和L-阿拉伯糖。
[0299]微生物的L-阿拉伯糖代謝的3個途徑已進行了描述。許多細菌，包括大腸桿菌，使用阿拉伯糖異構酶(AraA;E.C.5.3.1.4)，核酮糖激酶(AraB ;E.C.2.7.1.16)和磷酸核酮糖差向異構酶(AraD ；E.C.5.1.3.4)來相繼地將L-阿拉伯糖通過L-核酮糖和L-核酮糖5-磷酸轉化成D-木酮糖-5-磷酸。參見，例如，Sa-Nogueira I,等人，Microbiologyl43:957 - 69(1997)。D-木酮糖_5_磷酸隨后進入磷酸戊糖途徑以進一步分解代謝。在第二途徑中，L-阿拉伯糖通過阿拉伯糖脫氫酶(ADH)、阿拉伯糖酸內酯(AL)和阿拉伯糖酸脫水酶(AraC)的連續(xù)作用轉化成L-2-酮-3-脫氧阿糖酸酯(L-KDA)。參見，例如，Watanabe, S，等人，J.Biol.Chem.281:2612-2623 (2006)。L-KDA 還可在兩個替代途徑中被代謝:1) L-KDA通過L-KDA脫水酶和KGSA脫氫酶經2-酮戊二半醛(KGSA)至2-酮戊二酸的轉化，或2) L-KDA通過L-KDA醛縮酶至丙酮酸和羥基乙醛的轉化。在第三真菌途徑中,L-阿拉伯糖通過酶例如NAD (P) H-依賴性醛糖還原酶(AR)、L_阿拉伯糖醇4-脫氫酶(ALDH)、L-木酮糖還原酶(LXR)、木糖醇脫氫酶(XylD)和木酮糖激酶(XylB)經由L-阿拉伯糖醇、L-木酮糖和木糖醇轉化成D-木酮糖-5-磷酸。這些和其它參與阿拉伯糖代謝和調控的蛋白質可見于 http://www.nmpdr.0rg/FIG/wiki/rest.cgi/NmpdrPlugin/SeedViewer ?P age=Subsystems; subsystem=L_Arabinose_utilization, 2011 年 3 月 21 日訪問的，將其通過引用整體并入本文。[0300]AraC蛋白調節(jié)其自己合成和Ara系統(tǒng)的其它基因的表達。參見Schleif, R., Trends Genet.16 (12): 559-65 (2000)。在大腸桿菌中，AraC 蛋白正和負調節(jié)L-阿拉伯糖的攝取和分解代謝所需的蛋白質的表達。AraC的同源物例如鼠李糖操縱子的調控蛋白RhaR和RhaS已被鑒定，其包含與AraC的DNA結合結構域同源的區(qū)域(Leal, T.F.和 de Sa-Nogueira, 1., FEMS Microbiol Lett.241(I):41-48(2004)) ?這樣的阿拉伯糖調控蛋白稱為AraC/XylS家族。也參見，Mota, L.J.,等人，Mol.Microbiol.33(3):476-89(1999) ；Mota, L.J.,等人，J Bacteriol.183(14):4190-201(200I)。 [0301]在大腸桿菌中，L-阿拉伯糖穿過大腸桿菌胞質膜的轉運需要高親和力轉運操縱子araFGH、低親和力轉運操縱子上的結合蛋白依賴性系統(tǒng)araE、質子協(xié)同轉運蛋白的表達。其它阿拉伯糖轉運蛋白包括馬克斯克魯維酵母和季也蒙畢赤酵母鑒定的，美國專利號7，846，712 (將其通過引用并入本文)中公開的那些阿拉伯糖轉運蛋白。
[0302]在一些實施方案中，本發(fā)明的重組微生物具有使用一種或多種上述酶代謝阿拉伯糖的能力。
[0303]微生物
[0304]本發(fā)明包括多個用于開發(fā)具有進行CBP所需的底物利用與產物形成性質的組合的微生物的策略。"天然纖維素分解策略"包括工程化天然存在的纖維素分解性微生物來改善產物相關性質，例如產率和滴度?！ㄖ亟M纖維素分解策略〃包括工程化顯示高產品收率和滴度的天然非纖維素分解性微生物，以表達使得能夠利用纖維素或半纖維素或兩者的異源纖維素酶系統(tǒng)。
[0305]許多細菌具有通過糖酵解過程將簡單己糖發(fā)酵成酸性和pH中性產物的能力。糖酵解途徑是冗余的，并且包括一系列酶促步驟，通過所述步驟六碳葡萄糖分子通過多個中間產物分解成兩個分子的三碳化合物丙酮酸。該過程導致ATP (生物能提供)和還原型輔因子NADH的凈產生。
[0306]丙酮酸是代謝的重要中間化合物。例如，在好氧條件下，丙酮酸可被氧化成乙酰輔酶A(乙酰-CoA)，其隨后進入三羧酸循環(huán)(TCA)，這繼而產生合成前體、CO2和還原型輔因子。隨后輔因子通過將氫當量經由一系列酶促步驟捐贈給氧而被氧化，從而導致水和ATP的形成。該能量形成過程稱為氧化磷酸化。
[0307]在缺氧條件下(無可獲得的氧)，發(fā)酵發(fā)生，其中有機化合物的降解產物用作氫供體和受體。來自糖酵解的過量NADH在牽涉有機底物的還原的反應中被氧化成產物，例如乳酸鹽和乙醇。此外,ATP在稱為底物水平磷酸化的過程中從有機酸例如醋酸的產生再生。因此，糖酵解和丙酮酸代謝的發(fā)酵產物包括多種有機酸、醇和C02。
[0308]大多數(shù)兼性厭氧菌通過丙酮酸脫氫酶(TOH)和三羧酸循環(huán)(TCA)需氧地代謝丙酮酸。在缺氧條件下，用于丙酮酸代謝的主要能量途徑是通過丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)途徑來產生甲酸和乙酰-CoA。隨后將乙酰-CoA通過磷酸乙酸轉移酶(PTA)和乙酸激酶(ACK)轉化成醋酸，共產生ATP，或經乙醛脫氫酶(AOTH)和醇脫氫酶(ADH)還原成乙醇。為了維持還原當量的平衡，在丙酮酸至乳酸鹽的還原過程中，通過乳酸脫氫酶(LDH)將從糖酵解產生的過量NADH再氧化成NAD+。NADH還可在乙酰-CoA至乙醇的還原過程中被A⑶H和ADH再氧化，但這在具有功能性LDH的細胞中是次要反應。[0309]宿主細胞
