專利名稱：一種采用碲化鎘量子點清除帕金森模式細胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物納米材料領(lǐng)域，具體涉及一種采用碲化鎘量子點清除帕金森模式細胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
帕金森癥(Parkinson’s disease,PD)是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病,在全世界40歲以上的人口中，有超過O. 1%的人受到該疾病的影響。在臨床上多數(shù)病人在表現(xiàn)為活動失調(diào)及靜止時不自主的顫抖，心情煩躁、抑郁或精神異常，給社會和病人家庭帶來了極大的經(jīng)濟與精神負擔，因而對此疾病的研究也越來越受到人們的重視。帕金森癥在病理學表現(xiàn)為患者大腦黑質(zhì)致密部多巴胺神經(jīng)元的喪失，路易包涵體增多。而路易體主要是由一些稱為α-核突觸蛋白錯誤折疊和聚集形成的淀粉樣蛋白質(zhì)纖維組成，另外這種錯誤折疊的蛋白在體內(nèi)積累也對多巴胺神經(jīng)元有很大的毒性，促使其凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)α-核突觸蛋白的過表達和錯誤折疊在帕金森癥形成過程中具有重要作用。很多研究發(fā)現(xiàn)細胞自噬可以幫助神經(jīng)元細胞清除具有細胞毒性的異常蛋白質(zhì)的積累的作用，而細胞自噬是一種廣泛存在于真核細胞內(nèi)的溶酶體依賴性的降解途徑，與人體生理過程和疾病有著密切的關(guān)系，例如腫瘤、神經(jīng)變性、微生物感染和老化均與自噬的功能失調(diào)有關(guān)。目前，已有多種納米材料被報道可以誘導細胞產(chǎn)生自噬。其中，不同類型的量子點也被Nano Lett和Angew Chem雜志報道可以使細胞發(fā)生自曬。而α -核突觸蛋白的異常積聚又與其降解通路的障礙有關(guān)，自噬的激活不僅可以降低聚集體的形成，而且可以明顯改善其行為表現(xiàn)。然而以往對α-核突觸蛋白降解的研究主要集中在泛素化降解途徑，只是近幾年的報道顯示，自噬也參與了 α-核突觸蛋白的降解，并發(fā)揮更重要的角色。因而，通過調(diào)控自噬進而促進α-核突觸蛋白的清除成為延緩帕金森疾病進展的一個潛在治療靶點。但是，直到目前為止，都還未曾出現(xiàn)通過有效引發(fā)帕金森模式細胞的自噬進而清除細胞內(nèi)有毒的α-核突觸蛋白的研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種采用碲化鎘量子點清除帕金森模式細胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明涉及一種采用碲化鎘量子點清除帕金森模式細胞中產(chǎn)生的α -核突觸蛋白的方法，包括將帕金森模式細胞消化獲得的細胞懸液按每孔3 X IO4IX IO5個鋪6孔板，待細胞貼壁后吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，并向其中加入含有4-75ηΜ碲化鎘量子點的培養(yǎng)基，所述帕金森模式細胞中過量表達的α-核突觸蛋白在所述碲化鎘量子點的作用下得到明顯清除；其中，所述帕金森模式細胞是使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建并使用全反式維甲酸和十四烷酰佛波醇乙酸酯誘導分化的SH-SY5Y細胞或使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建的分化的PC12細胞。
所述碲化鎘量子點的濃度優(yōu)選為4_18nM。所述締化鎘量子點的濃度優(yōu)選為4nM。所述SH-SY5Y細胞的帕金森模式細胞的構(gòu)建方法包括1)細胞分化將所述SH-SY5Y細胞在含有O. OlmM全反式維甲酸(ATRA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 3天后，換含80nM十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 3天，然后換不含有分化劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)f 2天；2)細胞鋪板待分化細胞長滿后消化獲得細胞懸液，進行細胞計數(shù)，按每孔3X IO4^XlO5個鋪6孔板；3)加藥處理待6孔板內(nèi)細胞貼壁后，吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入O. 5-50mMl-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)的培養(yǎng)稀釋液，孵育6(Γ72小時。其中，所述步驟3)中1-甲基-4-苯基-吡啶離子的濃度優(yōu)選為ImM。