專利名稱：熒光定量pcr檢測(cè)豇豆i型和ii型耐旱性的方法以及診斷性基因和引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法以及診斷性基因和引物。
背景技術(shù)：
豆(Viffna unguiculata L. Walp)起源于非洲干旱地區(qū),是世界范圍內(nèi)重要的糧食豆類和亞洲國(guó)家重要蔬菜作物之一。據(jù)2006年統(tǒng)計(jì)年鑒，我國(guó)豇豆年產(chǎn)量達(dá)800萬(wàn)噸以上，而由于干旱造成的產(chǎn)量損失估計(jì)達(dá)20%左右。豇豆的耐旱性在不同基因型之間存在顯著差異。前人研究表明豇豆自然資源中存在著兩種不同類型的耐旱反應(yīng)，即I型和II型耐旱響應(yīng)(Watanabe et al. , 1997; Muchero et al. , 2008; Agbicodo et al. , 2009)。在I型耐旱響應(yīng)中，植物在水分脅迫下各組織迅速關(guān)閉氣孔、停止生長(zhǎng)并保持各組織水分含量大致相當(dāng)，并在復(fù)水后才恢復(fù)生長(zhǎng)；與此相反，II型耐旱品種的老葉快速干枯死亡，并且將其中水分運(yùn)送至新葉并保持新葉氣孔開張和繼續(xù)生長(zhǎng)，直到土壤水分繼續(xù)下降至相當(dāng)?shù)偷呐R界值(圖1)。由于這兩類耐旱機(jī)制的顯著不同，在豇豆耐旱育種中需要事先明確將要利用的育種親本材料的耐旱類型，然后有針對(duì)性的設(shè)計(jì)育種方案和制定育種計(jì)劃?；虮磉_(dá)的調(diào)節(jié)對(duì)生物性狀的形成和變化具有至關(guān)重要的作用。在干旱脅迫下，大批植物基因如轉(zhuǎn)錄因子、脫水素蛋白、水通道蛋白、ABA合成相關(guān)因子基因等都會(huì)發(fā)生表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)。模式植物中的大量研究表明，有些基因在干旱脅迫的表達(dá)調(diào)控模式在不同耐旱類型材料中特異地表現(xiàn)出差異，從而可以作為區(qū)分各種耐旱類型的診斷性基因。目前，豇豆中尚未報(bào)道或開發(fā)過(guò)可用于特異檢測(cè)I型和II型耐旱性的診斷性基因及其引物。

檢測(cè)基因表達(dá)的常用方法傳統(tǒng)的有Northern雜交法，較新的有實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、表達(dá)譜芯片法等。表達(dá)譜芯片是一種高通量檢測(cè)方法，一次可對(duì)上萬(wàn)條基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，適于從大量基因中篩選出與植物生長(zhǎng)發(fā)育、環(huán)境脅迫、抗病蟲害等相關(guān)的目標(biāo)基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR通常一次檢測(cè)一個(gè)基因，但簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)，一般實(shí)驗(yàn)室均可操作。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法，通過(guò)簡(jiǎn)單的熒光定量PCR即可區(qū)分豇豆品種的不同耐旱類型，分析過(guò)程在1-2日內(nèi)即可完成，大大提高了效率，有利于有針對(duì)性的利用不同耐旱類型的育種親本，促進(jìn)豇豆耐旱育種。本發(fā)明的第二個(gè)目的是一種特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因。本發(fā)明的第三個(gè)目的是一種特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因的熒光定量PCR引物。為了實(shí)現(xiàn)上述的第一個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法，該方法被檢測(cè)的診斷基因的序列如SEQ ID N0:1所示；所述的熒光定量PCR引物具有以下的序列
上游引物5’-TGGAITGTGGTGGACATAC-3’ ；
下游引物5’-GGITCCTTCTGAGCAITGA-3’。作為優(yōu)選，該方法包括以下的步驟
1)材料準(zhǔn)備挑選飽滿的I份I型耐旱豇豆品種和I份II型耐旱豇豆品種種子播于營(yíng)養(yǎng)缽，基質(zhì)為蛭石營(yíng)養(yǎng)土 =3 1 ;待子葉平展時(shí)澆透水后停止灌水，于處理后14天用常規(guī)Trizol法提取正常生長(zhǎng)和受脅迫條件下的葉部RNA ;或者拔出植株根部，迅速用水洗凈后用常規(guī)Trizol法提取正常生長(zhǎng)和受脅迫條件下的根部RNA ；