[0310]用于本發(fā)明的宿主細胞包括任何原核或真核細胞；例如，選自細菌、藻類和酵母細胞的微生物。適合于本發(fā)明的宿主細胞是例如氣單胞菌屬(Aeromonas)、曲霉菌屬(Aspergillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、埃希氏菌屬、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、紅球菌屬(Rhodococcus)、酵母菌屬(Saccharomyces)和鏈霉菌屬(Streptomyces)的微生物。 [0311]在一些實施方案中，宿主細胞是微生物。在一個實施方案中，微生物是酵母。根據(jù)本發(fā)明，酵母宿主細胞可以例如來自酵母菌屬、克魯維酵母屬、假絲酵母屬(Candida)、畢赤酵母屬、裂殖酵母菌屬(Schizosaccharomyces)、漢遜酵母屬(Hansenula)、克勒克酵母屬(Kloeckera)、許旺酵母屬(Schwanniomyces)和子囊菌酵母屬(Yarrowia)。作為宿主細胞的酵母物種可包括例如釀酒酵母、博伊丁酵母、S.barnett1、少孢酵母、葡萄汁酵母、糖化酵母、乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母或脆壁克魯維酵母。在一些實施方案中，酵母選自釀酒酵母、裂殖酵母、白色念珠菌、巴斯德畢赤酵母、樹干畢赤酵母、解脂耶羅維亞酵母、多形漢森酵母、紅發(fā)夫酵母、產朊假絲酵母(Candida utilis)、Arxula adeninivorans、漢遜德巴利酵母、多型德巴利酵母、粟酒裂殖酵母和西方許旺酵母。在一個具體實施方案中，酵母是釀酒酵母。在另一個實施方案中，酵母是耐熱釀酒酵母。根據(jù)本文中的教導，適當?shù)乃拗鞯倪x擇被在本領域技術人員的范圍內。
[0312]在一些實施方案中，宿主細胞是油脂性細胞。油脂性宿主細胞可以是油脂性酵母細胞。例如，油脂性酵母宿主細胞可來自布拉霉屬、念珠菌屬、隱球菌屬、小克銀霉屬、油脂酵母屬、被孢霉菌屬、毛霉菌屬、須霉屬、腐霉菌屬、圓紅冬孢酵母屬、紅酵母屬、毛孢子菌屬或子囊菌酵母屬。根據(jù)本發(fā)明，油脂性宿主細胞可以是油脂性微藻宿主細胞。例如，油脂性微藻宿主細胞可來自破囊壺菌屬(Thraustochytrium)或裂殖壺菌屬(Schizochytrium)。隨后可使用常規(guī)脂質轉酯過程從油脂性生物產生的甘油三酯產生生物柴油。在一些具體實施方案中，油脂性宿主細胞可用于分泌合成的脂質。使用油脂性宿主細胞的實施方案是有利的，因為它們可從木質纖維素原料產生生物柴油，所述原料相對于油料種子底物更便宜，可更稠密地生長，顯示更慢的生命周期二氧化碳發(fā)射，并且可栽種在邊際土地(marginalland)上。
[0313]在一些實施方案中，宿主細胞是耐熱宿主細胞。通過允許外部產生的纖維素酶和產乙醇宿主細胞在相似的溫度范圍內最佳地發(fā)揮性能，耐熱宿主細胞可特別地用于同步糖化和發(fā)酵過程。
[0314]耐熱宿主細胞可包括例如東方伊薩酵母，Pichia mississippiensis,墨西哥畢赤酵母、粉狀畢赤酵母、仙人掌棒孢酵母、葡萄牙棒孢酵母、Candida mexicana、多形漢森酵母和克魯維酵母宿主細胞。在一些實施方案中，耐熱細胞是釀酒酵母菌株或其它酵母菌株，所述酵母菌株經改造適合在高溫下生長，例如通過在抑制細菌生長的高溫下選擇生長來進行。
[0315]在一些具體的實施方案中，宿主細胞是克魯維酵母宿主細胞。例如，克魯維酵母宿主細胞可以是乳酸克魯維酵母、馬克斯克魯維酵母、K.blattae、K.phaffi1、亞羅克魯維酵母、K.aestuari1、K.dobzhanski1、K.wickerhamii>K.thermotoIerans 或克魯雄酵母宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是乳酸克魯維酵母或馬克斯克魯維酵母宿主細胞。在另一個實施方案中，宿主細胞是馬克斯克魯維酵母宿主細胞。
[0316]在一些實施方案中，耐熱宿主細胞可在高于約30°C、約31°C、約32°C、約33°C、約34°C、約35°C、約36°C、約37°C、約38 V、約39 V、約40°C、約41V或約42 V的溫度生長。在本發(fā)明的一些實施方案中，耐熱宿主細胞可在高于30°C、約31°C、約32°C、約33°C、約34°C、約 35°C、約 36°C、約 37°C、約 38°C、約 39°C、約 40°C、約 41°C、約 42°C、或約 43°C、或約 44°C、或約45°C或約50°C的溫度從纖維素產生乙醇。
[0317]在本發(fā)明的一些實施方案中，耐熱宿主細胞可在約30°C至60°C、約30°C至55°C、約30 V至50°C、約40 V至60°C、約40 V至55 V或約40 V至50 V的溫度生長。在本發(fā)明的一些實施方案中，耐熱宿主細胞可在約30°C至60°C、約30°C至55°C、約30°C至50°C、約40°C至60°C、約40°C至55°C或約40°C至50°C的溫度從纖維素產生乙醇。
[0318]在一些實施方案中，宿主細胞具有代謝木糖的能力。關于木糖利用技術的開發(fā)的詳細信息可見于下列出版物:Kuyper M等人FEMS Yeast Res.4:655-64 (2004), Kuyper M等人 FEMS Yeast Res.5:399-409 (2005)和 Kuyper M 等人 FEMS Yeast Res.5:925-34 (2005)(將所述文獻通過引用整體并入本文)。例如，木糖利用可通過異源表達例如來自缺氧真菌單鞭毛菌屬E2的木糖異構酶基因XylA，過表達5個參與木酮糖至糖酵解中間產物的轉化的釀酒酵母酶(木酮糖激酶、核酮糖5-磷酸異構酶、核酮糖5-磷酸表異構酶、轉酮醇酶和轉醛醇酶)和刪除編碼醛糖還原酶的GRE3基因以使木糖醇產量降至最低，來在釀酒酵母中實現(xiàn)。
[0319]在一些實施方案中，宿主細胞具有代謝阿拉伯糖的能力。例如，阿拉伯糖利用可通過異源表達例如阿拉伯糖異構酶、核酮糖激酶或磷酸核酮糖差向異構酶的一種或多種來實現(xiàn)。
[0320]宿主細胞可包含抗生素標記或可以不包含抗生素標記。
