專利名稱：長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，包括引物、探針及其試劑盒，具體是一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，針對長春堿類藥物使用者基因內(nèi)3個生物標(biāo)記的引物、探針及其試劑盒。
背景技術(shù)：
化療在目前是惡性腫瘤治療的重要手段，臨床化療的效果對于腫瘤患者的治療和提高生存期有著至關(guān)重要的影響。對于不同的患者，不同的化療藥物的效果差異很大；腫瘤患者對化療的反應(yīng)不同，很多時候是由于對化療藥物敏感性存在差異；由于臨床醫(yī)生往往只能憑經(jīng)驗對不同患者使用某種化療藥物或化療方案，帶有一定的盲目性，因此很多腫瘤患者的化療效果并不理想，往往達不到化療的預(yù)期目的；所以，一個能夠在化療前篩選出針對性強、患者敏感度較高化療藥物的檢測方法，對于提高個體化治療效果，提高化療的成功率，有著重要的意義。近年來國內(nèi)外腫瘤和化療藥物研究領(lǐng)域相繼創(chuàng)建了一系列體內(nèi)或體外預(yù)測腫瘤化療藥物敏感性的方法；常用的有裸鼠皮下移植藥敏測定法、人體腫瘤細胞集落測定法、放射性標(biāo)記代謝物前體摻入法、MTT比色、三磷酸腺苷法和快速熒光分析等等；這些方法均存在一些缺點，要么費用昂貴且檢測周期長，不適合常規(guī)使用；要么需要在體外培養(yǎng)原發(fā)腫瘤，檢測成功率低；這些缺陷把腫瘤化療藥敏實驗限制在了研究性的實驗室里，很少有大規(guī)模使用的報道。藥物基因組 學(xué)(pharmacogenomics)研究的進展為從分子水平研制和開發(fā)新一代的，針對藥物敏感性進行檢測的試劑盒提供了理論基礎(chǔ)和大量的實驗數(shù)據(jù)；實驗證明，個體基因水平上的差異，包括基因多態(tài)性、基因突變和表達差異等，與腫瘤患者對藥物的敏感性密切相關(guān)；通過檢測患者在這些基因上與藥物敏感性相關(guān)的生物標(biāo)記，可以預(yù)測患者對腫瘤化療藥物的敏感性，幫助進一步指導(dǎo)選擇合理的化療方案。長春堿類藥物是從夾竹桃科植物長春花中提取的生物堿。此類化合物具有抗腫瘤活性，目前被應(yīng)用與臨床化療中的有長春堿、長春新堿、長春地辛和長春瑞賓等多種藥物，主要用于何杰金氏病和絨毛膜癌；長春堿類化合物可以與細胞中的微管蛋白結(jié)合，抑制微管聚合，妨礙紡錘體微管的形成，使細胞分裂停滯在中期；長春堿類藥物通過干擾細胞周期的正常進行，抑制細胞的分裂增殖，從而達到抑制腫瘤細胞的效果。研究人員發(fā)現(xiàn)ABCBl基因上的幾個生物標(biāo)記與長春堿類藥物敏感性密切相關(guān)；ABCBl基因編碼P糖蛋白(P-glycoprotein P_gp),是一種廣譜的多藥外排泵；P_ gp可以通過它的疏水位點與疏水性抗腫瘤藥物結(jié)合，通過ATP水解供能，逆濃度梯度將藥物泵出細胞外，導(dǎo)致細胞內(nèi)藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥；P_gp的轉(zhuǎn)運底物包括長春堿類化合物，因此ABCBl的基因變化導(dǎo)致個體對長春堿類藥物的敏感性不同；通過設(shè)計試劑盒，檢測ABCBl基因上的多個SNP生物標(biāo)記，可以方便、快速的預(yù)測長春堿類藥物對患者個體的療效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用SNP標(biāo)記檢測方便快捷，準(zhǔn)確率高的優(yōu)點，采用Seqnome檢測技術(shù)，提供一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，包括PRC弓I物、延伸弓I物和試劑盒。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:本發(fā)明涉及一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的PCR擴增引物，含有SEQ ID N0.1 3所示的上游引物和SEQ ID N0.4 6所示的下游引物。本發(fā)明涉及一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的單堿基延伸引物，含有SEQ ID N0.7 9所示的單堿基延伸引物。本發(fā)明設(shè)計一種試劑盒，由PCR擴增試劑組、SAP酶試劑組和iPLEX試劑組構(gòu)成，其中PCR擴增試劑組含有:PCR緩沖液、MgCl2、dNTP混合液、Hotstar Taq酶、純水和如SEQID N0.1 3所示的上游引物和如SEQ ID N0.4 6所示的下游引物；SAP酶試劑組含有:SAP緩沖液、SAP酶和純水；iPLEX試劑組含有:iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQ ID N0.7 9所示的單堿基延伸引物。上述標(biāo)記組合優(yōu)選利用飛行質(zhì)譜(MALD1-T0F)方法進行檢測，檢測方法包括以下步驟:
(1)提取基因組DNA，包括提取抗凝血DNA和口腔上皮細胞DNA；
(2)飛行質(zhì)譜檢測SNP多態(tài)；
(3)根據(jù)SNP分型結(jié)果推斷長春堿類藥物敏感度。
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本發(fā)明對ABCBl基因上的三個SNP生物標(biāo)記進行分型，建立了一個快速，簡便，且成本低廉的檢測試劑盒，該試劑盒準(zhǔn)確度高，靈敏性好，具有很強的實用價值。
具體實施例方式實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1:采用飛行質(zhì)譜方法對腫瘤患者進行SNP分型及長春堿類藥物敏感度檢測:
一)提取基因組DNA:本試驗的樣本是使用刮棒采集的口腔粘膜細胞，室溫保存，刮棒采樣DNA提取的具體步驟如下:將口腔刮棒上的脫落細胞溶于400 μ L IX裂解液中，加入