2)RAN提取和反轉(zhuǎn)錄取葉片或根組織組織0.1g加液氮研磨成粉末，參照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA ;將提取的RNA用DEPC處理過(guò)的水稀釋至0.1 g/L，在8 y L DEPC處理過(guò)的水中依次加入2 ii L錨定引物AP、RNA 2uL ;將`上述混合物置于70°C溫浴5 min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5 X第一鏈緩沖液4 u L、0. 25mmol/L dNTP 2. 5 u L、0.1 mol/L DTT 2. 5 u L,200 u/u L 的 SUPERSCRIPT II 反轉(zhuǎn)錄酶 0. 4 y L ;25°C 5 min, 42°C 15 min,70°C 10 min，4°C保持；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于_20°C保存；cDNA稀釋10倍備用；
所述的第一鏈緩沖液包括250 mmol/L Tris-HCl、pH8. 3、375 mmol/L KC1、15 mmol/LMgCl2 ；
3)熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用八連PCR管為單位進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR；PCR體系包括10ii L2XMix，5. L ddH20, 2 u L 50XR0X,0. 6u L 弓丨物和 2yL cDNA，為 20 y L 體系；PCR程序?yàn)棰倜讣せ?5°C 15min，擴(kuò)增循環(huán)②95°C 15s，③55°C 30s，④72°C 32s，②-④共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線分析為95°C 15s，60°C Imin ;每組PCR均做3次重復(fù)，取平均值進(jìn)行計(jì)算；內(nèi)參基因的序列如SEQ ID N0:4所示；數(shù)據(jù)分析采用2_""\法；結(jié)果表明利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)獲得了與芯片表達(dá)譜相一致的SEQ ID NO:1基因差異表達(dá)模式，從而能夠?qū)型和II型耐旱性材料明確區(qū)分出來(lái)。為了實(shí)現(xiàn)上述的第二個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因，該基因的序列如SEQ ID NO:1所示。為了實(shí)現(xiàn)上述的第三個(gè)目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
用于診斷上述的特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因的熒光定量PCR引物，其特征在于該引物具有以下的序列
上游引物5’-TGGAITGTGGTGGACATAC-3’ ；
下游引物5’-GGITCCTTCTGAGCATTGA-3’。本發(fā)明由于采用了上述的技術(shù)方案，通過(guò)簡(jiǎn)單的熒光定量PCR即可區(qū)分豇豆品種的不同耐旱類型，分析過(guò)程在1-2日內(nèi)即可完成，大大提高了效率，有利于有針對(duì)性的利用不同耐旱類型的育種親本，促進(jìn)豇豆耐旱育種。本發(fā)明的有益效果是1.本發(fā)明所鑒定的在豇豆I型和II型耐旱性材料中呈顯著差異表達(dá)的基因?yàn)樘禺悈^(qū)分豇豆品種不同類型的耐旱性提供了的診斷性基因工具。2.本發(fā)明獲得的針對(duì)I型和II型耐旱性診斷性基因的引物序列為利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR快捷、簡(jiǎn)便的檢測(cè)不同育種親本材料的耐旱類型提供了直接技術(shù)支持。