[0321]在某些實施方案中，宿主細胞是嗜熱厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacterium)、高溫厭氧桿菌屬(Thermoanaerobacter)、梭菌屬(Clostridium)、土芽孢桿菌屬(Geobacillus)、糖球菌屬(Saccharococcus)、類芽抱桿菌屬(Paenibacillus)、芽抱桿菌屬(Bacillus)、熱解纖維素果汁桿菌屬(Caldicellulosiruptor)、Anaerocellum 或厭氧芽孢桿菌屬(Anoxybaci llus)的微生物。在某些實施方案中，宿主細胞是選自如下的細菌:熱產硫橫熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)、嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium aotearoense)、嗜熱厭氧角軍多糖桿菌(Thermoanaerobacteriumpolysaccharolyticum)、玉米熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium zeae)、木聚糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium xylanolyticum)、解糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium saccharo lyti cum)、布氏嗜熱厭氧細菌(Thermoanaerobiumbrockii)、熱角軍糖熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium thermo saccharo lyti cum)、熱硫化氫高溫厭氧桿菌(Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus)、產乙醇熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)和氏熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterbrocki)、熱纖梭菌(Clostridium thermocellum)、 解纖維素梭菌、Clostridiumphytofermentans > 熱葡糖苷酶地牙抱桿菌(Clostridium straminosolvens)、熱葡糖苷酶芽胞桿菌(Geobacillus thermoglucosidasius)、嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)、Saccharococcus caldoxylosilyticus、喜溫鏈球菌(Saccharoccus thermophilus)、坎皮納斯類芽抱桿菌(Paenibacillus campinasensis)、Bacillus flavothermus、Anoxybacillus kamchatkensis、Anoxybacillus gonensis、Caldicellulosiruptor acetigenus、 Caldicellulosiruptor saccharoIyticus> 熱角軍纖維素果汁桿菌(Caldicellulosiruptor kristjanssonii)、Caldicellulosiruptorowensensis、Caldicellulosiruptor Iactoaceticus 和嗜熱厭氧纖維降解菌(Anaerocellum thermophilum)。在某些實施方案中，宿主細胞是熱纖梭菌、解纖維素梭菌或解糖熱厭氧桿菌。
[0322]密碼最優(yōu)化的多核苷酸 [0323]編碼異源纖維素酶的多核苷酸可以是密碼子優(yōu)化的。本文使用的術語“密碼子優(yōu)化的編碼區(qū)”意思是:通過將至少一個或一個以上或很多個密碼子替換為生物體的基因中更經常使用的一個或多個密碼子，而使核酸編碼區(qū)適應在該給定生物的細胞中的表達。
[0324]一般而言，生物中高度表達的基因偏向于被該生物中最豐富的tRNA種類所識別的密碼子。這種偏向的一種度量是“密碼子適應指數(shù)”或稱“CAI”，其測定在何種程度上，用于編碼特定基因中的每個氨基酸的密碼子是在來自該生物的高度表達的基因的參照組中最經常存在的啟動子。
[0325]本發(fā)明的密碼子優(yōu)化的序列的CAI對應于大約0.8至1.0,大約0.8至0.9，或大約1.0。密碼子優(yōu)化的序列可以進一步被修飾以在特定生物中表達，這取決于該生物的生物學限制性。例如，可以從序列中除掉大量的"A〃或"T〃的串(例如超過4、4、5、6、7、8、9或10個連續(xù)堿基的串)，如果已知這些序列對轉錄產生不利影響。此外，可以為了分子克隆的目的除去特定的限制性酶位點。此類限制性酶位點的實例包括Pac1、Asc1、BamH1、BglI1、EcoRI和Xhol。另外，可以檢查DNA序列中的長度為10個堿基或更長的正向重復序列、反向重復序列和鏡像重復序列，可以通過將密碼子替換為“第二最佳”密碼子，即在特定生物(針對該生物進行序列的優(yōu)化)中發(fā)生的頻率第二高的密碼子，從而對它們進行人工修飾。
[0326]包含編碼任意多肽鏈的氨基酸的密碼子的核苷酸序列中的變異允許編碼基因的序列的差異。由于每個密碼子由3個核苷酸組成，并且構成DNA的核苷酸限定在4種特定的堿基，所以有64種可能的核苷酸組合，其中61種編碼氨基酸(其余3種密碼子編碼終止翻譯的信號)。本文表1中提供了 “遺傳密碼”，其顯示了哪種密碼子編碼哪種氨基酸。結果是，很多氨基酸被不止一種密碼子代表。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸被4種三元組所編碼，絲氨酸和精氨酸被6種三元組編碼，而色氨酸和甲硫氨酸僅由I種三元組編碼。這種簡并性允許DNA堿基組成在很大范圍內變化，但不改變DNA所編碼的蛋白質的氨基酸序列。
[0327]表1:標準遺傳密碼
【權利要求】
1.一種重組微生物,其包含: (a)一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失；和 (b)在一個或多個工程化代謝途徑中用于將碳水化合物源轉化成乙醇的一種或多種天然和/或異源酶，其中所述一種或多種天然和/或異源酶被激活、上調或下調。
2.權利要求1的重組微生物，其中所述重組微生物產生比不具有所述一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的對照重組微生物更少的甘油。
3.權利要求1或2的重組微生物，其中所述碳水化合物源是生物質。
4.權利要求1-3的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸、gpd2多核苷酸或gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼。
