專利名稱：一株生產(chǎn)檸檬酸的菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，涉及一株高溫發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的菌株以及利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法。
背景技術(shù)：
黑曲霉屬半知菌亞門、絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬真菌中ー個常見種，廣泛分布于世界各地，是傳統(tǒng)的制醬、釀酒、制醋的主要菌種，也是現(xiàn)代發(fā)酵エ業(yè)中重要的發(fā)酵エ業(yè)菌種，可生產(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、果膠酶等產(chǎn)品。天然檸檬酸在自然界中分布很廣。在植物如檸檬、柑橘、菠蘿等果實和動物的骨骼、肌肉、血液中都含有檸檬酸。1784年C.W.舍勒首先從柑橘中提取檸檬酸，通過在水果榨汁中加入石灰乳以形成檸檬酸鈣沉淀的方法制取檸檬酸的。檸檬酸的生產(chǎn)方法有水果提取法、化學合成法和生物發(fā)酵法等。水果提取法是指從檸檬、桔子、蘋果等檸檬酸含量較高的水果中提取，成本較高，不利于エ業(yè)化生產(chǎn)，而化學合成法主要利用丙酮、ニ氯丙酮或こ烯酮，エ藝復雜、成本高，安全性低。發(fā)酵法制取檸檬酸始于19世紀末。1893年C.韋默爾發(fā)現(xiàn)青霉(屬)菌能積累檸檬酸。1913年B.扎霍斯基報道黑曲霉能生成檸檬酸。1923年美國菲澤公司建造了世界上第一家以黑曲霉淺盤發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸的エ廠。隨后比利時、英國、德國、蘇聯(lián)等相繼研究成功發(fā)酵法生產(chǎn)檸檬酸。1952年美國邁爾斯試驗室采用深層發(fā)酵法大規(guī)模生產(chǎn)檸檬酸。此后，深層發(fā)酵法逐漸建立起來。深層發(fā)酵周期短，產(chǎn)率高，節(jié)省勞動力，占地面積小，便于實現(xiàn)儀表控制和連續(xù)化，現(xiàn)已成為檸檬酸生產(chǎn)的主要方法?，F(xiàn)在檸檬酸エ業(yè)中普遍采用的發(fā)酵溫度為37°C，由于在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的發(fā)酵熱，使得夏季尤其是南方地區(qū)，發(fā)酵溫度控制較為困難，降溫水用量大，能耗高。迫切需要ー種能夠有效降低降溫水用量的生產(chǎn)檸檬酸的方法，以節(jié)約能耗。`

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種能夠高溫環(huán)境下發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的菌株。本發(fā)明的另ー目的在于提供利用該菌株高溫發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法。本發(fā)明提供了一株能夠發(fā)酵生產(chǎn)朽1檬酸的黑曲霉(Aspergillusniger)菌株FYCA8561，其保藏編號為 CGMCC No. 6466。該菌株已于2012年8月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi1:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為黑曲霉，拉丁文名Aspergillus niger，保藏號為CGMCC No. 6466。本發(fā)明提供了含有黑曲霉菌株FYCA8561的菌劑。本發(fā)明還提供了黑曲霉菌株FYCA8561在利用淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸中的應用。本發(fā)明提供ー種高溫發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法，含有以下步驟(I)將菌株FYCA8561經(jīng)平板或斜面擴大培養(yǎng)；
(2)FYCA8561孢子接入麩曲種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到麩曲孢子；(3)將麩曲孢子接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)種子；(4)將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行高溫發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)出檸檬酸發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)過分離提取后得到無水檸檬酸或一水檸檬酸結(jié)晶。其中，步驟(I)所述的平板或斜面為麥芽汁瓊脂平板或麥芽汁斜面培養(yǎng)基。其中，步驟(2)所述的麩曲種子培養(yǎng)基為將麩皮按35% 45%的質(zhì)量百分比用自來水配制，培養(yǎng)條件為36 40°C。進ー步地，步驟(2)的培養(yǎng)條件為36 38°C。更進ー步地，步驟(2)的培養(yǎng)條件為37°C。其中，步驟(3)所述的種子培養(yǎng)基為玉米粉按10% 15%的質(zhì)量百分比用自來水配制，IL種子培養(yǎng)基中加a-淀粉酶0.1 0. 5mL進行液化后，使含糖量達到8% 12%，進入種子罐中滅菌。優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基中含糖為10%。其中，步驟⑶培養(yǎng)條件為36 40°C，通風培養(yǎng)20 30h。進ー步地，步驟⑶培養(yǎng)條件為36 38°C，通風培養(yǎng)22 26h。更進ー步地，步驟(3)培養(yǎng)條件為37°C，通風培養(yǎng)24h。其中，步驟⑷所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉按15% 20%的質(zhì)量百分比用自來水配制；IL發(fā)酵培養(yǎng)基中加a-淀粉酶0.1 0. 