本發(fā)明涉及生產酵母提取物的方法。

背景技術：
酵母提取物通常用在食品工業(yè)中，以改善或增加所有種類的美味食品應用，比如湯、松脆物、土豆片、（加工的）肉類等等的香味。食品化學法典（FoodChemicalCodex）如下定義“酵母提取物”：“酵母提取物包含酵母細胞的水溶性組分，其組成主要是氨基酸、肽、碳水化合物和鹽。酵母提取物通過可食用的酵母中天然存在的酶或者添加食品級別的酶來對肽鍵水解而產生”。相比之下，該食品化學法典將“自溶的酵母”定義為：“從食品級酵母獲得的濃縮的、非提取的、部分可溶的消化物。溶解通過酵母細胞的酶促水解或自溶完成。可添加食品級鹽和酶。自溶酵母含有得自全酵母細胞的可溶和不可溶組分二者。其主要含有氨基酸、肽、碳水化合物、脂肪和鹽”。酵母自溶產物因此不同于“酵母提取物”，因為除了在酵母提取物中存在的所有感興趣的組分外，酵母自溶產物還含有未與可溶性組分分開的感興趣的細胞壁組分。酵母提取物通常如下生產：a）使酵母自溶；和b）對自溶產物進行固/液分離并回收液體組分。通常這種方法用膏狀酵母開始，所述膏狀酵母是通過在發(fā)酵結束時收獲酵母細胞后去除廢液，即通過去除酒糟來獲得的。接下來，對膏狀酵母中的酵母細胞進行處理，使得細胞破裂并釋放內含物。這通常通過兩個不同的過程來實現，或者產生自溶的酵母提取物或者產生水解的酵母提取物。自溶的酵母提取物是在細胞破裂以及聚合酵母材料消化（裂解）之后得自酵母可溶性物質的濃縮物。細胞破裂之后在培養(yǎng)基中釋放的活性酵母酶是裂解的主要原因。這些類型的酵母提取物通常不包含5’-核糖核苷酸，因為在自溶過程期間，天然RNA被分解或修飾為不可降解或幾乎不可降解為5’-核糖核苷酸的形式。富含氨基酸的這些類型的酵母提取物在食品工業(yè)中用作基本味感提供劑。酵母提取物中存在的氨基酸給食品添加了肉湯樣的肉湯味。另一方面，水解的酵母提取物是下述處理之后獲得自酵母的可溶性物質的濃縮物，所述處理為細胞破裂、消化（裂解）以及在裂解期間將蛋白酶和/或肽酶特別是核酸酶添加至酵母懸浮液。使天然的酵母酶在裂解之前失活，這通常通過熱沖擊來實現。通過本領域已知的方法獲得酵母提取物的問題在于，當所述酵母提取物溶解時，它們是混濁的，這在澄清的應用，比如澄清的湯等等中是不利的。對于這種混濁的可能的解決方案是應用額外的過濾步驟，比如超濾或微濾。然而，這由于需要額外的處理步驟不僅是不經濟的，而且由于引起混濁的材料留下來并被丟棄而導致損失。本發(fā)明的一個目的是提供生產低濁度的酵母提取物的方法，所述方法簡單且具有基于干物質的高的產率。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面提供了生產酵母提取物的方法，所述方法包括：a）使酵母自溶；并b）對自溶產物進行固/液分離并回收可溶性組分，其中步驟b）中的固/液分離在低于5.1且高于1.0的pH下進行。在本發(fā)明上下文中，在步驟b）中獲得的“回收的可溶性組分”是酵母提取物。因此，本說明書通篇中，術語“在步驟b）中獲得的回收的可溶性組分”與“在步驟b）中獲得的酵母提取物”具有相同的含義。在本發(fā)明上下文中，酵母“自溶”被定義為下述過程，其中酵母細胞和聚合酵母材料的降解至少部分地受酵母細胞壁被（部分）破壞和/或破裂之后釋放到培養(yǎng)基中的活性天然酵母酶影響。優(yōu)選的酵母的例子是Saccharomyces、Kluyveromyces和Candida。屬于Saccharomyces屬，特別是屬于Saccharomycescerevisiae種的菌株是最優(yōu)選的。在本發(fā)明方法中使用的酵母可通過本領域中已知的任何合適的發(fā)酵方法來制備。酵母生物質在用于本發(fā)明的方法之前可被濃縮，例如通過離心或過濾來進行。