5.權利要求4的重組微生物，其還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸。
6.權利要求1-3的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gppl多核苷酸、gpp2多核苷酸或gppl多核苷酸和gpp2多核苷酸編碼。
7.權利要求1-6的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼。
8.權利要求1-7的任一項的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑之一包含丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化。
9.權利要求1-8的任一項的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑之一包括包括乙酰-CoA至乙醇的轉化。
10.權利要求1-9的任一項的重組微生物，其還包含一種或多種由fdhl多核苷酸、fdh2多核苷酸或fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
11.權利要求1-10的任一項的重組微生物，其中所述微生物產生乙醇。
12.權利要求1-11的任一項的重組微生物，其中所述微生物產生甲酸。
13.權利要求1-12的任一項的重組微生物，其中所述微生物選自釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、馬克思克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、解脂耶羅維亞酵母、多形漢森酵母、紅發(fā)夫酵母、實用假絲酵母、Arxula adeninivorans、樹干畢赤酵母、漢遜德巴利酵母、多型德巴利酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和西方許旺酵母。
14.權利要求13的重組微生物，其中所述微生物是釀酒酵母。
15.權利要求8-14的任一項的重組微生物，其中所述丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)轉化成乙酰-Cok和甲酸。
16.權利要求15的重組微生物，其中所述PFL具有原核或真核生物來源。
17.權利要求16的重組微生物，其中所述PFL來自雙歧桿菌屬、埃希氏菌屬、好熱厭氧桿菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、衣藻屬、單鞭毛菌、新麗鞭毛菌屬或芽孢桿菌屬中的一種或多種。
18.權利要求16的重組微生物，其中所述PFL來自地衣芽胞桿菌、嗜熱鏈球菌、胚芽乳桿菌、干酪乳桿菌、青春雙岐桿菌、解纖維素梭菌、大腸桿菌、萊茵衣藻PflA、單鞭毛菌屬E2或新麗鞭毛菌的一種或多種。
19.權利要求15-18的任一項的重組微生物，其中所述PFL來自青春雙岐桿菌。
20.權利要求9-19的任一項的重組微生物，其中所述乙酰-CoA被乙醛脫氫酶轉化成乙醛,并且其中所述乙醛被醇脫氫酶轉化成乙醇。
21.權利要求9-19的任一項的重組微生物，其中所述乙酰-CoA被雙功能乙醛/醇脫氫酶轉化成乙醇。
22.權利要求20或21的重組微生物，其中所述乙醛脫氫酶、醇脫氫酶或雙功能乙醛/醇脫氫酶具有原核或真核生物來源。
23.權利要求20的重組微生物,其中所述乙醒脫氫酶來自C.phytofermentans。
24.權利要求21的重組微生物，其中所述雙功能乙醛/醇脫氫酶來自埃希氏菌屬、梭菌屬、衣藻屬、單鞭毛菌屬或雙歧桿菌屬。
25.權利要求21的重組微生物，其中所述雙功能乙醛/醇脫氫酶來自大腸桿菌、Clostridium phytofermentans、萊茵衣藻、單鞭毛菌屬E2或青春雙岐桿菌。
26.權利要求24或25的重組微生物，其中所述雙功能乙醛/醇脫氫酶來自青春雙岐桿菌或單鞭毛菌屬E2。
27.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包括通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包括通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含一種或多種由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的天然酶的缺失。
28.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gPPl多核苷酸和gpp2多核苷酸編碼，并且所述工程化代謝途徑之一包括通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-Cok和甲酸的轉化。
29.權利要求28的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
30.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-Cok和甲酸的轉化。
31.權利要求30的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
32.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼并且所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼，其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
33.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
34.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸。
35.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷和由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