圖1為豇豆I型和II型耐旱性的特征。左圖為I型耐旱材料，植株所有三出復(fù)葉均微黃且萎蔫程度相當(dāng)；右圖為II型耐旱材料，植株表現(xiàn)為最下方的三出復(fù)葉完全枯死，上部葉片組織則持綠良好。圖2為利用基因芯片比較和鑒定I型和II型耐旱豇豆葉片在正常生長(zhǎng)和干旱脅迫下基因表達(dá)譜聚類圖。lxp，2xp，3xp 1型耐旱豇豆品種“花豆角”在正常生長(zhǎng)條件下的葉片；7xp,8xp,9xp 花·豆角”在干旱脅迫條件下的葉片；13xp, 14xp, 15xp II型耐旱St豆品種“飯豆”在正常生長(zhǎng)條件下的葉片；19Xp，20Xp，21Xp 飯豆”在干旱脅迫條件下的葉片。每個(gè)編號(hào)代表一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。圖3為熒光實(shí)時(shí)定量PCR在2個(gè)不同豇豆品種“花豆角”和“飯豆”中擴(kuò)增診斷性基因CETSl的結(jié)果及與基因芯片的比較。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因的篩選和引物的設(shè)計(jì)方法，該方法包括以下的步驟
(I)豇豆無(wú)冗余基因序列的下載和預(yù)處理從HarvEST豇豆DNA數(shù)據(jù)庫(kù)UP12 (http://www. harvest-web. org/hweb/bin/wc. dll hwebProcess hmain &versid=68)批量下載 Bi豆 unigene 序列，共 29, 728 條。運(yùn)行 VecScreen 程序(http://www. ncb1. nlm. nih. gov/VecScreen/VecScreen. html ),掃描并去除下載序列上包含的載體和接頭序列。(2)豇豆基因芯片設(shè)計(jì)對(duì)UP12數(shù)據(jù)庫(kù)中全部29，728條unigene序列進(jìn)行掃描后，針對(duì)每條序列在其不同堿基位置分別設(shè)計(jì)4條寡核苷酸DNA序列作為探針，這4條序列在芯片雜交中信號(hào)值的加權(quán)平均值將定義一個(gè)基因的信號(hào)值。設(shè)計(jì)時(shí)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)為轉(zhuǎn)錄組GC含量在35-60%之間，探針設(shè)計(jì)傾向于ORF開放閱讀框3’末端，探針長(zhǎng)度為60_mer。除去189條序列沒有設(shè)計(jì)出合適的探針，有62組成對(duì)序列和3組3對(duì)序列由于同源性太高，設(shè)計(jì)的探針相同，最終設(shè)計(jì)出探針總數(shù)為117，746條，代表了 29728-189-62x1-3x2=29，471條 unigene。(3)芯片雜交和差異表達(dá)譜分析將步驟(2)設(shè)計(jì)的所有探針序列交由Nimblegen公司點(diǎn)制成12 X 135k規(guī)格的表達(dá)譜芯片。將點(diǎn)制好的芯片交由北京博奧生物有限公司分別對(duì)正常灌溉和干旱處理?xiàng)l件下生長(zhǎng)的I個(gè)I型耐旱豇豆品種“花豆角”和I個(gè)II型耐旱豇豆品種〃飯豆〃的葉片cDNA進(jìn)行雜交分析。雜交方法按常規(guī)表達(dá)譜芯片的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行。雜交完畢后用Roche-NimbleGen MS200掃描儀掃描芯片。通過(guò)LuxScan 4.0圖像分析軟件分析把圖像信號(hào)轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號(hào)。根據(jù)cy5和cy3總體信號(hào)的全局平均值對(duì)各芯片進(jìn)行片間線性校正，使得各張芯片的全局平均值相同。采用RMA方法(Irizarry et al.，2003)進(jìn)行歸一化。用SAM軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)顯著性測(cè)驗(yàn)并結(jié)合文獻(xiàn)分析，挑選出11個(gè)在兩類耐旱性材料中的表達(dá)調(diào)控模式呈顯著差異的候選基因(表I)。表I芯片表達(dá)譜分析獲得的11個(gè)候選差異表達(dá)基因UP12數(shù)據(jù)庫(kù)基因代號(hào)I基因功能注釋
UP127902Non-specificlipid-transferprotein
權(quán)利要求
