專利名稱：抗gm-csf抗體和其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
背景技術(shù)：
粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)最初稱為造血生長因子。其由許多細胞類型產(chǎn)生，包括淋巴細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞及一些惡性細胞(Metcalf等人，1986 ；Clark 及 Kamen, 1987 ；Hart 等人，1988 ；Metcalf 等人，1986)。除對造血前驅(qū)細胞具有生長刺激及分化功 能外，也發(fā)現(xiàn)GM-CSF對表達GM-CSF受體的免疫系統(tǒng)細胞具有多種作用(參見:Hamilton, 2002 ;de Groot等人，1998)。所述功能中最重要的是在數(shù)種免疫及發(fā)炎過程中對單核細胞、巨曬細胞及粒細胞的激活(Gasson等人，1990b ;Gasson等人，1990a ；Hart 等人，1988 ；Rapoport 等人，1992)。成熟的GM-CSF為含有127個氨基酸具有兩個糖基化位點的單體蛋白質(zhì)。糖基化程度可變導致分子量介于14kDa與35kDa之間。非糖基化及糖基化的GM-CSF顯示相似的活體外活性(Cebon等人，1990)。GM-CSF的晶體學分析顯示由四個短a螺旋組成的桶狀結(jié)構(gòu)(Diederichs等人，1991)?？傮w折疊與諸如生長激素、白細胞介素_2及白細胞介素_4等其他生長因子相似。GM-CSF通過結(jié)合至其受體發(fā)揮其生物活性(Kastelein及Sha-nafelt, 1993 ；Sisson及Dinarello，1988)。GM-CSF受體(GM-CSF-R)表達的最重要位點是在骨髓細胞及內(nèi)皮細胞的細胞表面，而淋巴細胞是GM-CSF-R陰性的。天然受體由至少兩個亞單位(a及￠)組成。a亞單位賦予配體特異性并以毫微摩爾親和力結(jié)合GM-CSF (Gearing等人，1989 ;Gasson等人，1986)。P亞單位也為白細胞介素_3及白細胞介素-5受體錯合物的一部分并與GM-CSF受體a亞單位及GM-CSF聯(lián)合導致形成具有微微摩爾結(jié)合親和力的錯合物(Hayashida等人，1990)。已對受體在GM-CSF上的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)嵤┒ㄎ?GM_CSF與其受體的P亞單位經(jīng)由在GM-CSF第一 a螺旋中非常有限的區(qū)域相互作用(Shanafelt等人，1991b ;Shanafelt等人，1991a ;Lopez等人，1991)?？蓪⑴ca亞單位的結(jié)合定位至第三a螺旋、螺旋C、與螺旋C及D連接的環(huán)的起始殘基及GM-CSF的羧端尾部(Brown等人，1994)。GM-CSF三聚體受體錯合物的形成導致包括JAK/STAT家族、She、Ras、Raf、MAP激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶及NFkB等分子的錯合物信號級聯(lián)激活，最后導致c-myc、c-fos及c-jun轉(zhuǎn)錄。激活主要由受體的P亞單位引起(Hayashida等人，1990 ;Kitamura等人，1991 ;Sato等人，1993)。共享的P亞單位也是IL_3、IL-5及GM-CSF發(fā)揮的疊加功能的原因(參見de Groot等人，1998)。除其造血生長和分化刺激活性外，GM-CSF尤其起促炎性細胞因子的作用。巨噬細胞和單核細胞以及中性白細胞和嗜曙紅細胞由GM-CSF激活，導致釋放其他細胞因子及趨化因子、基質(zhì)降解蛋白酶，HLA表達增加及CC-趨化因子受體或細胞粘附分子的表達增力口。同樣，后者又導致炎癥細胞成發(fā)炎組織的趨化性增加(Chantry等人，1990 !Hamilton,2002 ；Sisson 及 Dinarello, 1988 ； Zhang 等人，1998 ； Hami I ton 等人，1993 ； Lopez 等人，1986 ；Cheng 等人，2001 ；Gomez-Cambronero 等人，2003)。通常，GM-CSF 協(xié)同其他炎癥性刺激因子(例如其他細胞因子或LPS)發(fā)揮其活性，例如用GM-CSF與(例如)LPS聯(lián)合處理的中性白細胞會顯示增加的氧化爆發(fā)(Kaufman等人,1989 ；Rapoport等人,1992)。GM-CSF作為抗炎療法的靶點:由于其在免疫系統(tǒng)中的多種激活功能，GM-CSF可視為抗炎療法的靶點。諸如類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、多發(fā)性硬化癥(MS)、克羅恩(Crohn' s)病、牛皮癬、哮喘病、特應(yīng)性皮炎或休克等慢性及急性炎癥性疾病可充分受益于GM-CSF活性的阻斷及隨后GM-CSF反應(yīng)細胞有害活性的降低(Hamilton, 1993 ；Zhang 等人，1998 ；Hamilton, 2002)。