專利名稱：一種檢測 TUBB3 mRNA 基因表達量的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測TUBB3 mRNA基因表達量的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
抗微管類藥物是一類以細胞微管蛋白為作用靶點的藥物。通過作用于細胞微管而影響紡錘體形成，并抑制細胞有絲分裂的一類廣譜化療藥。目前常用的抗微管類藥物主要有:紫杉醇、多西他賽、長春堿、長春新堿和長春瑞濱等。紫杉醇/多西他賽作用于腫瘤細胞后，可以促進腫瘤細胞內(nèi)的微管聚合以及穩(wěn)定已聚合的微管，導致細胞內(nèi)大量微管聚集，進而干擾細胞各種功能，特別是使細胞停止分裂。長春堿/長春新堿等可以抑制腫瘤細胞內(nèi)微管蛋白的聚合、抑制紡錘體微管的形成，使核分裂停滯于細胞分裂中期，從而抑制腫瘤細胞生長。微管蛋白α和微管蛋白β構(gòu)成的α，β異二聚體是微管裝配的基本單位，也是許多抗微管類藥物的作用靶點。其中TUBB3編碼的β-tubulin-1II(III型微管蛋白)與抗微管類藥物的療效關(guān)系最為密切。多種腫瘤細胞系的研究及大量臨床試驗結(jié)果均顯示TUBB3 mRNA的表達水平與抗微管類藥物的療效密切相關(guān)(Pascal S and Charles D.Lancet Oncol.2008;9:168-75.)。低表達患者接受紫杉醇類或長春堿類化療的效果較好，中位生存期較長。而TUBB3高表達的患者的抗微管類化療療效較差(Pascal S and Charles D.LancetOncol.2008;9:168-75.) 。熒光定量PCR技術(shù)的出現(xiàn)，為本發(fā)明提供了一種操作簡單快速、易標準化、檢測費用低，準確可靠、定量檢測mRNA的方法。通過該方法可以快速檢測腫瘤細胞(來源于腫瘤組織、循環(huán)腫瘤細胞、穿刺標本、胸腹水等)中TUBB3 mRNA的表達量，用于臨床醫(yī)生對抗微管類的合理化使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種檢測TUBB3基因mRNA表達量的熒光定量PCR檢測試劑盒，能簡單快速、準確可靠的檢測TUBB3基因。為了達到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:
一種檢測TUBB3基因表達量的熒光定量PCR試劑盒，包含以下組成部分:
(OTUBB3基因標準品:含有TUBB3基因編碼序列的重組載體，所述TUBB3基因編碼序列如SEQ ID N0.1所示；
(2)檢測TUBB3基因的上、下游引物:
TUBB3-上游引物:5’ - GGCCTCTTCTCACAAGTACG -3，(SEQ ID N0.2)
TUBB3-下游引物:5’ - GAAGAGATGTCCAAAGGCCC -3’ (SEQ ID N0.3)
進一步，所述含有TUBB3基因編碼序列的重組載體的空載體為pUC57載體；進一步，該試劑盒還包含逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT) ,dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。所述逆轉(zhuǎn)錄緩沖液為常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，如5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液(有濃度為50mmol/L、pH 為 8.0 的 Tris-HCl、濃度為 SOmmoI /I,的 KCl、濃度為 4 mmol /I,的 MgC12 和濃度為10mmol/L的二硫蘇糖醇DTT組成)等；所述逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)為寡聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸；所述dNTPs溶液為dATP (脫氧腺苷三磷酸)的混合水溶液；所述定量PCR緩沖液為常規(guī)定量PCR緩沖液，如5 X定量PCR緩沖液(由濃度為lOmmol/L，pH為8.0的Tris-HCl、濃度為50mmol/L的KCl和濃度為2 mmol/L的MgC12組成)等。本發(fā)明還提供了基于上述試劑盒檢測TUBB3 mRNA基因表達量的方法，包括以下步驟:
(1)從待測標本(腫瘤組織、循環(huán)腫瘤細胞、穿刺標本、胸腹水等)中提取細胞總RNA，測定RNA濃度，加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo- (dT) ,dNTPs溶液和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
(2)分別將已知拷貝數(shù)的TUBB3基因標準品倍比稀釋至108、107、106、105、104、103、102、10個拷貝數(shù)/ μ I ；
(3)分別以步驟(I)所制備的cDNA及步驟(2)倍比稀釋的TUBB3基因標準品為模板，加入檢測TUBB3基因的上、下游引物，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進行熒光定量PCR ；
(4)由于模板的循環(huán)閾值與該模板的初始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，因此，根據(jù)倍比稀釋的TUBB3基因標準品的循環(huán)閾值與初始拷貝數(shù)分別繪制TUBB3基因標準曲線，再根據(jù)待測cDNA的循環(huán)閾值對其含有的TUBB3基因的初始拷貝數(shù)進行定量分析，從標準曲線上讀取其含有的TUBB3基因的初始拷貝數(shù)。進一步，所述步驟(3)的PCR擴增條件為:95°C預變性3分鐘，然后95°C變性30秒、55°C退火40秒，共40個循環(huán)。本發(fā)明的定量PCR檢測試劑盒由于選擇了合適的引物，制備了合適的TUBB3基因標準品，，能夠靈敏、特異、準確地同時檢測TUBB3基因，適用于臨床上對抗微管類療效反應的評價，利于臨床醫(yī)生對治療方案做出合理的選擇。