36.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼并且所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸。
37.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼并且所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸和由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
38.權利要求1-37的任一項的重組微生物，其中一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失使甘油形成減少: (a)超過約10%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油； (b)超過約20%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油； (c)超過約30%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油； (d)超過約40%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油； (e)超過約50%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油； (f)超過約60%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；(g)超過約70%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油； (h)超過約80%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油； (i)超過約90%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油； (j)超過約95%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油；或 (k)超過約99%的由不具有一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物產生的甘油。
39.權利要求1-38的任一項的重組微生物，其中所述重組微生物產生選自如下的量的甲酸: (a)在24小時內至少約0.012g/L ； (b)在48小時內至少約0.022g/L ;或 (c)在142小時內至少約2.5g/L。
40.權利要求1-39的任一項的重組微生物，其中所述重組微生物產生選自如下的甲酸產率: (a)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約0.05倍的甲酸； (b)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約0.1倍的甲酸； (C)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約0.5倍的甲酸； (d)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約1.0倍的甲酸； (e)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約5.0倍的甲酸； (f)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約10.0倍的甲酸； (g)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約20.0倍的甲酸； (h)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約30.0倍的甲酸； (i)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約40.0倍的甲酸； (j)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約50.0倍的甲酸； (k)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約75.0倍的甲酸；或(I)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約100倍的甲酸。
41.權利要求1-40的任一項的重組微生物，其中所述微生物產生選自如下的乙醇產率: (a)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約1%的乙醇； (b)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約2%的乙醇； (C)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約3%的乙醇； (d)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約4%的乙醇； (e)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約5%的乙醇； (f)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約10%的乙醇； (g)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約20%的乙醇； (h)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約30%的乙醇； (i)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約40%的乙醇； (j)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約50%的乙醇； (k)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約60%的乙醇； (I)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約70%的乙醇； (m)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約80%的乙醇； (η)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約90%的乙醇； (ο)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約95%的乙醇；或 (P)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物產生的多至少約99%的乙醇。