關(guān)節(jié)炎:數(shù)個組已證實GM-CSF以及其受體存在于關(guān)節(jié)炎患者的滑膜關(guān)節(jié)中(Alvaro-Gracia 等人，1991 ；Xu 等人，1989 ；Haworth 等人，1991)。此外，證實 GM-CSF 在用GM-CSF治療費耳提氏(Felty' s)綜合癥中的嗜中性白細胞減少癥的患者中(Hazenberg等人，1989)或于化學療法后(de Vries等人，1991)引起突發(fā)類風濕性關(guān)節(jié)炎。阻斷GM-CSF的抗體治療關(guān)節(jié)炎有效性的最初線索來自小鼠活體內(nèi)研究(Campbell 等人，1997 ； Campbe 11 等人，1998 ；Cook 等人,2001)。具體來說，Cook 等人證實GM-CSF中和抗體在膠原誘導性關(guān)節(jié)炎模型中顯示功效。GM-CSF阻斷可使疾病嚴重程度減輕，所述疾病嚴重程度涉及炎癥、軟骨破壞及在最初受侵襲的肢中的疾病擴散或至其他肢的擴散?？笹M-CSF療法具有數(shù)種患有類風濕性關(guān)節(jié)炎或患有其他炎癥性疾病的患者可受益的效果。期望GM-CSF阻斷可抑制或降低:a)成熟單核細胞、巨噬細胞及中性白細胞的激活及數(shù)量。具體來說，中性白細胞及巨噬細胞大量存在于滑液及膜中。已證實在滑膜中巨噬細胞的數(shù)量與RA關(guān)節(jié)的糜爛程度有關(guān)(Mulherin等人，1996 ；Burmester等人，1997)。巨噬細胞是多種其他促炎性細胞因子及基質(zhì)降解蛋白酶的來源。由中性白細胞產(chǎn)生H2O2是發(fā)生在關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)處破壞性過程的一部分(Babior,2000)。b)骨髓樹突細胞(DC)的分化及滑液DC(等于滑膜細胞)的激活。GM-CSF上調(diào)并維持HLA II類在DC及RA滑膜細胞上的表達(Alvaro-Gracia JM等人，1991)。在關(guān)節(jié)內(nèi)指示DC獲得與炎癥性T細胞選擇性激活相關(guān)的功能。已將特異性HLA-DR等位基因與RA易感染性相關(guān)聯(lián)并且經(jīng)由DC抗原提呈的T細胞激活可在所述類型免疫疾病中起至關(guān)重要的作用(Santiago-Schwarz 等人，2001)。多發(fā)性硬化癥:在多發(fā)性硬化癥中，GM-CSF水平的提高與MS的癥狀活躍期有關(guān)(Carried等人，1998 ;McQualter等人，2001)并且GM-CSF-/-小鼠未能在MS、實驗性腦脊髓炎、EAE的模型系統(tǒng)中感染疾病(McQualter等人，2001)。哮喘病: 已報道在哮喘病中肺中GM-CSF的量增加 !■01(^及？化68七6111，1991)。同時，嗜曙紅細胞增加，GM-CSF與白細胞介素-5以三種方式協(xié)同作用而導致嗜曙紅細胞增加:i)刺激祖細胞分化至嗜曙紅細胞；ii)刺激它們的功能激活；及iii)延長嗜曙紅細胞在肺中的存活(Broide等人，1992 ;Yamashita等人，2002)。因此，通過阻斷GM-CSF減少哮喘氣道中嗜曙紅細胞的存活可能改善疾病?？笹M-CSF中和抗體的有效性在鼠科動物哮喘病模型中進一步得到證實，其中投與所述抗體可達成氣道高反應(yīng)性及氣道炎癥的顯著減輕(Yamashita等人，2002)。在不同小鼠模型中，肺的LPS依賴性炎癥可通過在小鼠中施用抗GM-CSF抗體22E9減輕(Bozinovski 等人,2003)。毒性作用:破壞性粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)基因純合的小鼠至多12周齡發(fā)育正常并且沒有顯示明顯的造血干擾。雖然大多數(shù)GM-CSF缺失的小鼠表面上健康且可繁殖，但全部發(fā)育具有混亂及減少的膠原纖維束的紊亂的血管細胞外基質(zhì)及具有削弱的肺部表面活性物質(zhì)清除率及對肺中微生物病原體抗性降低的異常肺。后者的病理學特征與人類疾病肺泡蛋白沉積癥(PAP)類似。GM-CSF對于維持主要類型的成熟造血細胞及其前驅(qū)體在血液、骨髓及脾中的正常水平似乎不是非常關(guān)鍵的。然而，它們暗示GM-CSF對正常血管的形成、肺部生理機能及對局部感染的抗性是非常關(guān)鍵的(Stanley等人，1994 ；Dranoff等人，1994 ;Plenz等人，2003 ;Shibata等人，2001)。最近，GM-CSF自身抗體與PAP的強相關(guān)性另外表明人類PAP發(fā)病機制中的GM-CSF信號轉(zhuǎn)導異常。共同地，所述觀察表明GM-CSF在調(diào)節(jié)肺中表面活性物質(zhì)自身穩(wěn)態(tài)及肺泡巨噬細胞先天性免疫功能中具有重要作用(Bonfield等人，2002 ；Trapnell 及 Whitsett, 2002 ；Uchida 等人，2004 ；Kitamura 等人，1999)。已在患有重癥肌無力的患者中描述對GM-CSF具有阻斷活性的高滴定度自身抗體。這些患者沒有顯示任何其他自身免疫現(xiàn)象或造血缺失或“其他明顯的臨床相關(guān)性” (Meager 等人，1999)?