所述PC12細胞的帕金森模式細胞的構(gòu)建方法包括1)細胞鋪板將所述PC12細胞消化獲得的細胞懸液進行細胞計數(shù)，按每孔3X 10，3X IO5個細胞鋪6孔板；2)加藥處 理待6孔板內(nèi)細胞貼壁后，吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入O. 5-50mMmMl-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)的培養(yǎng)稀釋液2ml，孵育36 48小時。其中，所述步驟2)中MPP+的濃度優(yōu)選為5mM。所述締化鎘量子點的粒徑為3_5nm。所述碲化鎘量子點由微波法合成。本發(fā)明還提供一種碲化鎘量子點作為制備治療帕金森癥藥物的應(yīng)用。所述締化鎘量子點的粒徑為3_5nm。本發(fā)明人通過深入研究發(fā)現(xiàn)低濃度碲化鎘量子點具有良好的生物相容性，并且發(fā)現(xiàn)這種低濃度碲化鎘量子點可作為自噬激活劑，引起細胞自噬，從而有效清除帕金森模型中過表達和錯誤折疊的α -核突觸蛋白，因此提供了這樣一種采用低濃度碲化鎘量子點清除帕金森模式細胞中產(chǎn)生的α -核突觸蛋白的方法，為帕金森癥的預(yù)防和治療指明了方向，并為制備治療帕金森癥的藥物開辟了一條嶄新的道路。本發(fā)明所使用的試劑和生物材料均為市場上可購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。


圖1是示出了不同濃度的碲化鎘量子點的生物相容性的示意圖；圖2Α和2Β是示出了不同濃度(4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ)的碲化鎘量子點引發(fā)兩種帕金森模式細胞產(chǎn)生自曬的不意圖；圖3Α和3Β是示出了不同濃度(4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ)的碲化鎘量子點引發(fā)兩種帕金森模式細胞產(chǎn)生自噬從而清除帕金森模式細胞產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的示意圖。
具體實施例方式為了更好地理解本發(fā)明的內(nèi)容，下面結(jié)合具體的實施例和圖例來進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明不受其限制。實施例1水溶性碲化鎘量子點的制備(參照CN1693206A制備)I)碲氫化鉀的制備將110. 5毫克KBH4固體和91. 6毫克碲粉放到一個燒瓶中，力口入3毫升水，在O攝氏度下反應(yīng)20小時后，可得到KHTe溶液，備用；2)碲化鎘前體溶液的制備將36. 8毫克CdCl2溶于100毫升水，加入O. 05毫升巰基乙酸，用O. 5摩爾/升的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=l1. 0，得到碲化鎘前體溶液，通氮氣除氧氣，氮氣保護下存放；3)程序控制微波輻射制備CdTe量子點將制備得到的碲化鎘前體溶液進行程序控制微波加熱，得到水溶性碲化鎘量子點。其中微波加熱條件為第一程序微波功率70W，第一程序加熱溫度90攝氏度，第一程序加熱時間30秒鐘；第二程序微波功率500W，第二程序加熱溫度100攝氏度，第二程序加熱時間為10分鐘。實際上，采用微波法合成的粒徑在3_5nm左右的常規(guī)水溶性碲化鎘量子點均適用于本發(fā)明的方法。實施例2采用噻唑藍方法對碲化鎘量子點的生物相容性的檢測實驗方法噻唑藍法(MTT)是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性噻唑藍還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。PH2. 5的十二烷基硫酸鈉能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免 疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞活性。檢測過程包括以下幾個步驟I)細胞培養(yǎng)將SH-SY5Y細胞(來源于人類多巴胺能神經(jīng)母瘤細胞系，購自中國科學院細胞庫)或者PC12細胞(來源于大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細胞瘤，購自中國科學院細胞庫)在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分數(shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)