例如，可使用膏狀酵母（已被濃縮至干物質含量為15-27%w/w的面包酵母）。任選地，可使用包含Brewer’s酵母或得自啤酒工廠的殘留物酵母（廢Brewer’s酵母）的發(fā)酵液。本發(fā)明提供了下述方法，其特別適于大規(guī)模生產酵母提取物。大規(guī)模表示發(fā)酵在超過10m3的發(fā)酵罐中進行。通過使酵母細胞壁破壞和/或部分地破裂來開始自溶過程。以這種方式，細胞被部分地打開，且釋放至少一些細胞內含物。為了使酵母細胞壁破壞和/或部分破裂，使用本領域技術人員已知的方法，對細胞進行化學、機械或酶促處理。機械處理包括均質（homogenisation）技術。為此目的，使用高壓均質機是可行的。其它的均質技術可以包括用顆粒例如沙和/或玻璃珠來混合，或者使用研磨裝置（例如珠粒研磨機）?；瘜W處理包括使用鹽、堿和/或一種或多種表面活性劑或去垢劑。化學處理是較不優(yōu)選的，因為它們可能導致RNA的部分降解，尤其是用到堿的時候，以及導致隨后2’-核糖核苷酸和3’-核糖核苷酸的形成。本發(fā)明人已意識到，當步驟b）中回收期間的pH低于5.1且高于1.0時，可生產具有非常低的濁度的酵母提取物（即，非常澄清的酵母提取物）。“濁度”也稱為“混濁度（cloudiness）”或“渾濁度（haziness）”，其通常由液體中懸浮的顆粒引起。技術人員知道如何測量濁度。測量濁度的合適的方法在實施例1中描述。本發(fā)明通篇中，術語“澄清的酵母提取物”和“具有低濁度的酵母提取物”被理解為具有相同的含義。在一種實施方式中，步驟b）中的固/液分離期間的pH低于5.1，優(yōu)選地低于4.5或更低，更優(yōu)選地低于4.2或更低，甚至更優(yōu)選地低于4.0或更低，最優(yōu)選地低于3.5或更低且高于1.0。優(yōu)選的pH范圍是從1.0-5.0或從1.0-4.5或從1.0-4.2或從1.0-3.5和從2.0-5.1或從2.0-4.5或從2.0-4.2。最優(yōu)選的是2.0-3.5的pH范圍。步驟b）中的固-液分離優(yōu)選地通過常用的固-液分離方法，優(yōu)選地通過離心或過濾來進行。當使用離心時，可溶性組分可作為上清液回收。在一種優(yōu)選的實施方式中，步驟b）中的固-液分離通過離心進行。使用離心在經濟上是有優(yōu)勢的，特別是當所述方法大規(guī)模進行時。在本發(fā)明方法中，在自溶方法中使用的條件是優(yōu)選地使得相當大的一部分RNA以可降解為5’-核糖核苷酸的形式保留的條件。在此用術語“5’-核糖核苷酸”來指5’-GMP、5’-CMP、5’-UMP和進一步的5’-AMP和/或5’-IMP的混合物，其中所述5’-AMP可被部分或完全轉化成5’-IMP。術語“5’-核糖核苷酸”包括游離的5’-核糖核苷酸或其鹽。在上下文中，用“相當大的一部分RNA”表示優(yōu)選地至少50%、更優(yōu)選地至少60%、70%、75%，甚至更優(yōu)選地至少80%，最優(yōu)選地至少83%（都基于在步驟b之前的總RNA量）。高量的可降解為5’-核糖核苷酸的RNA可有利地導致酵母提取物具有非常低的濁度。在自溶過程期間，不需要RNA全部完整地保留，但是至少相當大的一部分RNA應以可降解為5’-核糖核苷酸的形式保留。通常，最多100%的RNA可以以可降解為5’-核糖核苷酸的形式保留?！耙钥山到鉃?’-核糖核苷酸的形式”表示，RNA應該是允許通過合適的酶轉化為5’-核糖核苷酸的形式。優(yōu)選地，合適的酶是5’-磷酸二酯酶（5’-Fdase）?？山到鉃?’-核糖核苷酸的RNA的形式包括含有至少兩個核糖核苷酸單元的寡核苷酸。因而，可降解為5’-核糖核苷酸的形式的RNA可由包含完整RNA和不同長度的寡核苷酸或多核苷酸的混合物組成。