專利名稱：梅毒螺旋體TpF-1基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種梅毒螺旋體TpF-I基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Treponema pallidum, TP)引起的性傳播疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過性接觸、輸血、創(chuàng)口或者胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區(qū)附近的淋巴結(jié)進(jìn)入血液播散全身，使機(jī)體幾乎所有
的組織及器官受累，臨床表現(xiàn)為全身性的，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和潛伏期。世界衛(wèi)生組織(WHO)曾樂觀地預(yù)言([I] WHO. Global prevalence and incidenceof selected curable sexually transmitted infections:Overview and estimates[J].Geneva:WHO, WHO/HIV/AIDS, 2001:1-30.)由于有高靈敏度檢測(cè)方法和高效的治療方案，梅毒是一種能夠通過公共衛(wèi)生措施得到成功控制的性傳播性疾病”。遺憾的是，由于至今仍然缺乏高靈敏的檢測(cè)方法和高效的治療方案，梅毒依然是嚴(yán)重危害人類健康的全世界范圍的公共衛(wèi)生問題。中國(guó)疾病控制中心的官方數(shù)據(jù)顯示2010年我國(guó)梅毒(Syphilis)的發(fā)病數(shù)為375309例，比2009年同期增長(zhǎng)24. 50%。報(bào)告發(fā)病數(shù)僅次于病毒性肝炎和肺結(jié)核居第三位，居于性傳播疾病首位(中國(guó)疾控中心http://www. chinacdc. net. cn)。近年來(lái)，有關(guān)梅毒與艾滋病之間存在著互相促進(jìn)的研究結(jié)果([2] Buchacz, K.，Klausner, J.D.,Kerndt, P. R. , et al. McElroy, P.D. and Schwendemann, J. HIV incidence among mendiagnosed with early syphilis in Atlanta, San Francisco, and Los Angeles, 2004to 2005 [J] · Jaids-J Acq Tmm Def,2008, 47 (2):234-240. [3]Ghanem, K. G. , Erbelding, E.J. , Wiener, Z. S. , et al. Serological response to syphilis treatment in HIV-positiveand HIV-negative patients attending sexually transmitted diseases clinics[J].Sex Transm Infect, 2007，83 (2) :97-101.)，使得梅毒的控制越發(fā)困難而且重要。無(wú)疑，人們對(duì)梅毒的防控過于樂觀，對(duì)梅毒的認(rèn)識(shí)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。盡管青霉素成功應(yīng)用于治療各期梅毒已經(jīng)有50年歷史，但治療失敗可見于任何一種被推薦的治療方案。林麗蓉等([4]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學(xué)檢測(cè)方法的選擇[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2010，. 20(10) :1491-1494)在對(duì)健康體檢者、門診患者和潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)調(diào)查中均發(fā)現(xiàn)，這些人群存在一定比例的梅毒感染率，推測(cè)本地區(qū)人群梅毒的檢出率應(yīng)該在2. 59%以上。顯然，梅毒感染者已經(jīng)較廣泛地存在于普通人群中。梅毒正以過去500年任何國(guó)家和地區(qū)都未曾有過的速度在中國(guó)傳播，由于存在隱性感染以及無(wú)法統(tǒng)計(jì)的私人診所患者患病率，目前看到的梅毒發(fā)病率或許只是梅毒現(xiàn)狀的冰山一角([5]Lin, L. R. , Fu, Z. G. , Dan, B. , Jing, et al. Developmentof a colloidal gold-immunochromatography assay to detect immunoglobulin Gantibodies to Treponema pallidum with TPNl7 and TPN47[J]. Diagn Micr InfecDis, 2010，68(3) : 193-200. [6]Tucker JD, C. X. , Peeling RW. Syphilis and socialupheaval in china[J]. N Engl J Med, 2010, 362(18):1658-1661. [7]Chen, Z. Q. , Zhang, G.C. , Gong, X. D. , Lin, C. , Gao, X. , Liang, G. J. , Chen, X. S. , and Cohen, M. S. Syphilis inchina:Results of a national surveillance programme[J]. Lancet, 2007, 369:132-138.