42.權利要求1-41的任一項的重組微生物，其中碳水化合物源至乙醇的轉化是在缺氧條件下進行的。
43.權利要求1-42的任一項的重組微生物，其中所述重組微生物在缺氧條件下具有選自如下的乙酸攝取(g/L)； (a)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約1%的乙酸攝??； (b)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約10%的乙酸攝??； (C)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約20%的乙酸攝??； (d)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約30%的乙酸攝??； (e)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約40%的乙酸攝?。? (f)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約 50%的乙酸攝?。? (g)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約60%的乙酸攝??； (h)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約70%的乙酸攝取； (i)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約80%的乙酸攝取；和 (j)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物攝取的多至少約90%的乙酸攝取。
44.權利要求1-43的任一項的重組微生物，其中所述重組微生物以相較于無一種或多種用于產生甘油和/或調節(jié)甘油合成的天然酶的缺失的重組微生物更低的葡萄糖利用率產生更多的乙醇，其中所述葡萄糖利用率選自: (a)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約1%的每小時使用的葡萄糖； (b)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約5%的每小時使用的葡萄糖； (C)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約10%的每小時使用的葡萄糖； (d)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約20%的每小時使用的葡萄糖； (e)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約30%的每小時使用的葡萄糖； (f)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約40%的每小時使用的葡萄糖； (g)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約50%的每小時使用的葡萄糖； (h)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約60%的每小時使用的葡萄糖； (i)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約70%的每小時使用的葡萄糖； (j)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約80%的每小時使用的葡萄糖；和 (k)比由不具有一種或多種天然和/或異源酶的激活、上調或下調的重組微生物使用的少至少約90%的每小時使用的葡萄糖。
45.一種重組微生物，其包含: (a)一種或多種用于調節(jié)甘油合成的異源酶，其中所述一種或多種異源酶被激活、上調或下調；和 (b)在一個或多個工程化代謝途徑中用于將碳水化合物源轉化成乙醇的一種或多種天然和/或異源酶，其中所述一種或多種天然和/或異源酶被激活、上調或下調。
46.權利要求45的重組微生物，其中所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的異源酶由fpsl多核苷酸編碼。
47.權利要求46的重組微生物，其中所述fpsl多核苷酸來自大腸桿菌。
48.權利要求45-47的任一項的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑之一包括丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化。
49.權利要求45-48的任一項的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑之一包含乙酰-CoA至乙醇的轉化。
50.權利要求45-49的任一項的重組微生物，其還包含由fdhl多核苷酸、fdh2多核苷酸或fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
51.權利要求45-50的任一項的重組微生物，其中所述微生物產生乙醇。
52.權利要求45-51的任一項的重組微生物，其中所述微生物產生甲酸。