在本發(fā)明的上下文中，寡核苷酸包含2-10個核糖核苷酸單元，而多核苷酸包含多于10個核糖核苷酸單元。在自溶過程期間以可降解為5’-核糖核苷酸的形式保留的RNA的百分比被定義為，a）參與自溶以及RNA向5’-核糖核苷酸轉化的酶失活之后在自溶產物中測量的5’-GMP重量百分比（計算為其七水合物二鈉鹽，且基于無氯化鈉的干物質）和b）在RNA完全堿性水解之后在起始材料中測量的GMP重量百分比（計算為其七水合物二鈉鹽，且基于無氯化鈉的干物質）之間的比率（×100）。在堿性水解之后在起始材料中測量的GMP重量百分比（計算為其七水合物二鈉鹽，且基于無氯化鈉的干物質）可通過將對應的游離GMP的重量百分比（基于無氯化鈉的干物質）乘以系數1.47來確定。實施例1中描述了測定自溶產物中5’-GMP的量和堿水解之后GMP的量的方法。用來測定5’-GMP的量的方法也可用來測定5’-IMP、5’-AMP、5’-CMP和5’-UMP的量，如果必要的話，所述方法具有本領域技術人員知識范圍內的一些適當修改。優(yōu)選地，酶促地進行使酵母細胞壁破壞和/或部分地破裂，因為可因此實現對方法的更好的控制，并且該方法特別合適于大規(guī)模使用?？墒褂萌舾煞N酶制劑，比如纖維素酶、葡聚糖酶、半纖維素酶、幾丁質酶、蛋白酶和/或果膠酶。優(yōu)選地使用蛋白酶，更優(yōu)選地使用內切蛋白酶。用來起始自溶方法的條件取決于使用的酶的類型并且可由本領域技術人員容易地確定。通常，用來酶促地使酵母細胞壁破壞和/或破裂的條件對應于在酵母自溶期間應用的那些條件。酵母自溶至少部分地受使酵母細胞壁（部分地）破壞和/或破裂之后在溶液中釋放的天然活性酵母酶作用，其中添加的使酵母細胞壁破壞和/或破裂的化學品或更優(yōu)選的酶可有助于酵母細胞和聚合酵母材料降解。特別地，自溶的第一階段在與特定的溫度組合的特定的pH范圍內進行。例如，Saccharomycescerevisiae的自溶中應用的確保相當大的一部分RNA以可降解為5’-核糖核苷酸的形式保留并減少步驟b）中回收的可溶性組分的濁度的條件是使得自溶的第一階段的pH在4.5-9之間和/或溫度在50-65℃之間的條件。優(yōu)選地，自溶的頭8個小時，更優(yōu)選地自溶的頭4個小時在4.5-5.5的pH和57-65℃的溫度或5.5-9的pH和50-65℃的溫度下進行。第一階段之后要保持的自溶條件較不關鍵。第一階段之后pH通常保持在4和10之間，且溫度通常保持在40℃和70℃之間。然而，優(yōu)選地，第一階段之后的pH小于5.1，優(yōu)選地，第一階段之后的pH是4.5或更小，更優(yōu)選地4.2或更小，甚至更優(yōu)選地4.1或更小，最優(yōu)選地3.5或更小。一般而言，包括第一階段的自溶過程的持續(xù)時間為至多24小時。本發(fā)明也可包括下述方法，其中在步驟a）中，使酵母在相當大的一部分RNA以可降解為5’-核糖核苷酸的形式保留的條件下進行水解。在本發(fā)明的上下文中，“酵母水解”可定義為下述過程，其中已使天然的酵母酶失活，且其中合適的外源酶添加至酵母生物質，以實現酵母細胞和聚合酵母材料的降解。自溶之后，獲得了下述懸浮液（自溶產物），其包含酵母細胞壁組分、相當大的一部分是可降解為5’-核糖核苷酸的形式的RNA和可溶性細胞組分（例如蛋白質、肽、氨基酸、碳水化合物等等）。細胞壁組分包含不可溶的細胞殘留物，特別是細胞壁或其片段。自溶過程結束時并且在步驟b）之前，用于使酵母細胞壁破壞和/或部分地破裂的化學品和/或參與自溶過程的酶應優(yōu)選地被中和和/或失活。參與自溶的酶是天然的酵母酶和任選地添加的用來起始自溶過程的任何外源酶?；瘜W品和/或酶的中和和/或失活應在相當大的一部分RNA以可降解為5’-核糖核苷酸的形式保留的條件下發(fā)生。