；衔顴21R ( 一種對抗GM-CSF功能的GM-CSF的修飾形式)已在階段I安全試驗中予以評價并發(fā)現(xiàn)其在癌癥患者中具有良好的安全性質(zhì)(Olver等人，2002)。因此，除應(yīng)密切檢測的肺功能外，當使用抗GM-CSF療法時，預計沒有其他副作用。迄今為止，僅已產(chǎn)生源自非人類物種的具有GM-CSF中和功能的抗體。例如，歐洲專利第0499161號Al闡述通過用寡肽(其序列源自GM-CSF)對小鼠實施免疫作用產(chǎn)生的抗體。此外，所述申請案揭示一種使需要其的哺乳動物中GM-CSF不期望作用減輕的方法，所述方法包括向所述哺乳動物投與GM-CSF-抑制量的免疫球蛋白。然而，所述抗體是鼠科動物抗體，使其不適于人類投與。此外，WO 03/068920 揭示一種抑制性嵌合小鼠/人類IgGl抗體。含有非人類序列的抗體可能在人類患者中引起免疫反應(yīng)并且不適合治療投與。例如，在需要長期治療的疾病(例如慢性炎癥性疾病，如類風濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘病及多發(fā)性硬化癥)中，連續(xù)投與非人類治療劑會使嚴重炎癥性反應(yīng)及產(chǎn)生可中和治療劑的人類抗體的可能性增加。相應(yīng)地，鑒于抗GM-CSF抗體療法的巨大潛力，當前急需具有高親和力的可有效阻斷GM-CSF/GM-CSF受體相互作用的人類抗GM-CSF抗體。此外，具有一種或多種可與一種或多種非人類物種的GM-CSF交叉反應(yīng)的抗體以在基于動物的活體內(nèi)模型中測試其功效會是有利的。
本發(fā)明通過提供下文所述的充分高度有效的抗GM-CSF抗體滿足所述及其他需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供可有效阻斷GM-CSF/GM-CSF受體相互作用的人類及人源化抗體。本發(fā)明的另一個目的是提供對人類投與安全的抗體。本發(fā)明的又一個目的是提供通過使用一種或多種本發(fā)明抗體治療與GM-CSF存在有關(guān)的疾病和/或病癥的方法。所述及其他本發(fā)明目的在本文更全面地予以闡述。

一方面，本發(fā)明提供對人類GM-CSF具有特異性的抗原結(jié)合區(qū)，其中經(jīng)分離的人類或人源化抗體或其功能片段能夠(i)在以下條件下將0.5 u g/ml人類GM-CSF與在約2xl05個CHO-Kl細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的相互作用阻斷至少50%: (a)在CHO-Kl細胞上表達的所述人類GM-CSF受體a鏈的濃度與在約2xl05個CH0_GMRa#ll細胞上表達的所述人類GM-CSF受體a鏈的濃度相似；及(b)所述經(jīng)分離的人類或人源化抗體或其功能片段的濃度為約5 ii g/ml ;及(ii)在TF-1增殖分析中以比參考抗體BVD2-21C11和/或參考抗體MAB215低至少5倍的IC5tl值中和0.25ng/ml人類GM-CSF。本文所用“TF-1增殖分析”定義為本質(zhì)上如在實例5B中所述的分析。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員可按照本文提供的教示以相似于在約2xl05個CH0-GMRa#ll細胞上表達的濃度表達人類GM-CSF受體a鏈的CHO-Kl細胞。本發(fā)明也提供包含如本文所揭示抗原結(jié)合區(qū)的經(jīng)分離的人類或人源化抗體或功能抗體片段。所述抗體或其功能片段可包含抗原結(jié)合區(qū)，所述抗原結(jié)合區(qū)包含在SEQID NO:
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51 或 52 中所描述的 H-CDR3 區(qū)；所述抗原結(jié)合區(qū)可進一步包含在 SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51 或 52 中所描述的H-CDR2區(qū)；并且所述抗原結(jié)合區(qū)也可包含在SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51或52中所描述的H-⑶Rl區(qū)。所述抗體或其功能片段可包含抗原結(jié)合區(qū)，所述抗原結(jié)合區(qū)包含在 SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51 或 52 中所描述的可變重鏈。本發(fā)明所述GM-CSF特異性抗體可包含抗原結(jié)合區(qū)，所述抗原結(jié)合區(qū)包含在SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60 或 61 中所描述的 L-CDR3 區(qū)；所述抗原結(jié)合區(qū)可進一步包含在 SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60 或 61中所描述的L-CDR2區(qū)；并且所述抗原結(jié)合區(qū)也可包含在SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60或61中所描述的L-CDRl區(qū)。所述抗體或其功能片段可包含抗原結(jié)合區(qū)，所述抗原結(jié)合區(qū)包含在 SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60 或61中所描述的可變輕鏈。本發(fā)明也包括本文所揭示序列的肽變體。因此，本發(fā)明包括具有如下重鏈氨基酸序列的抗GM-CSF抗體:在 CDR 區(qū)中與在 SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51或52中所描述的⑶R區(qū)具有至少60%序列一致性；和或在⑶R區(qū)中與在SEQ ID NO:
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51 或 52 中所描述的 CDR 區(qū)具有至少 80%序列同源性。本發(fā)明進一步包括具有如下輕鏈氨基酸序列的抗GM-CSF抗體:在CDR區(qū)中與在SEQID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60 或 61 中所描述的 CDR 區(qū)具有至少 60%序列一致性;和或在 CDR 區(qū)中與在 SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60或61中所描述的⑶R區(qū)具有至少80%序列同源性。本發(fā)明抗體可為IgG (例如IgG1),而抗體片段可為(例如)Fab或scFv。因此,本發(fā)明抗體片段可為或可包含以一種或多種本文所述方式表現(xiàn)的抗原結(jié)合區(qū)。本發(fā)明也關(guān)于經(jīng)分離的核酸序列，每一核酸序列皆能夠編碼對GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或功能抗體片段的抗原結(jié)合區(qū)。所述核酸序列可編碼經(jīng)分離的人類或人源化抗體或其功能片段的可變重鏈，其包括SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、44、45、46、47 或 48 或在高度嚴格的條件下與 SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、44、45、46、47或48的互補鏈雜交的核酸序列。所述核酸可編碼經(jīng)分離的人類或人源化抗體或其功能片段的可變輕鏈，其包括SEQ ID NO:21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、53、54、55、56 或57或在高度嚴格的條件下與 SEQ ID NO:21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，53、54、55、56 或 57的互補鏈雜交的核酸序列。所述核酸序列 可編碼對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或功能抗體片段的抗原結(jié)合區(qū)，其中所述抗體或其功能片段能夠(i)在以下條件下將0.5 y g/ml人類GM-CSF與在2xl05個CHO-Kl細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的相互作用阻斷至少50%: (a)在所述CHO-Kl細胞上表達的所述人類GM-CSF受體a鏈的濃度與在2xl05個CH0_GMRa#ll細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的濃度相似；及(b)所述經(jīng)分離的人類或人源化抗體或其功能片段的濃度為約5 y g/ml ;及(ii)在TF-1增殖分析中以比參考抗體BVD2-21C11和/或參考抗體MAB215低至少5倍的IC5tl值中和0.25ng/ml人類GM-CSF。本發(fā)明核酸適于重組產(chǎn)生。因此，本發(fā)明也關(guān)于包含本發(fā)明核酸序列的載體及宿主細胞。所述宿主細胞可為細菌細胞或真核細胞。本發(fā)明組合物可用于治療性或預防性應(yīng)用。因此，本發(fā)明包括包含本發(fā)明抗體(或功能抗體片段)和用于此的醫(yī)藥上可接受的載劑或賦形劑的醫(yī)藥組合物。在相關(guān)方面中，本發(fā)明提供一種治療與GM-CSF的不期望存在或GM-CSF表達細胞有關(guān)的疾病或病癥的方法。所述方法包括向需要其的個體投與有效量的包含本文所述或所涵蓋本發(fā)明抗體的醫(yī)藥組合物的步驟。所述疾病或病癥可為炎癥性疾病，例如類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、克羅恩病、牛皮癬、哮喘病、特應(yīng)性皮炎和休克。本發(fā)明人類或人源化抗體(及其功能片段)可與大鼠和/或恒河猴(rhesus或macaca) GM-CSF交叉反應(yīng)，如通過溶液平衡滴定(SET)和/或TFl增殖分析所測定。