5mL進行液化后，使含糖量達到13% 17%，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百 分比0. 05% 0. 2%硫酸銨的無機氮源，進入發(fā)酵罐滅菌后進行發(fā)酵，發(fā)酵條件為36 40°C，通風比為1: 0. 3 0. 5，攪拌轉(zhuǎn)速為200 450r/min，培養(yǎng)時間60 90h。優(yōu)選地，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中含糖15%。進ー步地，步驟⑷的發(fā)酵條件為38 41 °C，通風比為1: 0. 3 0. 5，攪拌轉(zhuǎn)速為250 350r/min，培養(yǎng)時間65 80h。更進一歩地，步驟(4)的發(fā)酵條件為40°C，通風比為1: 0. 3，攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min，培養(yǎng)時間72h。其中，步驟(4)的發(fā)酵液可以經(jīng)過提取后得到無水檸檬酸或一水檸檬酸結(jié)晶。本發(fā)明提供了ー種高溫發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的菌株，其為黑曲霉FYCA8561，此菌株已保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CGMCC No. 6466。并提供了采用該株黑曲霉為生產(chǎn)菌株高溫液體發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法。使用本發(fā)明中保藏的菌株及公開的發(fā)酵培養(yǎng)方法發(fā)酵生產(chǎn)朽1檬酸時，菌株性能穩(wěn)定。300m3發(fā)酵罐64小時發(fā)酵產(chǎn)酸達到14. 7%,轉(zhuǎn)化率95%，糧耗為1. 75T/T，與現(xiàn)有技術(shù)的發(fā)酵產(chǎn)酸率、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)周期相比，在上述各方面均取得了預料不到的技術(shù)效果，可望大規(guī)模用于生產(chǎn)，進一歩降低生產(chǎn)成本和周期、提高產(chǎn)率，并大幅度降低了降溫用水量，節(jié)約能源，尤其在夏季高溫季節(jié)優(yōu)勢特別突出，因而有重要的市場前景。


圖1為黑曲霉FYCA8561菌株發(fā)酵溫度為40°C時醪液HPLC色譜圖。圖2為黑曲霉菌株FYCA2358發(fā)酵溫度為40°C時醪液HPLC色譜圖。
圖3為發(fā)酵罐發(fā)酵溫度為37°C、40°C時降溫水用量比較。
具體實施例方式以下實施例進ー步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，本發(fā)明實施例包括說明書中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明中涉及到的百分號“ ％”，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比。實施例1菌株誘變和分離1、菌株馴化以黑曲霉FYCA2358(來自豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司)為出發(fā)菌，經(jīng)進行60Cov射線及亞硝基胍復合誘變獲得一株檸檬酸高溫液體發(fā)酵菌株。其誘變過程如下I)菌懸液的制備將出發(fā)菌株的孢子轉(zhuǎn)接與麥芽汁斜面上于37°C培養(yǎng)7 8d，長好孢子后，用生理鹽水將孢子洗下，轉(zhuǎn)入小三角瓶中，用玻璃珠震蕩打散，然后通過脫脂棉過濾，濾液即為單孢子懸浮液。2) 6tlCo Y射線誘變處理將黑曲霉的菌懸液IOml置于50ml比色管中，將該比色管置于6°Co Y射線下照射，劑量為1200Gy，照射后的孢子懸浮液梯度稀釋，取0. 05ml涂平板。3)亞硝基胍誘變處理將亞硝基胍配制成0. lmg/ml的丙酮溶液，將孢子懸浮液0. 9ml于37°C恒溫水浴中預熱5min,加入0.1ml濃度的2mg/ml的亞硝基胍溶液,在水浴中保溫處理30min,取出后以3000r/min離心分離,棄去上清液,用預先冷卻的無菌生理鹽水進行洗漆離心15次,用生理鹽水定容至Iml后，進行平板分離。4)挑出目的菌落。成熟時菌落中央稍微隆起，出現(xiàn)絨毛狀覆蓋物；分生孢子梗短分生孢子頭大，圓形黒色，老熟時開花狀；次生小梗少，大部分不分枝，同時，對該菌株進行了生理生化鑒定，確定為黑曲霉。最終得到一株產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉突變株FYCA8561，它能利用淀粉質(zhì)原料在40°C發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸。該菌株已于2012年8月21日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJi1:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)保藏，分類命名為黑曲霉，拉丁文名Aspergillusniger，保藏號為CGMCCNo. 6466 o另保藏菌株FYCA8561于斜面試管中備用。實施例2麩曲瓶、種子罐、發(fā)酵罐不同的培養(yǎng)溫度對黑曲霉FYCA8561產(chǎn)酸影響利用黑曲霉FYCA8561進行發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的步驟如下1.平板或斜面培養(yǎng)將檸檬酸產(chǎn)酸菌黑曲霉FYCA8561接種到麥芽汁瓊脂平板上 培養(yǎng)；2.麩曲培養(yǎng)將培養(yǎng)后的檸檬酸菌種黑曲霉FYCA8561斜面上鉤ー環(huán)孢子接入麩曲種子培養(yǎng)基中(配方為將麩皮按35%質(zhì)量百分比用自來水配制，并滅菌)；在麩曲瓶中進行培養(yǎng)。3.種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)基的配制玉米粉按10%的質(zhì)量百分比用自來水配制。