基中培養(yǎng)；2)細胞鋪板待細胞長滿后消化獲得細胞懸液,進行細胞計數(shù),按每孔3 X IO5個細胞鋪96孔板，分為空白對照組和實驗組；3)量子點處理待96孔板內(nèi)細胞貼壁后，實驗組吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基,分別加入4nM、18nM、75nM的碲化鎘量子點的培養(yǎng)稀釋液100 μ 1，空白對照組不做處理，按要求孵育24小時；4 )加入噻唑藍按要求孵育24小時后，每孔(包括空白對照組和實驗組)加入10 μ I的5mg/ml的噻唑藍，混勻，孵育4小時；5)加入十二烷基硫酸鈉待孵育噻唑藍4小時后，每孔加入100 μ I十二烷基硫酸鈉(10%，pH2. 5)，37°C孵育過夜；6)酶標儀檢測加入十二烷基硫酸鈉過夜后，用酶標儀(Bio-Rad Model680,Microplate Reader)在490nm和570nm觀察光吸收值(0D值)。細胞生存率=(實驗組OD值-空白組OD值)X 100%如圖1所示，MTT結(jié)果表明碲化鎘量子點在低濃度(4nM、18nM，75nM)的時候毒性都較小，SH-SY5Y和PC12的細胞存活率影響不大，證明4-75nM的碲化鎘量子點的生物相容性良好，其中，4nM的碲化鎘量子點生物相容性最好。實施例3細胞是否發(fā)生自噬的檢測實驗方法當細胞發(fā)生自噬效應(yīng)時，細胞質(zhì)中分子量為18Kd的LC3 I蛋白與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結(jié)合，形成16Kd的LC3 II，并定位于自噬體膜。LC3 II相對于LC3 I兩種蛋白含量的比例反映了細胞的自噬活性，本發(fā)明采用的是免疫印跡法來檢測LC3 II /LC3 I的值從而檢測量子點對細胞自噬的影響。檢測過程包括以下幾個步驟
I)細胞培養(yǎng)將SH-SY5Y或者PC12細胞在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分數(shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；2)細胞鋪板待細胞長滿后消化獲得細胞懸液,進行細胞計數(shù),按每孔3 X IO5個細胞鋪6孔板，分為空白對照組和實驗組；3)碲化鎘量子點處理待6孔板內(nèi)細胞貼壁后，實驗組吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，分別加入4nM、18nM、75nM的碲化鎘量子點的培養(yǎng)稀釋液2ml，空白對照組不做處理，孵育24小時；4)裂解細胞吸掉培養(yǎng)基，每孔(包括空白對照組和實驗組)加入100 μ IlX十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液裂解細胞，然后將細胞裂解液在95°C水浴煮10分鐘；5)免疫印跡首先制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，然后將細胞裂解液上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗二抗，其中，一抗為Novus公司的LC3兔抗人抗體,二抗是購自KPL公司HRP標記的羊抗兔抗體，依次孵育最后進行ECL反應(yīng)并X光片成像； 6)用Image J軟件進行灰度分析，得到LC3 II /LC3 I的數(shù)據(jù)。如圖2A和2B所示，相對于空白對照組，不同濃度的碲化鎘量子點處理的SH-SY5Y細胞或者PC12細胞都發(fā)生了明顯的LC3 I向LC3 II的轉(zhuǎn)化，這表明不同濃度的碲化鎘量子點都可以誘導細胞發(fā)生自噬。實施例4建立SH-SY5Y細胞損傷的帕金森模型實驗方法本發(fā)明應(yīng)用1-甲基-4-苯基-卩比唳離子(MPP+)在體外構(gòu)建全反式維甲酸(ATRA)和十四烷酰佛波醇乙酸酯(TPA)誘導分化的SH-SY5Y細胞損傷的帕金森模型，并通過免疫印跡的方法檢測α-核突觸蛋白的表達，從而衡量構(gòu)建效果。該構(gòu)建方法僅為一種優(yōu)選的實施方式，而本發(fā)明保護的清除α-核突觸蛋白的方法并不僅限于由該方法制備的帕金森模型。該方法包括以下步驟 I)細胞培養(yǎng)SH_SY5Y細胞在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分數(shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞長滿后消化、鋪板；2)細胞分化細胞在含有O. OlmM ATRA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)三天后，換含80nM TPA的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)三天，然后換不含有分化劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)兩天；3)細胞鋪板待分化細胞長滿后消化獲得細胞懸液,進行細胞計數(shù),按每孔3 X IO5個細胞鋪6孔板，分為空白對照組和實驗組；4)加藥處理待6孔板內(nèi)細胞貼壁后，實驗組吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入ImMMPP+的培養(yǎng)稀釋液2ml，空白對照組不做處理，孵育72小時；5)裂解細胞吸掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μ IlX十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液裂解細胞，然后將細胞裂解液在95°C水浴煮10分鐘；6)免疫印跡首先制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，然后將細胞裂解液上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗二抗依次孵育最后進行ECL反應(yīng)并X光片成像；7)用Image J軟件進行灰度分析，得到α -核突觸蛋白/微絲蛋白(內(nèi)參)的數(shù)據(jù)。