圖1a提供各種新穎抗體可變重鏈區(qū)的核酸序列。圖1b提供各種新穎抗體可變重鏈區(qū)的氨基酸序列。⑶R區(qū)HCDRl、HCDR2及HCDR3以粗體由N-末端至C-末端命名。圖2a提供各種新穎抗體可變輕鏈區(qū)的核酸序列。圖2b提供各種新穎抗體可變輕鏈區(qū)的氨基酸序列。⑶R區(qū)IXDRl、IXDR2及IXDR3以粗體由N-末端至C-末端命名。圖3提供基于一致序列的HuCAL 抗體主導基因序列的可變重鏈區(qū)的氨基酸序列。CDR區(qū)HCDRl、HCDR2及HCDR3以粗體由N-末端至C-末端命名(SEQ ID NO:41)。
圖4提供基于一致序列的HuCAL 抗體主導基因序列的可變輕鏈區(qū)的氨基酸序列。CDR區(qū)LCDRl、LCDR2及LCDR3以粗體由N-末端至C-末端命名(SEQ ID NO:42)。圖5 提供pMORPH X9_MC)R03929_FH表達載體的 DNA 序列的實例(SEQ IDNO:43)。圖6提供GM-CSF受體a的表達水平，如使用GM-CSF受體a的特異性抗體MAB1006通過FACS分析所測定。CH0-GMRa#ll(實線)與CHO-Kl (虛線)比較顯示。X軸代表在FL2通道中測量的相對熒光值(RFL) ;y軸代表細胞計數(shù)。
具體實施例方式本發(fā)明基于對GM-CSF具有特異性或具有高親和力并且具有一種或多種其他新穎特性的新穎抗體的發(fā)現(xiàn)。較佳地，本發(fā)明抗體可向個體遞送治療益處。本發(fā)明抗體可為人類或人源化抗體，其可用于多種領(lǐng)域，本文將對其進行更為全面的闡述。本文將“人類”抗體或人類功能抗體片段定義為并非嵌合(例如非“人源化”)且并非(完全或部分地)源自非人類物種的抗體或功能抗體片段。人類抗體或功能抗體片段可源自人類或可為合成人類抗體。本文將“合成人類抗體”定義為具有完全或部分源自基于在電腦上對已知人類抗體序列分析的合成序列的序列的抗體。人類抗體序列或其片段的電腦上的設(shè)計可如下達成:(例如)分析人類抗體或抗體片段序列資料庫并利用由其中獲得的資料設(shè)計多肽序列。人類抗體或功能抗體片段的另一個實例是由自來源于人類的抗體序列文庫(即，所述文庫基于由人類天然來源獲取的抗體)分離出的核酸編碼的人類抗體或功能抗體片段。本文將“人源化抗體”或人源化抗體功能片段定義為如下者:(i)源自非人類來源(例如，具有異源免疫系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因小鼠)者，所述抗體基于人類種系序列；或(ii)嵌合者，其中可變結(jié)構(gòu)域源自非人類來源 且恒定結(jié)構(gòu)域源自人類來源；或(iii) CDR移植者，其中可變結(jié)構(gòu)域的CDR源自非人類來源，而一個或多個可變結(jié)構(gòu)域的框架源于人類來源且恒定結(jié)構(gòu)域(若存在)源于人類來源。若所述抗體能夠辨別所述抗原與一種或多種參考抗原，則認為本文所用抗體可“特異性結(jié)合”抗原(本文為GM-CSF)、對抗原“具有特異性”或“特異識別”抗原，因為結(jié)合特異性并非絕對性質(zhì)而為相對性質(zhì)。在其最通用形式中(且當未提及經(jīng)定義參考物時)，“特異性結(jié)合”是指抗體辨別受關(guān)注抗原與無關(guān)抗原的能力，如(例如)根據(jù)下列方法之一所確定。所述方法包括但不限于西方點潰分析、ELISA測試、RIA測試、ECL測試、IRMA測試及肽掃描。例如，可實施標準ELISA分析?？赏ㄟ^標準顯色系統(tǒng)(例如二級抗體與辣根過氧化物及四甲基聯(lián)苯胺與過氧化氫)實施評分。在某些孔中的反應(yīng)通過光密度(例如，在450nm下)實施評分。典型背景(等于陰性反應(yīng))可為0.1OD ;典型陽性反應(yīng)可為10D。此表明，陽性/陰性差會超過10倍。通常，結(jié)合特異性的測定并非通過使用單個參考抗原實施而是通過使用一組約3個至5個無關(guān)抗原(例如奶粉、BSA、鐵傳遞蛋白或諸如此類)實施。然而，“特異性結(jié)合”也可指抗體辨別靶抗原與一種或多種可用作參考點的密切相關(guān)抗原的能力，例如辨別GM-CSF與IL3、IL5、IL-4、IL13或M-CSF。此外，“特異性結(jié)合”可指抗體辨別其靶抗原不同部分(例如GM-CSF的不同結(jié)構(gòu)域或區(qū)域)或辨別GM-CSF的一種或多種關(guān)鍵氨基酸殘基或若干段氨基酸殘基的能力。同樣，本文將本文所用“免疫球蛋白”(Ig)定義為屬于類別IgG、IgM、IgE、IgA或IgD (或其任何亞類)的蛋白質(zhì)，并包括所有傳統(tǒng)已知抗體及其功能片段。本文將抗體/免疫球蛋白的“功能片段”定義為保留抗原結(jié)合區(qū)的抗體/免疫球蛋白片段(例如，IgG可變區(qū))。我們發(fā)現(xiàn)抗體的“抗原結(jié)合區(qū)”通常位于抗體的一個或多個超變區(qū)(即，CDR-l、CDR-2和/或⑶R-3區(qū))中；然而，可變“框架”區(qū)也可在抗原結(jié)合中發(fā)揮重要作用，例如為⑶R提供支架結(jié)構(gòu)。較佳地，“抗原結(jié)合區(qū)”至少包含可變輕(VL)鏈的4至103位氨基酸殘基及可變重(VH)鏈的5至109位氨基酸殘基，更佳地包含VL的3至107位氨基酸殘基及VH的4至111位氨基酸殘基，且尤佳為完整的VL鏈及VH鏈(VL的I至109位氨基酸及VH的I至113位氨基酸；根據(jù)WO 97/08320進行編碼)。用于本發(fā)明的較佳免疫球蛋白類別為IgG。