參與自溶的酶的失活可通過pH處理或優(yōu)選地通過熱處理來進行，由此使酶失活。酶可通過熱處理失活，例如通過在從65℃至95℃的溫度下將混合物加熱從5分鐘至1小時的時間，更優(yōu)選地通過在從65℃至75℃的溫度下將混合物加熱從30分鐘至1小時的時間，其中典型地可在更高的反應溫度下使用更短的反應時間。例如，在65℃下將混合物加熱1小時或在75℃下將混合物加熱30分鐘對使酶失活而言是足夠的。在本發(fā)明方法的步驟b）中，對自溶產物進行固/液分離且回收含有RNA的細胞壁組分，其中在這期間的pH低于5.1，優(yōu)選地4.5或更低，更優(yōu)選地4.2或更低，甚至更優(yōu)選地4.0或更低，最優(yōu)選地3.5或更低且高于1.0。優(yōu)選的pH范圍是從1.0-5.0或從1.0-4.5或從1.0-4.2或從1.0-3.5和從2.0-5.1或從2.0-4.5或從2.0-4.2。最優(yōu)選的是pH范圍2.0-3.5。在該固/液分離中，主要含有細胞壁的固體組分與可溶性組分分離開。在一種實施方式中，在步驟b）中，總RNA的至少55%，更優(yōu)選地至少75%，最優(yōu)選地至少90%與細胞壁組分結合在一起。實施例2表明，自溶產物中總RNA的高達94.7%與細胞壁組分結合在一起。實施例2還表明，與酵母細胞壁結合的RNA百分比和酵母提取物的濁度是固/液分離期間pH的函數：pH值越低，更多與細胞壁結合的RNA保留，且酵母提取物的濁度逐漸減小?？俁NA量（即步驟b之前）可通過分析步驟a）中獲得的自溶產物來測定。實施例1中描述了分析RNA的方法。高量的與細胞壁組分結合的RNA可導致酵母提取物具有低的濁度。與細胞壁組分結合在一起的RNA百分比被定義為a）源自固定量的起始材料的自溶產物的細胞壁組分中的RNA的克數與b）在相同固定量的起始材料中存在的RNA的克數之間的比率（×100）。實施例1描述了測定細胞壁組分和起始材料中的RNA量的方法。為了減少步驟b）中的回收的可溶性組分的濁度，可對自溶產物進行超濾（UF），來代替通常的固-液分離方法比如離心或過濾。一般而言，截留分子量越大允許通過膜的流量越高，但可能導致更大的損失和/或更少的純的產物。除了其他因素以外，使用的固-液分離類型和所述固-液分離的效率可影響在本發(fā)明方法的步驟b）中回收的可溶性組分中的鹽、碳水化合物、氨基酸和蛋白的量。在一種實施方式中，本發(fā)明的方法包括在步驟b）之后的：步驟c）將RNA轉化為5’-核糖核苷酸。優(yōu)選地使用5’-磷酸二酯酶（5’-Fdase）來將RNA轉化成為5’-核糖核苷酸。5’-磷酸二酯酶可獲得自微生物或植物來源（例如，麥芽根提取物）。商購微生物5’-Fdase的例子是由Amano（日本）生產的酶RP-1。任選地，通過脫氨酶，例如腺嘌呤脫氨酶，將5’-AMP轉化為5’-IMP。商購脫氨酶的例子是由Amano（日本）生產的脫氨酶500。通過5’-Fdase和脫氨酶處理RNA可在兩步過程或在一個單獨的步驟過程中進行。在另一種優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明方法包括步驟c）之后的d）：將5’-核糖核苷酸與其他可溶性材料分離，優(yōu)選地通過離心或過濾來進行。這允許獲得具有非常低的濁度的酵母提取物以及高量的5’-核糖核苷酸，例如高至90%w/w，95%w/w或甚至98%w/w或99%w/w的5’-核糖核苷酸，所有的量基于總干物質。本發(fā)明方法具有若干益處。其允許生產具有低的濁度的酵母提取物，并且因為其可僅包括2個步驟，所以非常簡單。此外，其還可允許生產富含RNA的細胞壁組分，所述RNA可隨后被轉化為5’-核糖核苷酸，并且5’-核糖核苷酸可從細胞壁組分中提純，導致非常純的5’-核糖核苷酸組分。