IL種子培養(yǎng)基中加a-淀粉酶0.2mL進行液化后，使含糖量達10%，置于種子罐中滅菌后。再于滅菌后的種子培養(yǎng)基中接入麩曲孢子，在種子罐中進行種子培養(yǎng)；4. 50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)最后將培養(yǎng)好的種子罐液體種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中。本實施例的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉按15%的質(zhì)量百分比用自來水配制；1L發(fā)酵培養(yǎng)基中加a-淀粉酶0.3mL進行液化后，使含糖量達到15 %，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比0. 1%硫酸銨的無機氮源，進入發(fā)酵罐滅菌后進行發(fā)酵，發(fā)酵通風比為1: 0.3，攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min。將檸檬酸菌種黑曲霉FYCA8561進行上述操作后，不同的培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酸影響見表I。表I不同的培養(yǎng)溫度對黑曲霉FYCA8561產(chǎn)酸的影響
權(quán)利要求
1.一株黑曲霉(Aspergillus niger)菌株 FYCA8561，其保藏編號為 CGMCC No. 6466。
2.含有權(quán)利要求1所述菌株FYCA8561的菌劑。
3.權(quán)利要求1所述的菌株FYCA8561在利用淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸中的應用。
4.ー種高溫發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法，其特征在于，含有以下步驟 (1)將權(quán)利要求1的菌株FYCA856經(jīng)平板或斜面擴大培養(yǎng)； (2)FYCA856孢子接入麩曲種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)得到麩曲孢子； (3)將麩曲孢子接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)種子； (4)將培養(yǎng)好的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進行高溫發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵生產(chǎn)出檸檬酸發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)過分離提取后得到無水檸檬酸或一水檸檬酸結(jié)晶。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(I)所述的平板或斜面為麥芽汁瓊脂平板或麥芽汁斜面培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(2)所述的麩曲種子培養(yǎng)基為麩皮按35% 45%的質(zhì)量百分比用自來水配制，培養(yǎng)條件為36 40°C。
7.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的種子培養(yǎng)基為玉米粉按10% 15%的質(zhì)量百分比用自來水配制，IL種子培養(yǎng)基中加a-淀粉酶0.1 0. 5mL進行液化后，使含糖量達到進入種子罐中滅菌。
8.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(3)培養(yǎng)條件為36 40°C，通風培養(yǎng)20 30h。
9.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(4)所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉按15% -20%的質(zhì)量百分比用自來水配制，IL發(fā)酵培養(yǎng)基中加a-淀粉酶0.1 0. 5mL進行液化后，使含糖量達到13% 17%，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量百分比0. 05% 0.2%硫酸銨的無機氮源，進入發(fā)酵罐滅菌后進行發(fā)酵，發(fā)酵條件為36 40°C，通風比為1: 0.3 0.5，攪拌轉(zhuǎn)速為200 450r/min,培養(yǎng)時間60 90h。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，步驟(4)中發(fā)酵溫度為40°C，通風比為I 0. 3，攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min，培養(yǎng)時間72h。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種高溫液體發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的黑曲霉菌株FYCA8561，其保藏編號為CGMCC.NO.No.6466，本發(fā)明還提供了利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸的方法，利用該方法生產(chǎn)的檸檬酸在發(fā)酵高峰期降溫水需求量低、節(jié)約能源，尤其在夏季高溫季節(jié)優(yōu)勢特別突出，能夠顯著降低降溫水的使用量。
文檔編號C12N1/14GK103045487SQ201210510660
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者李榮杰, 穆曉玲, 李維理, 常珠俠 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司