圖1為本發(fā)明TUBB3基因的標準曲線；
圖2為本發(fā)明基因的溶解曲線；
圖3為本發(fā)明基因的擴增曲線。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。一、TUBB3基因的熒光定量PCR檢測試劑盒的配置
本實施例的TUBB3基因的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括以下組成部分:
I) TUBB3基因標準品 :含有TUBB3基因編碼序列(GeneBank編號為NM_001197181.1的第339位至第436位堿基)的重組pUC57載體；
2)檢測TUBB3基因的上、下游引物:
TUBB3-上游引物:5’ - GGCCTCTTCTCACAAGTACG -3，(SEQ ID N0.2)
TUBB3-下游引物:5’ - GAAGAGATGTCCAAAGGCCC -3’ (SEQ ID N0.3)；
3)5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，濃度為lOpmol/μ I的逆轉(zhuǎn)錄引物Olig0-(dT) 16，濃度為20pmol/ μ I的dNTPs溶液，濃度為IOU/ μ I的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，5 X定量PCR緩沖液，濃度為2U/ μ I的TaqDNA聚合酶。其中，TUBB3基因標準品由以下方法制得:
a)直接合成獲得含有TUBB3基因編碼序列的片段DNA；
b)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定、切膠回收純化后，克隆至pGET載體進行連接；
c)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞，篩選陽性克?。?br> d)提取重組質(zhì)粒，即得分別含有TUBB3基因編碼序列的重組PUC57載體。此外，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶均為RT-PCR的常規(guī)試劑，故本發(fā)明的檢測試劑盒也可以不包括上述常規(guī)試劑。二、TUBB3基因的熒光定量PCR檢測試劑盒的檢測
本實施例的TUBB3基因的熒光定 量PCR檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟:
(1)從待測外周血、腫瘤組織、穿刺標本或其它標本中提取總RNA，測RNA的濃度；
(2)將所得RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，轉(zhuǎn)錄體系如表I所示:
表I
權(quán)利要求
1.一種檢測TUBB3 mRNA基因表達量的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括以下組成部分: (OTUBB3基因標準品:含有TUBB3基因編碼序列的重組載體，所述TUBB3基因編碼序列如SEQ ID N0.1所示； (2)檢測TUBB3基因的上、下游引物: TUBB3-上游引物:5’ - GGCCTCTTCTCACAAGTACG -3’ ； TUBB3-下游引物:5’ - GAAGAGATGTCCAAAGGCCC -3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述重組載體的空載體為PUC57載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、定量PCR緩沖液和TaqDNA聚合酶。
4.一種基于權(quán)利要求1至3任一項所述試劑盒檢測TUBB3 mRNA基因表達量的方法，包括如下步驟: (O從待測標本中提取總RNA，測定RNA濃度，加入逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、逆轉(zhuǎn)錄引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ； (2)分別將已知拷貝數(shù)的TUBB3基因標準品倍比稀釋至108、107、106、105、104、103、102、10個拷貝數(shù)/ μ I ； (3)分別以步驟(I)所制備的cDNA及步驟(2)倍比稀釋的TUBB3基因標準品為模板，加入檢測TUBB3基因的上 、下游引物，定量PCR緩沖液，dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶，進行熒光定量PCR ； (4)根據(jù)倍比稀釋的TUBB3基因標準品的循環(huán)閾值與初始拷貝數(shù)分別繪制TUBB3基因標準曲線，再根據(jù)待測cDNA的循環(huán)閾值，從標準曲線上讀取其含有的TUBB3基因的初始拷貝數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)的PCR擴增條件為:95°C預變性3分鐘，然后95°C變性30秒、55°C退火40秒，共40個循環(huán)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測TUBB3mRNA基因表達量的試劑盒及方法。該試劑盒包括用于制作標準曲線的標準品、內(nèi)參基因?qū)崟r定量PCR體系。通過該方法能準確、快速、定量地確定TUBB3基因表達量。本發(fā)明所述方法和試劑盒應用在臨床中，有利于醫(yī)生合理化選擇抗微管類進行治療。
文檔編號C12Q1/68GK103088124SQ20121052138
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月7日
發(fā)明者張偉, 郭成賢, 陳小平, 劉昭前, 周宏灝 申請人:周宏灝