以這種方式，除了生產富含RNA的細胞壁組分和/或富含5’-核糖核苷酸的細胞壁組分和/或非常純的含5’-核糖核苷酸的組分之外，還可生產非常澄清的酵母提取物。在第二個方面中，本發(fā)明提供酵母提取物，其特征在于，在5%的干物質含量下測量的酵母提取物的濁度低于30NTU。優(yōu)選地，酵母提取物可通過本發(fā)明的方法獲得。本發(fā)明現通過一些實施例來闡釋，但所述實施例不意圖是限制性的。實施例實施例1具有低濁度的酵母提取物的制備將兩升來自Saccharomycescerevisiae的膏狀酵母加熱至60℃。隨后添加0.5mlAlcalase（從丹麥Novozymes商購的絲氨酸蛋白酶），并將混合物在pH6.0和60℃下孵育4小時。將條件調整至pH5.1和51.5℃，并將另外的2mlAlcalase添加至反應混合物。將混合物在pH5.1，51.5℃下孵育20小時。接著，將混合物或自溶產物在65℃下加熱1小時以使所有的酶活性失活?；诳偢晌镔|，自溶產物的RNA含量為8.7%w/w。將自溶產物的一部分用5’-磷酸二酯酶處理，這導致5’-GMP的量為2.65%w/w，所述量表示為七水合物二鈉鹽，并基于無氯化鈉的干物質?？赏茢喑?，可降解為5’-核糖核苷酸的RNA組分為83%（w/w）。通過在5.1（比較實驗）、4.2（實驗1）或3.5（實驗2）的pH下離心，使自溶產物的另一部分經歷第一次固/液分離。收集細胞壁組分，而不用進一步的pH調整，用水洗滌兩次，并分析RNA含量。通過添加水，將澄清提取物（作為上清液）調整至干物質含量為13%或2.5%，并隨后分析濁度。在65℃的溫度和5.3的pH下，用5’-磷酸二酯酶進一步處理細胞壁組分。接著，在55℃的溫度和pH5.1下，通過脫氨酶，將5’-AMP轉化為5’-IMP。在5’-磷酸二酯酶和脫氨酶二者處理之后，通過離心手段，使細胞壁組分經歷第二次固/液分離，并對澄清組分分析5’-核糖核苷酸含量。將一些樣品也用5’-Fdase孵育，以確定樣品中存在的RNA是否可被轉化為5’-核糖核苷酸（即，通過例如5’-Fdase，RNA是否是可降解為5’-核糖核苷酸的形式），并且將這些樣品中的一些也用脫氨酶處理，以將5’-AMP轉化為5’-IMP。隨后，根據下述方法，通過HPLC手段，測定樣品中5’-GMP、5’-AMP和5’-IMP的量（表示為其七水合物二鈉鹽的重量百分比，并基于無氯化鈉的干物質）。使用WhatmanPartisil10-SAX柱，pH3.35的磷酸緩沖液作為洗脫液以及UV檢測，通過HPLC確定酵母提取物中的5’-GMP、5’-AMP和5’-IMP的量?；?’-GMP、5’-IMP和5’-AMP標準物，計算濃度。通過用Jenway氯化物計PCLM3（Jenway，Essex，英國）測量樣品中的氯離子來測定氯化鈉，并計算對應的氯化鈉的量。表1.實施例1的結果如下分析RNA：在堿性處理期間水解RNA。使用5’-GMP作為標準物、使用WhatmanPartisil10-SAX柱、pH3.35的磷酸緩沖液作為洗脫液和UV檢測，通過HPLC手段確定GMP（即，得自RNA水解的2’-GMP和3’-GMP）的量。基于無氯化鈉干物質的RNA含量的重量百分比相當于基于無氯化鈉干物質的游離GMP的重量百分比的約4倍。在20℃的溫度下，用裝有鎢燈（400-600nm）的HACH2100N濁度計（Hach-Lange，Düsseldorf，德國）通過比濁法測定濁度。實施例2作為pH的函數的RNA在細胞壁和上清液間的分配范圍從2.0至5.01的pH值下重復實施例1的實驗。除了在分析濁度之前通過添加水，將澄清提取物（上清液）調整至干物質含量為5%之外，所有的條件是相同的。還有，細胞壁組分中的RNA不經5’-Fdase消化。表2.實施例2結果*細胞壁和上清液中的RNA之和定義為100%。