1.熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法，其特征在于該方法被檢測(cè)的診斷基因的序列如SEQ ID NO:1所示；熒光定量PCR引物具有以下的序列 上游引物5’-TGGATTGTGGTGGACATAC-3’ ； 下游引物5’-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法，其特征在于該方法包括以下的步驟 1)材料準(zhǔn)備挑選飽滿的I份I型耐旱豇豆品種和I份II型耐旱豇豆品種種子播于營(yíng)養(yǎng)缽，基質(zhì)為蛭石營(yíng)養(yǎng)土 =3 1 ;待子葉平展時(shí)澆透水后停止灌水，于處理后14天用常規(guī)Trizol法提取正常生長(zhǎng)和受脅迫條件下的葉部RNA ;或者拔出植株根部，迅速用水洗凈后用常規(guī)Trizol法提取正常生長(zhǎng)和受脅迫條件下的根部RNA ； 2)RAN提取和反轉(zhuǎn)錄取葉片或根組織組織O.1g加液氮研磨成粉末，參照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA ;將提取的RNA用DEPC處理過(guò)的水稀釋至O.1 g/L,在8 μ L DEPC處理過(guò)的水中依次加入2 μ L錨定引物AP、RNA 2 μ L ;將上述混合物置于70°C溫浴5 min后置于冰上；在RNA-AP混合物中依次加入5 X第一鏈緩沖液4 μ L、0. 25mmol/L dNTP 2. 5 μ L、0.1 mol/L DTT 2. 5 μ L,200 u/μ L 的 SUPERSCRIPT II 反轉(zhuǎn)錄酶 O. 4 μ L ;25°C 5 min, 42°C 15 min,70°C 10 min，4°C保持；反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于_20°C保存；cDNA稀釋10倍備用； 所述的第一鏈緩沖液包括250 mmol/L Tris-HCl、ρΗ8· 3、375 mmol/L KC1、15 mmol/LMgCl2 ； 3)熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)采用八連PCR管為單位進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR；PCR體系包括10μ L2XMix，5. 4μ L ddH20, 2 μ L 50XR0X,0. 6μ L 弓丨物和 2yL cDNA，為 20yL 體系；PCR程序?yàn)棰倜讣せ?5°C 15min，擴(kuò)增循環(huán)②95°C 15s，③55°C 30s，④72°C 32s，②-④共40個(gè)循環(huán)； 溶解曲線分析為95°C 15s，60°C Imin ； 每組PCR均做3次重復(fù)，取平均值進(jìn)行計(jì)算；內(nèi)參基因的序列如SEQ ID N0:4所示；數(shù)據(jù)分析采用2_“\法；結(jié)果表明利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)獲得了與芯片表達(dá)譜相一致的SEQ ID NO:1基因差異表達(dá)模式，從而能夠?qū)型和II型耐旱性材料明確區(qū)分出來(lái)。
3.特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因，其特征在于該基因的序列如SEQIDNO:1所示。
4.用于診斷權(quán)利要求3所述的特異區(qū)分豇豆I型和II型耐旱性的診斷性基因的熒光定量PCR引物，其特征在于該引物具有以下的序列 上游引物5’-TGGATTGTGGTGGACATAC-3’ ； 下游引物5’-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法以及診斷性基因和引物。熒光定量PCR檢測(cè)豇豆I型和II型耐旱性的方法，該方法被檢測(cè)的診斷基因的序列如SEQIDNO:1所示；所述的熒光定量PCR引物具有以下的序列上游引物5'-TGGATTGTGGTGGACATAC-3'；下游引物5'-GGTTCCTTCTGAGCATTGA-3'。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)所鑒定的在豇豆I型和II型耐旱性材料中呈顯著差異表達(dá)的基因?yàn)樘禺悈^(qū)分豇豆品種不同類型的耐旱性提供了的診斷性基因工具，另外針對(duì)I型和II型耐旱性診斷性基因的引物序列為利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR快捷、簡(jiǎn)便的檢測(cè)不同育種親本材料的耐旱類型提供了直接技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103045738SQ201210559678
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者徐沛, 李國(guó)景, 吳曉花, 汪寶根, 魯忠富, 羅潔, 王莎, 劉永華 申請(qǐng)人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院