專利名稱：一種微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，兩種細胞分別固定在各自特定的細胞培養(yǎng)區(qū)域，細胞之間通過微通道進行細胞間的信號傳輸與互相作用，在顯微鏡下可以直觀地研究兩種細胞在生長過程中的互相作用，以及分析細胞生長過程中的代謝產(chǎn)物，為研究細胞生物學(xué)提供了新思路和新研究技術(shù)，主要應(yīng)用于細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
20世紀(jì)80年代后期，為了建立更類似于體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)體系，盡可能使體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境相吻合，從而使細胞間能相互溝通信息，相互支撐生長增殖，人們在細胞培養(yǎng)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展出了細胞共培養(yǎng)技術(shù)。細胞共培養(yǎng)技術(shù)是將兩種或兩種以上的細胞共同培養(yǎng)于同一環(huán)境中，由于其具有更好地反映體內(nèi)環(huán)境的優(yōu)點，所以這種方法被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代細胞研究中。共培養(yǎng)體系主要作用誘導(dǎo)細胞向另一種細胞分化；誘導(dǎo)細胞自身分化；維持細胞功能和活力；調(diào)控細胞增殖；促進早期胚胎發(fā)育和提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量。從上世紀(jì)30年代開始，細胞培養(yǎng)逐漸成為研究人員實驗過程中不可缺少的重要步驟，其載體工具培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶也逐步被大家所認可，成為了一種常規(guī)的實驗耗材。雖然到目前為止，很多科學(xué)家認為培養(yǎng)皿/培養(yǎng)瓶的這種體外培養(yǎng)條件與體內(nèi)生長環(huán)境有著顯著的不同,但是由于沒有更好的培養(yǎng)載體來改變這個現(xiàn)狀，所以生物學(xué)家們也只能退而求次的默認這種情況的存在。常規(guī)的細胞培養(yǎng) 皿很難完成多種細胞的共培養(yǎng)，因此，發(fā)展一種便捷、快速、高效、低成本的多細胞培養(yǎng)技術(shù)，是細胞生物學(xué)等領(lǐng)域的迫切需求。近年來，微流控芯片分析技術(shù)已成為分析化學(xué)中一個重要的研究方向，是其中最活躍的一支，無論是在科研還是應(yīng)用領(lǐng)域都獲得了廣泛的重視。微流控芯片作為一種新型的分析檢測平臺，具有高通量、集成化、多重平行分析、便攜式、易操作、成本低等優(yōu)點，已經(jīng)在眾多領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。然而，采用微流控芯片，在其表面制備微結(jié)構(gòu)和微通道，依靠微通道中多層液體之間的層流效應(yīng)驅(qū)動樣品微流體，同時完成多種細胞的植入技術(shù)，目前在多種細胞共培養(yǎng)的應(yīng)用領(lǐng)域尚未有實質(zhì)性的突破。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供了一種微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，兩種細胞分別固定在各自特定的細胞培養(yǎng)區(qū)域，細胞之間通過微通道進行細胞間的信號傳輸與互相作用，在顯微鏡下可以直觀地研究兩種細胞在生長過程中的互相作用，以及分析細胞生長過程中的代謝產(chǎn)物，為研究細胞生物學(xué)提供了新思路和新研究技術(shù)，主要應(yīng)用于細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下的操作步驟(I)用計算機輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制微流控芯片中各層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。(2)通過微加工技術(shù)在各層微流控芯片基材表面和粘性薄膜上加工所需的微結(jié)構(gòu)和微通道，包括樣品池、廢液池、微孔和微通道。(3)利用雙層粘性薄膜，將各層離心式微流控芯片對齊、粘合、加壓封合，組成兩種細胞共培養(yǎng)的微流控芯片。(4)將不同細胞溶液從樣品池加入，控制微流體的層流速度，將兩種細胞植入到微流控芯片中的主微通道中。(5)完成兩種細胞在微通道中的植入后，進行細胞的培養(yǎng)。(6)細胞鋪滿培養(yǎng)區(qū)域形成細胞層后，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化，以及收集細胞代謝產(chǎn)物評價細胞間的互相影響。本發(fā)明中，微流控細胞培養(yǎng)芯片的芯片基材可以是PMMA、PC、PVC、C0C、銅、鋁、不銹