[8]Li-Rong Lin,Man-Li Tong,Zuo-Gen Fu,et al. Evaluation of a colloidalgoId-immunochromatography assay in the detection of Treponema Pallidm specificIgM antibody in syphilis serofast reaction patients:a serologic marker for therelapse and infection of syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and InfectiousDisease. 2011, 70:10-16)。實(shí)驗(yàn)室檢查是診斷梅毒必不可少的方法，也是判斷療效和復(fù)發(fā)的重要依據(jù)，包括暗視野顯微鏡檢查和血清學(xué)試驗(yàn)。梅毒螺旋體感染早期，梅毒抗體還未產(chǎn)生或含量較低時(shí)，暗視野顯微鏡查找螺旋體成為最早的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，但敏感度較低，且易受肛門周圍
非致病螺旋體的影響而產(chǎn)生假陽(yáng)性。梅毒螺旋體尚不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，梅毒診斷與流行病學(xué)調(diào)查主要依賴于血清學(xué)試驗(yàn)，包括特異性抗體和反應(yīng)素檢測(cè)兩大類型。反應(yīng)素檢測(cè)對(duì)早期梅毒檢測(cè)靈敏度不高，而且生物假陽(yáng)性率較高，是主要用于療效觀察的一項(xiàng)血清學(xué)指標(biāo)([9]林麗蓉，但冰，付左根，等.潛在血源傳播患者梅毒血清學(xué)TRUST/TPPA與IgM抗體聯(lián)合檢測(cè).中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志.2010，152(05) :446-448)0梅毒特異性抗體檢測(cè)的敏感性和特異性均較反應(yīng)素高。但是，梅毒特異性抗體檢測(cè)仍然存在著靈敏度不足的缺陷，尤其是早期梅毒患者抗體滴度較低。如果能建立一種方法能靈敏、特異和快速檢測(cè)到梅毒患者各類組織、體液中存在梅毒螺旋體，能證明梅毒螺旋體存在，那么這些棘手問題將迎刃而解。兔睪丸是梅毒螺旋體易感器官，少量梅毒螺旋體即可導(dǎo)致兔睪丸炎，因此，兔感染試驗(yàn)被視為梅毒螺旋體檢測(cè)的最靈敏的方法。然而，兔感染試驗(yàn)操作繁瑣，觀察時(shí)間要求3個(gè)月，甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能得到結(jié)果，臨床可操作性差。PCR擴(kuò)增技術(shù)以梅毒螺旋體特異性的基因片段做為擴(kuò)增模板，通過指數(shù)擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)了病原體的快速檢測(cè)，具有高效、靈敏和特異等優(yōu)勢(shì)。從理論上分析，通過優(yōu)化、改良PCR擴(kuò)增技術(shù)，其檢測(cè)的靈敏度和特異性可以媲美兔感染試驗(yàn)，而檢測(cè)時(shí)間僅僅需要2個(gè)小時(shí)([10]HAYP E，CLARKE J R，IAYL0R-R0BINS0N D，et al. Detection of treponemal DNA in the csf of patients with syphilis and hivinfection using the polymerase chain reaction[J]. GenitouTin Med，1990，66 (6)428-32)，有望成為解決這些棘手問題的最佳方法。.盡管國(guó)內(nèi)外有些企業(yè)研發(fā)出梅毒PCR檢測(cè)試劑，但尚未有進(jìn)入臨床應(yīng)用的有注冊(cè)文號(hào)PCR檢測(cè)試劑，而僅僅停留在科研應(yīng)用。更嚴(yán)重的是，目前的PCR檢測(cè)試劑在研發(fā)過程中由于未經(jīng)嚴(yán)格的比對(duì)試驗(yàn)，無(wú)一例外的存在靈敏度和特異性嚴(yán)重不足，其準(zhǔn)確性不高，是目前梅毒PCR技術(shù)在臨床中應(yīng)用的瓶頸。TpF-I基因的外膜蛋白基因，編碼19Kd的外膜蛋白，具有高度的保守性，在DNA復(fù)制與修復(fù)中起重要的作用。應(yīng)用TpF-I基因檢測(cè)梅毒螺旋體，有較高的敏感性和特異性([IljBabolin C, AmedeiA, Ozolirts D, et al. Tpfl from treponema pallidum activatesinflammasome and promotes the development of regulatory t cells [J]. The Journalof Immunology, 2011,187(3) :1377-1384.)