實施例5建立PC12細胞損傷的帕金森模型實驗方法本發(fā)明應(yīng)用1-甲基-4-苯基-吡啶離子(MPP+)在體外構(gòu)建高分化的PC12細胞損傷的帕金森模型，并通過免疫印跡的方法檢測α -核突觸蛋白的表達，從而衡量構(gòu)建效果。該構(gòu)建方法僅為一種優(yōu)選的實施方式，而本發(fā)明保護的清除α-核突觸蛋白的方法并不僅限于由該方法制備的帕金森模型。該方法包括以下步驟I)細胞培養(yǎng)將PC12細胞在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分數(shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞長滿后消化、鋪板；2)細胞鋪板待分化細胞長滿后消化獲得細胞懸液,進行細胞計數(shù),按每孔3 X IO5個細胞鋪6孔板，分為對照組和實驗組；3)加藥處理待6孔板內(nèi)細胞貼壁后，實驗組吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入ImMMPP+的培養(yǎng)稀釋液2ml，空白對照組不做處理，孵育48小時；4)裂解細胞吸掉培養(yǎng)基，每孔加入100 μ IlX十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液裂解細胞，然后將細胞裂解液在95°C水浴煮10分鐘； 5)免疫印跡首先制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，然后將細胞裂解液上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗二抗依次孵育最后進行ECL反應(yīng)并X光片成像；6)用Image J軟件進行灰度分析，得到α -核突觸蛋白/微絲蛋白(內(nèi)參)的數(shù)據(jù)。實施例6碲化鎘量子點處理可以清除SH-SY5Y細胞損傷的帕金森模型中過量表達的α-核突觸蛋白實驗方法本發(fā)明通過對采用生物相容性好的碲化鎘量子點(4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ)處理的SH-SY5Y細胞損傷的帕金森模型中α -核突觸蛋白表達量的測定，從而評價碲化鎘量子點處理是否可以清除SH-SY5Y細胞損傷的帕金森模型中過量表達的α -核突觸蛋白。該方法包括以下步驟I)細胞培養(yǎng)采用實施例4步驟2)中分化好的SH-SY5Y細胞在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分數(shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞長滿后消化；2)細胞鋪板待分化細胞長滿后消化獲得細胞懸液，進行細胞計數(shù)，按每孔3 X IO5個細胞鋪6孔板,分為MPP+處理組、空白對照組、MPP+及量子點處理組；3)加藥處理待6孔板內(nèi)細胞貼壁后，實驗組(包括MPP+處理組、MPP+及量子點處理組)吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，分別加入含有ImM MPP+、含有ImM MPP+及4nM、18nM、75nM碲化鎘量子點的培養(yǎng)稀釋液2ml，空白對照組不做處理，孵育f 3天，優(yōu)選72小時；4)裂解細胞吸掉培養(yǎng)基，每孔(包括空白對照組和實驗組)加入100 μ IlX十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液裂解細胞，然后將細胞裂解液在95°C水浴煮10分鐘；5)免疫印跡首先制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，然后將細胞裂解液上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗二抗，其中一抗為Abcam公司的α -核突觸蛋白兔抗人抗體，二抗為購自KPL公司HRP標記的羊抗兔抗體，依次孵育最后進行ECL反應(yīng)并X光片成像；6)用Image J軟件進行灰度分析，得到α _核突觸蛋白/微絲蛋白(其中，微絲蛋白為內(nèi)參)的數(shù)據(jù)。如圖3Α所示，其一，相較于空白對照組，MPP+處理組的細胞中α-核突觸蛋白的表達有了明顯的上調(diào)，這表明我們成功構(gòu)建了 SH-SY5Y細胞損傷的帕金森模型；其二，相較于MPP+處理組，量子點與MPP+的共處理可以明顯清除SH-SY5Y細胞損傷的帕金森模型中過量表達的α-核突觸蛋白。