鋼、硅片、玻璃圓片，也可是市售的各類普通CD光盤。本發(fā)明中，微流 控細胞培養(yǎng)芯片的芯片和粘性薄膜的微結(jié)構(gòu)和微通道可以通過數(shù)控銑刻、激光刻蝕、LIGA技術(shù)、模塑法、熱壓法、化學(xué)腐蝕制備，也可用軟刻蝕技術(shù)制備。本發(fā)明中，微流控細胞培養(yǎng)芯片是由兩層芯片組成，各層芯片之間用粘性薄膜貼合，粘性薄膜可以是雙層力致粘性薄膜，也可是普通雙面膠薄膜。本發(fā)明中，微流控細胞培養(yǎng)芯片上的細胞溶液的驅(qū)動依靠溶液入口與出口間的液差產(chǎn)生的重力來實現(xiàn)的。本發(fā)明中，微流控細胞培養(yǎng)芯片的細胞植入是依靠微通道中多液流之間的層流現(xiàn)象完成的。本發(fā)明中，微流控細胞培養(yǎng)芯片采用原位植入細胞于BSA蛋白修飾的微通道表面。本發(fā)明中，微流控細胞培養(yǎng)芯片可以研究兩種細胞之間的互相作用。本發(fā)明提出的微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，操作簡單、實現(xiàn)了兩種種細胞的平行植入和共培養(yǎng)，降低了試劑與樣品的用量，簡化了細胞植入過程，在顯微鏡下可以直觀地研究兩種細胞在生長過程中的互相作用，以及分析細胞生長過程中的代謝產(chǎn)物，具有便攜、經(jīng)濟、快速、高效、準(zhǔn)確的特點，在細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景。


圖1.微流控細胞培養(yǎng)芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。a.左側(cè)細胞溶液加入?yún)^(qū)，b.右側(cè)細胞溶液加入?yún)^(qū)，c.細胞溶液儲備區(qū)，d.細胞溶液儲備區(qū)，e.細胞代謝物收集區(qū)。
具體實施方案實施例1用計算機輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制離心式微流控芯片的兩層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。利用數(shù)控CNC系統(tǒng)加工制備兩層圓片狀聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道，分別用自來水、蒸餾水清洗各層芯片，并用乙醇擦拭芯片表面殘留的指紋、油潰等污潰。在雙面膠薄膜上，用刻字機加工制備所需的微結(jié)構(gòu)和微通道。將兩層芯片小心對齊、粘合、加壓封合，制成兩種細胞共培養(yǎng)的微流控芯片。從左側(cè)和右側(cè)細胞溶液加入?yún)^(qū)分別加入兩種細胞溶液，控制左和右側(cè)細胞溶液加入?yún)^(qū)與細胞溶液儲備區(qū)的液差高度，從而控制層流速度，使細胞溶液緩慢流經(jīng)微通道，細胞因此吸附在用BSA蛋白修飾固定的微通道表面，從而完成兩種細胞的同時植入，每隔12小時更換一次細胞培養(yǎng)液，待細胞鋪滿培養(yǎng)區(qū)域形成單細胞層后，在顯微鏡下觀察細胞在生長過程中所發(fā)生的互相作用，以及收集細胞代謝產(chǎn)物分析細胞間的互相影響。實施例2用計算機輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制離心式微流控芯片的兩層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。利用數(shù)控CNC系統(tǒng)加工制備兩層圓片狀聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道，分別用自來水、蒸餾水清洗各層芯片，并用乙醇擦拭芯片表面殘留的指紋、油潰等污潰。在雙面膠薄膜上，用刻字機加工制備所需的微結(jié)構(gòu)和微通道。將兩層芯片小心對齊、粘合、加壓封合，制成多細胞共培養(yǎng)的微流控芯片。從左側(cè)和右側(cè)細胞溶液加入?yún)^(qū)分別加入兩種細胞溶液，控制左和右側(cè)細胞溶液加入?yún)^(qū)與細胞溶液儲備區(qū)的液差高度，從而控制層流速度，使細胞溶液緩慢流經(jīng)微通道，細胞因此吸附在用BSA蛋白修飾固定的微通道表面，從而完成兩種細胞的同時植入，每隔12小時更換一次細胞培養(yǎng)液，待細胞鋪滿培養(yǎng)區(qū)域形成單細胞層后，在顯微鏡下觀察細胞在生長過程中所發(fā)生的互相作用，以及收集細胞代謝產(chǎn)物分析細胞間的互相影 響。
權(quán)利要求
1.一種微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，兩種細胞分別固定在各自特定的細胞培養(yǎng)區(qū)域，細胞之間通過微通道進行細胞間的信號傳輸與互相作用，在顯微鏡下可以直觀地研究兩種細胞在生長過程中的互相作用，以及分析細胞生長過程中的代謝產(chǎn)物，為研究細胞生物學(xué)提供了新思路和新研究技術(shù)。