53.權利要求45-52的任一項的重組微生物，其中所述微生物選自釀酒酵母、乳酸克魯維酵母、馬克思克魯維酵母、巴斯德畢赤酵母、解脂耶羅維亞酵母、多形漢森酵母、紅發(fā)夫酵母、實用假絲酵母、Arxula adeninivorans、樹干畢赤酵母、漢遜德巴利酵母、多型德巴利酵母、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌和西方許旺酵母。
54.權利要求53的重組微生物，其中所述微生物是釀酒酵母。
55.權利要求48-54的任一項的重組微生物，其中所述丙酮酸被丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)轉化成乙酰-Cok和甲酸。
56.權利要求55的重組微生物，其中所述PFL具有原核或真核生物來源。
57.權利要求56的重組微生物，其中所述PFL來自雙歧桿菌屬，埃希氏菌屬、好熱厭氧桿菌屬、梭菌屬、鏈球菌屬、乳桿菌屬、衣藻屬、單鞭毛菌、新麗鞭毛菌屬或芽孢桿菌屬的一種或多種。
58.權利要求56的重組微生物，其中所述PFL來自地衣芽孢桿菌、嗜熱鏈球菌、胚芽乳桿菌、干酪乳桿菌、青春雙岐桿菌、解纖維素梭菌、大腸桿菌、萊茵衣藻PflA、單鞭毛菌屬E2或新麗鞭毛菌的一種或多種。
59.權利要求55-58的任一項的重組微生物，其中所述PFL來自青春雙岐桿菌。
60.權利要求49-59的任一項的重組微生物，其中所述乙酰-CoA被乙醛脫氫酶轉化成乙醛；并且其中所述乙醛被醇脫氫酶轉化成乙醇。
61.權利要求49-59的任一項的重組微生物，其中所述乙酰-CoA被雙功能乙醛/醇脫氫酶轉化成乙醇。
62.權利要求60或61的重組微生物，其中所述乙醛脫氫酶、醇脫氫酶或雙功能乙醛/醇脫氫酶具有原核或真核生物來源。
63.權利要求60的重組微生物,其中所述乙醒脫氫酶來自C.phytofermentans。
64.權利要求61的重組微生物，其中所述雙功能乙醛/醇脫氫酶來自埃希氏菌屬、梭菌屬、衣藻屬、單鞭毛菌屬或雙歧桿菌屬。
65.權利要求64的重組微生物，其中所述雙功能乙醛/醇脫氫酶來自大腸桿菌、Clostridium phytofermentans、萊茵衣藻、單鞭毛菌屬E2或青春雙岐桿菌。
66.權利要求64或65的重組微生物，其中所述雙功能乙醛/醇脫氫酶來自青春雙岐桿菌或單鞭毛菌屬E2。
67.一種用于減少細胞甘油的方法，包括將生物質與根據(jù)權利要求1-66的任一項的重組微生物接觸。
68.一種用于增加胞質甲酸的方法，包括將生物質與根據(jù)權利要求8-33或48-66的任一項的重組微生物接觸。
69.一種用于將生物質轉化成乙醇的方法，包括將生物質與根據(jù)權利要求1-66的任一項的重組微生物接觸。
70.權利要求69的方法，其中所述生物質包含木質纖維素生物質。
71.權利要求70的方法，其中所述木質纖維素生物質選自草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、混合草原禾草、芒草、糖加工殘渣、甘蔗渣、甘蔗桿、農業(yè)廢物、稻桿、稻殼、大麥桿、玉米穗軸、谷類桿、小麥桿、蕓苔桿、燕麥桿、燕麥殼、玉米纖維、秸桿、大豆秸桿、玉米秸桿、林業(yè)廢物、再循環(huán)木漿纖維、紙污泥、鋸屑、硬木、軟木、龍舌蘭及其組合。
72.權利要求69的方法，其中所述生物質是玉米糖化醪或玉米淀粉。
73.權利要求3的重組微生物，其中所述生物質包含木質纖維素生物質。
74.權利要求72的重組微生物，其中所述木質纖維素生物質選自草、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、混合草原禾草、芒草、糖加工殘渣、甘蔗渣、甘蔗桿、農業(yè)廢物、稻桿、稻殼、大麥桿、玉米穗軸、谷類桿、小麥桿、蕓苔桿、燕麥桿、燕麥殼、玉米纖維、秸桿、大豆秸桿、玉米秸桿、林業(yè)廢物、再循環(huán)木漿纖維、紙污泥、鋸屑、硬木、軟木、龍舌蘭及其組合。
75.權利要求3的重組微生物，其中所述生物質是玉米糖化醪或玉米淀粉。
76.權利要求1-66的任一項的重組微生物，其中所述微生物還包含一種或多種天然和/或異源酶，所述酶在一個或多個工程化代謝途徑中用于將木糖轉化成木酮糖-5-磷酸和/或將阿拉伯糖轉化成木酮糖-5-磷酸，其中一種或多種天然和/或異源酶被激活、上調或下調。
77.權利要求1-66的任一項的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑之一包含碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化。
78.權利要求77的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑包含一種或多種編碼糖解酶的天然和/或異源酶。
79.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過糖解酶進行的碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化，并且還包含由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
80.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gppl多核苷酸和gpp2多核苷酸編碼，并且所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過糖解酶進行的碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化。
81.權利要求80的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
82.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼，并且所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過糖解酶進行的碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化。
83.權利要求82的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包含由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