本實驗結(jié)果表明經(jīng)過MPP+處理成功構(gòu)建了 SH-SY5Y細胞損傷的帕金森模式細胞，并且4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ碲化鎘量子點均可有效清除該帕金森模式細胞中的α -核突觸蛋白。雖然本實施例中所使用的MPP+的濃度為ImM，但是實際上先前已有文獻證明O. 5^50mM MPP+范圍內(nèi)的工作濃度均是可行的。由于MPP+對細胞有一定的毒性，當MPP+的濃度為ImM時可以減輕急性損傷，保證SH-SY5Y細胞損傷的帕金森模型更好的建立，為最優(yōu)選濃度。鑒于實施例2中所述，4nM的碲化鎘量子點對SH-SY5Y細胞具有更好的生物相容性，所以有效清除SH-SY5Y細胞損傷的帕金森模式細胞中的α -核突觸蛋白實驗的碲化鎘量子點的濃度最優(yōu)選為4ηΜ 。實施例7碲化鎘量子點處理可以清除PC12細胞損傷的帕金森模型中過量表達的α-核突觸蛋白實驗方法本發(fā)明通過對采用生物相容性好的碲化鎘量子點(4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ)處理的PC12細胞損傷的帕金森模型中α -核突觸蛋白表達量的測定，從而評價量子點處理是否可以清除PC12細胞損傷的帕金森模型中過量表達的α -核突觸蛋白。該方法包括以下步驟I)細胞培養(yǎng)PC12細胞在37°C，含5%C02的培養(yǎng)箱中用含有體積分數(shù)10%的胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細胞長滿后消化、鋪板；2)細胞鋪板待分化細胞長滿后消化獲得細胞懸液,進行細胞計數(shù),按每孔3 X IO5個細胞鋪6孔板,分為MPP+處理組、空白對照組、MPP+及量子點處理組和量子點處理組；3)加藥處理待6孔板內(nèi)細胞貼壁后，實驗組(包括MPP+處理組、MPP+及量子點處理組)吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，分別加入含有5mM MPP+、含有5mM MPP+及4nM、18nM、75nM碲化鎘量子點的培養(yǎng)稀釋液2ml，孵育Γ3天，優(yōu)選72小時；4)裂解細胞吸掉培養(yǎng)基，每孔(包括空白對照組和實驗組)加入100 μ IlX十二烷基硫酸鈉上樣緩沖液裂解細胞，然后將細胞裂解液在95°C水浴煮10分鐘；5)免疫印跡首先制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠，然后將細胞裂解液上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以及一抗二抗，其中，一抗為Abcam公司的α -核突觸蛋白兔抗人抗體，二抗為購自KPL公司HRP標記的羊抗兔抗體，依次孵育最后進行ECL反應(yīng)并X光片成像；6)用Image J軟件進行灰度分析，得到α -核突觸蛋白/微絲蛋白(內(nèi)參)的數(shù)據(jù)。如圖3Β所示，其一，相較于空白對照組，MPP+處理組的細胞中α-核突觸蛋白的表達有了明顯的上調(diào)；其二，相較于MPP+處理組，量子點與MPP+的共處理可以明顯清除PC12細胞損傷的帕金森模型中過量表達的α -核突觸蛋白。本實驗結(jié)果表明經(jīng)過MPP+處理成功構(gòu)建了 PC12細胞損傷的帕金森模式細胞，并且4ηΜ、18ηΜ、75ηΜ碲化鎘量子點均可有效清除該帕金森模式細胞中的α -核突觸蛋白。雖然本實施例中所使用的MPP+的濃度為5mM，但是實際上先前已有文獻證明0.5 50mM MPP+范圍內(nèi)的工作濃度均是可行的。由于MPP+對細胞有一定的毒性，當MPP+的濃度為5mM時可以減輕急性損傷，保證PC12細胞損傷的帕金森模型更好的建立，為最優(yōu)選濃度。本發(fā)明實施例中所使用的培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基，但是應(yīng)當理解，任何適于普通細胞生長的培養(yǎng)基都適用于本發(fā)明。鑒于實施例2中所述，4nM的締化鎘量子點對PC12細胞具有更好的生物相容性,所以有效清除PC12細胞損傷的帕金森模式細胞中的α -核突觸蛋白實驗的碲化鎘量子點的濃度最優(yōu)選為4ηΜ。本發(fā)明公開了一種采用碲化鎘量子點清除帕金森模式細胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法及其應(yīng)用，其原理是通過低濃度碲化鎘量子點作為自噬激活劑引起細胞自噬，從而達到清除α-核突觸蛋白的目的。相對于前人的結(jié)論而言對納米材料的生物學效應(yīng)有了更深的認識，也將對量子點和其他納米材料的應(yīng)用起到指導作用。以上雖然描述了本發(fā)明的具體實施方式