2.按權(quán)利要求1所述的微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，其制作步驟如下 (1)用計算機輔助設(shè)計軟件設(shè)計和繪制微流控芯片中各層芯片的微結(jié)構(gòu)和微通道圖形。
(2)通過微加工技術(shù)在各層微流控芯片基材表面和粘性薄膜上加工所需的微結(jié)構(gòu)和微通道，包括樣品池、廢液池、微孔和微通道。
(3)利用雙層粘性薄膜，將各層離心式微流控芯片對齊、粘合、加壓封合，組成兩種細胞共培養(yǎng)的微流控芯片。
(4)將不同細胞溶液從樣品池加入，控制微流體的層流速度，將兩種細胞植入到微流控芯片中的主微通道中。
(5)完成兩種細胞在微通道中的植入后，進行細胞的培養(yǎng)。
(6)細胞鋪滿培養(yǎng)區(qū)域形成細胞層后，通過顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化，以及收集細胞代謝產(chǎn)物評價細胞間的互相影響。
3.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細胞培養(yǎng)芯片的核心功能器件是微流控芯片，此芯片以液差產(chǎn)生的重力作為樣品微流體流動的驅(qū)動力，可以批量生產(chǎn)、多次利用、靈活設(shè)計與組裝。
4.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細胞培養(yǎng)芯片上的微結(jié)構(gòu)和微通道是通過數(shù)控銑刻、激光刻蝕、LIGA技術(shù)、模塑法、熱壓法、化學(xué)腐蝕、軟刻蝕技術(shù)的微加工方法在芯片基材表面制備，尺寸在微米級別。
5.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細胞培養(yǎng)芯片是由兩層芯片疊加而成，構(gòu)成三維立體的微結(jié)構(gòu)和微通道網(wǎng)絡(luò)。
6.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細胞培養(yǎng)芯片可以在一塊芯片上制作多組微結(jié)構(gòu)和微通道，構(gòu)成多組細胞培養(yǎng)單元，可同時培養(yǎng)多組樣品，提高了單位時間的平行培養(yǎng)能力。
7.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細胞培養(yǎng)芯片通過微通道中多液流之間的層流現(xiàn)象完成微通道中細胞的植入。
8.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細胞培養(yǎng)芯片在微通道表面進行BSA蛋白表面修飾后進行細胞的原位植入。
9.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細胞培養(yǎng)芯片可以用顯微鏡直觀地觀察兩種細胞層之間的細胞互相作用。
10.按權(quán)利要求1或2所述的微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，其特征在于，這種微流控細胞培養(yǎng)芯片便于觀察、設(shè)備簡單、樣品和試劑用量小，平行培養(yǎng)能力高、樣品無需轉(zhuǎn)移、樣品交叉污染幾率小，能更真實地反映人體組織細胞之間的互相影響，有利于實驗者觀察細胞與細胞之間互相作用，在細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微流控細胞培養(yǎng)芯片及其制備方法，該微流控芯片表面有微結(jié)構(gòu)和微通道，兩種細胞分別固定在各自特定的細胞培養(yǎng)區(qū)域，細胞之間通過微通道進行細胞間的信號傳輸與互相作用，在顯微鏡下可以直觀地研究兩種細胞在生長過程中的互相作用，以及分析細胞生長過程中的代謝產(chǎn)物，為研究細胞生物學(xué)提供了新思路和新研究技術(shù)，主要應(yīng)用于細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和藥物篩選等相關(guān)領(lǐng)域。該微流控芯片實現(xiàn)了兩種細胞的共培養(yǎng)，操作簡單、實現(xiàn)了兩種種細胞的平行植入和共培養(yǎng)，降低了試劑與樣品的用量，簡化了細胞植入過程，在顯微鏡下可以直觀地研究兩種細胞在生長過程中的互相作用，以及分析細胞生長過程中的代謝產(chǎn)物，具有便攜、經(jīng)濟、快速、高效、準(zhǔn)確的特點，為細胞生物學(xué)研究提供了一種全新的分析技術(shù)。
文檔編號C12M3/00GK103060194SQ20121058706
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者葉嘉明, 王曉東, 沙俊, 聶富強 申請人:蘇州汶顥芯片科技有限公司