。在梅毒早期快速診斷、療效判斷、療程選擇、神經(jīng)梅毒確診、胎傳梅毒診斷，以及獻(xiàn)血員、孕產(chǎn)婦、婚前體檢、手術(shù)患者和輸血前篩查等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用，有著目前常用的血清學(xué)檢測(cè)不可比擬的優(yōu)勢(shì)，將逐漸替代這些方法或作為這些方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種梅毒螺旋體TpF-I基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。所本實(shí)用新型設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶和質(zhì)控品瓶設(shè)在包裝盒內(nèi)；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2 清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含TpF-I基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。所述耐熱DNA聚合酶瓶可采用Tag酶瓶。所述陰性質(zhì)控品為不含梅毒螺旋體DNA的樣品，陽(yáng)性質(zhì)控品為含梅毒螺旋體DNA的樣品。所述6個(gè)含TpF-I基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的濃度可分別為I. O X 102copies/mL、I. OX IO3Cop ies/mL、I. OX 104copies/mL、I. 0X105copies/mL、l. 0 X 106copi es/mL 和1.0X 107copies/mL,共 6 個(gè)濃度。所述PCR反應(yīng)液的成份含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs和TpF-I基因引物、探針組成的混合物。所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)具有V - DNA聚合酶活性、5 ^ — 3' DNA外切核酸酶活性和可耐受高溫的聚合酶；所述耐熱DNA聚合酶(Tag酶)最好是半衰期>45min的高溫聚合酶。以下給出本實(shí)用新型的制備方法I)靶基因篩選，具體方法如下從基因庫(kù)(GENBANK)中篩選梅毒螺旋體TpF-I基因，TpF-I基因探針和引物的設(shè)計(jì)米用 PCR 引物探針設(shè)計(jì)軟件 primer premier 5.0、Oligo 6· O、TM Utility vl. 3、ClustalX等設(shè)計(jì)軟件輔助完成，然后通過Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)進(jìn)行同源性比對(duì)以保證其特異性，合成的引物和探針用TE溶解，使用ND-1000UV-VIS波長(zhǎng)紫外/可見光掃描分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測(cè)定后，保存；所述TE為IOmM Tri-HCl, pH5. 0,0. ImM TA ；2) TpF-I基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的構(gòu)建，具體方法如下以硅膠膜-離心柱法提取梅毒螺旋體Nichols株DNA作為模板，采用步驟I)中的TpF-I基因的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體過程如下將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過回收及純化后，在微量離心管中配制DNA溶液，后加入5 μ L等量的Solution I，16°C反應(yīng)30min，與pMD18_T載體連接將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a中，冰中放置30min，42°C加熱45s后，再在冰中放置lmin，力口入LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min后，在含有X_Gal、IPTG、Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成單菌落，挑選白色菌落，進(jìn)行增殖培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行PCR，Xab I和Sal I雙酶切及測(cè)序鑒定后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切線性化處理，再用紫外分光光度計(jì)定量并_20°C保存作為FQ-PCR的標(biāo)準(zhǔn)品；3) TpF-I基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線制作，其具體方法如下包含TpF-I基因的陽(yáng)性克隆大腸桿菌在含Amp LB肉湯增菌，提取質(zhì)粒，取10 μ L質(zhì)粒用雙蒸水稀釋100倍,260nm, 280nm比色，純度=A26(I/A28(I,濃度=A260X 50 X 2 X 100 X IO-6X 6. 