本發(fā)明“功能片段”包括F(ab’)2片段、Fab片段、scFv或包含單個免疫球蛋白可變結(jié)構(gòu)域或單個結(jié)構(gòu)域抗體多肽的構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)域，例如單個重鏈可變結(jié)構(gòu)域或單個輕鏈可變結(jié)構(gòu)域。F(ab’)2或Fab可經(jīng)構(gòu)建以最小化或完全消除Cm與Q結(jié)構(gòu)域之間發(fā)生的分子間二硫化物相互作用。本發(fā)明抗體可源自基于已在電腦上加以設(shè)計并由合成產(chǎn)生的核酸編碼的氨基酸序列的重組抗體文庫。抗體序列的電腦上設(shè)計可如下達成:例如，分析人類序列資料庫并利用由其中獲得的資料設(shè)計多肽序列。用于設(shè)計并獲取電腦上形成的序列的方法闡述于(例如)Knappik 等人,J.Mol.Biol.(2000)296:57 ;Krebs 等人,J.Tmmuno1.Methods.(2001)254:67 ;及頒予Knappik等人的美國專利第6，300, 064號，特此其全文以引用方式并入本文中。本發(fā)明抗體貫穿本案全文，會提及下列本發(fā)明代表性抗體:“抗體號”或“1 ”03684、04251、03929、04252、04287、 04290、04302、04350、04354、04357、03682、04283、04297 及 04342。M0R03684代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:1 (DNA)/SEQ ID NO:11(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ ID NO:21 (DNA) /SEQ ID NO:31 (蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04251代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:2 (DNA)/SEQ ID NO:12(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ IDNO:22 (DNA)/SEQ ID NO:32(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R03929代表具有對應(yīng)于SEQID NO:3 (DNA)/SEQ ID NO:13(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于 SEQ ID NO:23 (DNA)/SEQID NO:33(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04252代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:4(DNA)/SEQ ID NO:14(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ ID NO:24(DNA)/SEQ ID NO:34(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04287代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:5 (DNA)/SEQ ID NO:15(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ ID NO:25 (DNA)/SEQ ID NO:35(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04290代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:6 (DNA)/SEQ ID NO:16(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ ID NO:26 (DNA)/SEQ ID NO:36(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04302代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:7 (DNA)/SEQ ID NO:17(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ ID NO:27 (DNA)/SEQ ID NO:37(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04350代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:8 (DNA)/SEQ ID NO:18(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQID NO:28 (DNA)/SEQ ID NO:38(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04354代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:9 (DNA)/SEQ ID NO:19(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于 SEQ ID NO: 29 (DNA)/SEQ ID NO:39(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04357代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:10或48(DNA)/SEQ ID NO:20(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ ID NO: 30或57 (DNA)/SEQID NO:40(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R03682代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:44 (DNA)/SEQ ID NO:49(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ ID NO:53 (DNA)/SEQ ID NO:58(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04283代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:45 (DNA)/SEQ ID NO:50(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ ID NO:54 (DNA)/SEQ ID NO:59(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04297代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:46 (DNA)/SEQ ID NO:51(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ ID NO:55 (DNA)/SEQ ID NO:60(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。M0R04342代表具有對應(yīng)于SEQ ID NO:47 (DNA)/SEQ ID NO:52(蛋白質(zhì))的可變重鏈區(qū)及對應(yīng)于SEQ ID NO:56 (DNA)/SEQ ID NO:61(蛋白質(zhì))的可變輕鏈區(qū)的抗體。一方面，本發(fā)明提供具有可特異性結(jié)合GM-CSF或?qū)M-CSF具有高親和力的抗原結(jié)合區(qū)的抗體。若親和力測量值至少為IOOnM(Fab片段的單價親和力)，則認為抗體對抗原具有“高親和力”。本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合區(qū)較佳可以約小于100nM、更佳小于約60nM且甚佳小于約30nM的親和力與GM-CSF結(jié)合。更佳為可以小于約IOnM且更佳小于約3nM的親和力與GM-CSF結(jié)合的抗體。例如，本發(fā)明抗體對GM-CSF的親和力可為約10.0nM或IpM(Fab片段的單價親和力)。表I提供本發(fā)明代表性抗體的親和力的概述，如通過表面等離子體共振(Biacore)及溶液平衡滴定(SET)分析所測定:表1:抗體親和力
權(quán)利要求
1.一種經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段，其中所述經(jīng)分離的人類或人源化抗體或其功能片段能夠: (i)在以下條件下將0.5 ii g/ml人類GM-CSF與在約2xl05個CHO-Kl細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的相互作用阻斷至少50%: (a)在所述CHO-Kl細胞上表達的所述人類GM-CSF受體a鏈的濃度與在約2xl05個CH0_GMRa#ll細胞上表達的人類GM-CSF受體a鏈的濃度相似；和(b)所述經(jīng)分離的人類或人源化抗體或其功能片段的濃度為約5 u g/ml ；以及 (ii)在TF-1增殖分析中以比參考抗體BVD2-21C11或MAB215低至少5倍的IC5tl值中和 0.25ng/ml 人類 GM-CSF。
2.按權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段，其中所述抗體或其功能片段與大鼠GM-CSF和/或恒河猴GM-CSF交叉反應(yīng)。
3.按權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段，其中所述人類抗體為合成人類抗體。
4.按權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段，其為IgG。
5.按權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段， 其為Fab或scFv抗體片段。