84.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼并且所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼，其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過糖解酶進行的碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化，并且還包含由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
85.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼，其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過糖解酶進行的碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化，并且還包含由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
86.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過糖解酶進行的碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化，并且還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸。
87.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過糖解酶進行的碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化，并且還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸和由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
88.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼并且一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過糖解酶進行的碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化，并且還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸。
89.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpdl多核苷酸和gpd2多核苷酸編碼，以及所述一種或多種用于調節(jié)甘油合成的天然酶由fpsl多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過糖解酶進行的碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化，還包含有效地連接于天然gpd2啟動子多核苷酸的天然和/或異源gpdl多核苷酸以及由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
90.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gpd2多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包含通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-CoA和甲酸的轉化，所述工程化代謝途徑之一包含通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，以及所述工程化代謝途徑之一包含通過糖解酶進行的碳水化合物源至一種或多種糖單元的轉化，并且還包含由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
91.權利要求78-89的任一項的重組微生物，其中所述糖解酶選自淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、纖維素分解和淀粉分解輔助酶、菊糖酶、果聚糖酶和戊糖利用酶。
92.權利要求78-90的任一項的重組微生物，其中所述糖解酶來自微生物，所述微生物選自灰腐質霉(H.grisea)、嗜熱子囊茵、埃默森籃狀菌(T.emersonii)、里氏木霉、澳洲乳白蟻(C.1acteus)、臺灣乳白蟻、高山象白蟻(N.takasagoensis)、澳大利亞矛顎家白蟻(C.acinaciformis)、達爾文澳白蟻、N.walker1、扣囊復膜酵母、C.lucknowense、黃胸散白蟻(R.speratus)、嗜熱放線菌、熱纖梭菌、解纖維素梭菌、約氏梭菌、短小芽孢桿菌、糞堿纖維單胞菌、多糖降解菌、Piromyces equi1、Neocallimastix patricarum、擬南芥和扣囊復膜酵母。
93.權利要求92的重組微生物，其中所述糖解酶是扣囊復膜酵母菌葡糖淀粉酶(glu-0111-C0)。
94.權利要求1-26的任一項的重組微生物，其中所述一種或多種用于產生甘油的天然酶由gppl多核苷酸或gpp2多核苷酸編碼，并且其中所述工程化代謝途徑之一包括通過丙酮酸甲酸裂解酶進行的丙酮酸至乙酰-Cok和甲酸的轉化。
95.權利要求94的重組微生物，其中所述工程化代謝途徑之一包括通過雙功能乙醛/醇脫氫酶進行的乙酰-CoA至乙醇的轉化，并且還包括由fdhl多核苷酸和fdh2多核苷酸編碼的一種或多種天然酶的缺失。
【文檔編號】C12N1/18GK103649321SQ201280025218
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年4月5日 優(yōu)先權日:2011年4月5日
【發(fā)明者】A·阿吉羅斯, W·R·西勒斯, T·巴雷特, N·凱阿扎, A·J·肖四世 申請人:馬斯科馬公司