02 X IO23/(2806 X 324. 5 X 2) copies/mL,根據(jù)質(zhì)粒濃度，進(jìn)行梯度稀釋，以每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品作模板進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，確定線性范圍；4)制備PCR反應(yīng)液，其具體方法如下采用PCR緩沖液、MgCl2、dNTPs、TpF-I基因引物、探針的混合物共同組成PCR反應(yīng)液；5)制備耐熱DNA聚合酶，其具體方法如下大腸桿菌用異丙基硫代_β-D半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后的菌懸液IOOml 經(jīng) 5000r/min, 4°C離心 5min,以 IOml 緩沖液 I 重懸菌液，4°C，5000r/min,離心 5min,細(xì)菌沉淀再懸于5ml緩沖液I中，加入溶菌酶(Lys)使?jié)舛冗_(dá)5mg/ml，37°C水浴20min ;力口入5ml緩沖液II，75°C水浴45min,4°C, 15000r/min離心IOmin ;上清加入硫酸銨使達(dá)30%,4°C,1500r/min離心lOmin，沉淀溶于Iml緩沖液III中，并對(duì)緩沖液III在4°C條件下透析，每6h換液I次共4次，離心除去不溶物后，-20°C凍存；6)建立樣品處理方法，其具體方法如下使用梅毒螺旋體TpF-I基因FQ-PCR檢測(cè)試劑檢測(cè)梅毒螺旋體的樣本，采用硅膠膜-離心柱法提取模板DNA ；7)制備質(zhì)控品，其具體方法如下制備陰性質(zhì)控品選擇經(jīng)過臨床確認(rèn)為陰性的臨床標(biāo)本；制備陽(yáng)性質(zhì)控品選擇經(jīng)過臨床確認(rèn)為陽(yáng)性的臨床標(biāo)本經(jīng)稀釋獲得陽(yáng)性質(zhì)控品；8)制備梅毒螺旋體TpF-I基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，將DNA提取試劑、耐熱DNA聚合酶、PCR反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品共同組成梅毒螺旋體TpF-I基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。在步驟I)中，所述TpF-I基因探針和引物的序列如表I所示。表I
權(quán)利要求1.梅毒螺旋體TpF-I基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；所述DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶和質(zhì)控品瓶設(shè)在包裝盒內(nèi)；所述DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水こ醇瓶、抑制物去除液瓶、第I清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；所述標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含TpF-I基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；所述質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。
專利摘要梅毒螺旋體TpF-1基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒，涉及一種試劑盒。試劑盒設(shè)有DNA提取試劑瓶、耐熱DNA聚合酶瓶、PCR反應(yīng)液瓶、標(biāo)準(zhǔn)品瓶、質(zhì)控品瓶和包裝盒；DNA提取試劑瓶設(shè)有蛋白酶K瓶、裂解液瓶、無(wú)水乙醇瓶、抑制物去除液瓶、第1清洗緩沖液瓶、洗脫液瓶、第2清洗緩沖液瓶和含收集管的離心柱；標(biāo)準(zhǔn)品瓶設(shè)有6個(gè)含TpF-1基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒瓶；質(zhì)控品瓶設(shè)有陰性質(zhì)控品瓶和陽(yáng)性質(zhì)控品瓶。先篩選靶基因，再構(gòu)建TpF-1基因標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒，制作TpF-1基因檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)曲線后，先后制備PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶，建立樣品處理方法后，制備質(zhì)控品，最后完成梅毒螺旋體TpF-1基因FQ-PCR檢測(cè)試劑盒。
文檔編號(hào)C12R1/01GK202576423SQ20122020358
公開日2012年12月5日 申請(qǐng)日期2012年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月8日
發(fā)明者楊天賜, 張長(zhǎng)弓, 劉莉莉, 林麗蓉, 童曼莉, 徐竟波 申請(qǐng)人:廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院