6.按權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段，其中所述經(jīng)分離的人類或人源化抗體或其功能片段在TF-1增殖分析中以比參考抗體MAB215或BVD2-21C11低至少10倍的IC5tl值中和0.25ng/ml人類GM-CSF。
7.按權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段，其中所述經(jīng)分離的人類或人源化抗體或其功能片段在TF-1增殖分析中以比參考抗體MAB215或BVD2-21C11低至少20倍的IC5tl值中和0.25ng/ml人類GM-CSF。
8.按權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段，其中所述經(jīng)分離的人類或人源化抗體或其功能片段在TF-1增殖分析中以比參考抗體MAB215或BVD2-21C11低至少50倍的IC5tl值中和0.25ng/ml人類GM-CSF。
9.按權(quán)利要求1或2所述的經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段，其包括重鏈氨基酸序列和輕鏈氨基酸序列；其中所述重鏈氨基酸序列包含在 SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51 或 52 中所描述的 H-CDRl 區(qū)、H-CDR2區(qū)和H-CDR3區(qū)；所述輕鏈氨基酸序列包含在SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60 或 61 中所描述的 L-CDR1 區(qū)、L-CDR2 區(qū)和 L-CDR3 區(qū)。
10.按權(quán)利要求9所述的經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段，其包括在 SEQ ID NO:11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、49、50、51 或 52 中所描述的重鏈氨基酸序列以及在 SEQ ID NO:31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、58、59、60 或 61中所描述的輕鏈氨基酸序列。
11.一種經(jīng)分離的核酸序列，其編碼如權(quán)利要求9或10所述的經(jīng)分離的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段的抗原結(jié)合區(qū)。
12.一種經(jīng)分離的核酸序列，其編碼人類或人源化抗體或功能抗體片段的抗原結(jié)合區(qū)，所述經(jīng)分離的核酸序列包括(i)SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、44、45、46、47 或48 ;和SEQ ID NO:21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、53、54、55、56 或 57 ;其中所述抗體或其功能片段對人類GM-CSF具有特異性。
13.一種載體，其包含如權(quán)利要求11或12所述的核酸序列。
14.一種醫(yī)藥組合物，其包含如權(quán)利要求1至10中任一權(quán)利要求所述的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段和用于此的醫(yī)藥上可接受的載劑或賦形劑。
15.一種如權(quán)利要求1至10中任一權(quán)利要求所述的對人類GM-CSF具有特異性的人類或人源化抗體或其功能片段和用于此的醫(yī)藥上可接受的載劑或賦形劑在制備醫(yī)藥組合物中的用途；所述組合物用于治療與不期望存在GM-CSF有關(guān)的疾病或病癥；所述組合物適合于向有需要的個體投予。
16.按權(quán)利要求15所述的用途，其中所述疾病或病癥為炎癥性疾病。
17.按權(quán)利要求16所述的方法，其中所述炎癥性疾病選自類風濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化癥、克羅恩(Crohn' s)病、牛皮癬、哮喘病、特應(yīng)性皮炎和休克的列表。
全文摘要
本發(fā)明提供對在多種疾病或病癥中起重要作用的GM-CSF具有特異性的重組抗原結(jié)合區(qū)、抗體和其功能片段。因此，這些抗體可用于治療(例如)諸如類風濕性關(guān)節(jié)炎等炎癥性疾病。本發(fā)明抗體也可用于診斷學領(lǐng)域，以及用于進一步研究GM-CSF在多種疾病進展中的作用。本發(fā)明也提供編碼前述抗體的核酸序列、包含所述核酸序列的載體、醫(yī)藥組合物和帶有使用說明的試劑盒。
文檔編號C12N15/13GK103087190SQ20121051023
公開日2013年5月8日 申請日期2006年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月18日
發(fā)明者斯特凡·施泰德爾, 伊麗莎白·托馬森-沃爾夫 申請人:莫菲西斯公司