Iμ L蛋白酶K，56度水浴30分鐘；取出樣品置冰水浴I分鐘，加入6mol/L NaCl 150 μ L，劇烈振蕩15-20秒，13000轉(zhuǎn)離心10分鐘；吸取上清液至新的離心管中，加入1.1mL無水乙醇，上下顛倒10次至絮狀DNA沉淀出現(xiàn)。室溫放置10分鐘，13000轉(zhuǎn)離心2分鐘沉淀DNA ;棄去上清液，再加入0.25mL70%乙醇洗滌DNA沉淀，室溫放置I分鐘后，13000轉(zhuǎn)離心5分鐘；用移液器小心吸取乙醇，然后放入通風(fēng)櫥中通風(fēng)10分鐘，然后用35 μ L TE溶解DNA ;DNA可在4度保存1-2個月，或者存放在-20度長期保存；使用18PL PCR Master Mix反應(yīng)液以及2PL DNA模板，PCR擴增β -actin片斷，1.5%瓊脂糖凝膠，120V電泳15分鐘，觀察結(jié)果合格后轉(zhuǎn)移至PCR管中；紫外分光光度計SMA3000測定溶液中DNA的濃度和A260/A280比值，測量3次取平均值，濃度應(yīng)在30ng/y L，A260/A280比值應(yīng)該在1.7-2.0之間，合格的DNA 4°C取用或_20°C保存；
二)飛行質(zhì)譜檢測SNP多態(tài)采用本發(fā)明中所述試劑盒對樣本中的SNP生物標(biāo)記進行檢測，下面為檢測過程:
1)引物與DNA稀釋以及質(zhì)檢:PCR引物稀釋至終濃度為0.5μΜ ;根據(jù)Sequenom的稀釋公式，按照單堿基延伸引物的分子量將引物稀釋至終濃度為7-14 μ M之間；
2)PCR擴增:在每個384孔PCR板中加入Iμ L DNA和4 μ L PCR擴增試劑，共5 μ L，按照PCR儀程序I進行擴增；PCR擴增程序1:94°C 15min
權(quán)利要求
1.一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的PCR擴增引物，其特征在于，包含SEQID N0.1 3所示的上游引物和SEQ ID N0.4 6所示的下游引物。
2.一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的弓I物單堿基延伸引物，其特征在于，包含SEQ ID N0.7 9所示的單堿基延伸引物。
3.一種用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，其特征在于，由PCR擴增試劑組、SAP試劑組、iPLEX試劑組構(gòu)成: [ 1)PCR擴增試劑組含有:PCR緩沖液、MgCl2, dNTP混合液、Hotstar Taq酶、純水和如SEQ ID N0.1 3所示的上游引物和如SEQ ID N0.4 6所示的下游引物； [2)SAP酶試劑組含有:SAP緩沖液、SAP酶和純水； [3)iPLEX試劑組含有:iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQ IDN0.7、所示的單堿基延伸引物。
4.根據(jù)權(quán)力要求3所述的方法制造的試劑盒，包括具有一系列特征的試劑盒: [1)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的PCR擴增緩沖液為10X緩沖液，含2mM MgCl2 ；[2)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的MgCl2濃度為2mM； [3)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的dNTP混合液的濃度為500 μ M ；[4)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的HotstarTaq酶為0.5U ； [5)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的SAP緩沖液為IOX緩沖液； [6)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的SAP酶為1.7 U/ μ L的蝦堿性磷酸酶； [7)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的iPLEX緩沖液IOX緩沖液； [8)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的ddNTP混合液為經(jīng)過質(zhì)量修飾的核苷酸 ； [ 9)根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法制造的試劑盒，其特征是，所述的單堿基延伸酶為iPLEX聚合酶。
全文摘要
一種分子生物技術(shù)領(lǐng)域的用于長春堿類抗腫瘤藥物敏感度檢測的方法，包括引物、探針及其試劑盒，該試劑盒由PCR擴增試劑組、SAP酶試劑組、iPLEX試劑組構(gòu)成；PCR擴增試劑組含有PCR緩沖液、MgCl2、dNTP混合液、HotstarTaq酶、純水和如SEQIDNo.1~3所示的上游引物和如SEQIDNo.4~6所示的下游引物；SAP酶試劑組含有SAP緩沖液、SAP酶和純水；iPLEX試劑組含有iPLEX緩沖液、ddNTP混合液、iPLEX聚合酶、純水和如SEQIDNo.7~9所示的單堿基延伸引物；利用該試劑盒將腫瘤患者的DNA提取并處理后，可利用飛行質(zhì)譜方法，檢測引物擴增片段內(nèi)的生物標(biāo)記，并基于檢測結(jié)果評價腫瘤患者對長春堿類藥物的敏感度，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，方法快速簡便并且有很高通量。
文檔編號C12N15/11GK103074421SQ20121056196
公開日2013年5月1日 申請日期2012年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月22日
發(fā)明者王健, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:上海迪道科技有限公司, 郭景康