，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當理解，這些僅是舉例說明，本發(fā)明的保護范圍是由所附權(quán)利要求書限定的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不背 離本發(fā)明的原理和實質(zhì)的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改，但這些變更和修改均落入本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種采用碲化鎘量子點清除帕金森模式細胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法，其特征在于，包括 將帕金森模式細胞消化獲得的細胞懸液按每孔3 X IO4IX IO5個鋪6孔板，待細胞貼壁后吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，并向其中加入含有4-75ηΜ碲化鎘量子點的培養(yǎng)基，所述帕金森模式細胞中過量表達的α-核突觸蛋白在所述碲化鎘量子點的作用下得到明顯清除； 其中，所述帕金森模式細胞是使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建并使用全反式維甲酸和十四烷酰佛波醇乙酸酯誘導分化的SH-SY5Y細胞或使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建的分化的PC12細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述碲化鎘量子點的濃度為4ηΜ。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述SH-SY5Y細胞的帕金森模式細胞的構(gòu)建方法包括 O細胞分化將所述SH-SY5Y細胞在含有全反式維甲酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，換含十四烷酰佛波醇乙酸酯的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，然后換不含有分化劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)； 2)細胞鋪板待分化細胞長滿后消化獲得細胞懸液，進行細胞計數(shù)，按每孔3 X IO4 3 X IO5個鋪6孔板; 3)加藥處理待6孔板內(nèi)細胞貼壁后，吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入O.5-50mMl-甲基-4-苯基-吡啶離子的培養(yǎng)稀釋液，孵育。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中1-甲基-4-苯基-吡啶離子的濃度為ImM。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述PC12細胞的帕金森模式細胞的構(gòu)建方法包括 O細胞鋪板將所述PC12細胞消化獲得的細胞懸液進行細胞計數(shù)，按每孔3 X IO4 3 X IO5個細胞鋪6孔板； 2)加藥處理待6孔板內(nèi)細胞貼壁后，吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入O. 5-50mMl-甲基-4-苯基-吡啶離子的培養(yǎng)稀釋液，孵育。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中1-甲基-4-苯基-吡啶離子的濃度為5mM。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述碲化鎘量子點的粒徑為3-5nm。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述碲化鎘量子點由微波法合成。
9.一種碲化鎘量子點作為制備治療帕金森癥藥物的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述碲化鎘量子點的粒徑為3-5nm。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種采用碲化鎘量子點清除帕金森模式細胞中產(chǎn)生的α-核突觸蛋白的方法及其應(yīng)用，包括將帕金森模式細胞消化獲得的細胞懸液按每孔3×104～3×105個鋪6孔板，待細胞貼壁后吸掉孔內(nèi)培養(yǎng)基，并向其中加入含有4-75nM碲化鎘量子點的培養(yǎng)基，所述帕金森模式細胞中過量表達的α-核突觸蛋白在所述碲化鎘量子點的作用下得到明顯清除；其中，所述帕金森模式細胞是使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建并使用全反式維甲酸和十四烷酰佛波醇乙酸酯誘導分化的SH-SY5Y細胞或使用1-甲基-4-苯基-吡啶離子在體外構(gòu)建的分化的PC12細胞。本發(fā)明通過生物相容性良好的碲化鎘量子點誘發(fā)細胞發(fā)生自噬效應(yīng)，從而清除帕金森模式細胞中過量表達的毒性蛋白質(zhì)(α-核突觸蛋白)。
文檔編號C12N5/09GK103013922SQ20121058612
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月28日
發(fā)明者黃慶, 陳楠, 李曉明, 魏敏, 樊春海 申請人:中國科學院上海應(yīng)用物理研究所