專利名稱：一種具有雙熒光基團(tuán)的質(zhì)粒及其作為標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有雙熒光基團(tuán)的質(zhì)粒及其作為標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在進(jìn)行基因功能研究時(shí)通常會(huì)用到敲除技術(shù)。作為一種有效的定點(diǎn)敲除工具，TALENs受到越來(lái)越多的科研人員的重視。由于其效率高，作用穩(wěn)定，制備簡(jiǎn)單，成本低廉，在今后將會(huì)得到更廣泛的應(yīng)用。TALENs是根據(jù)特定基因制備出來(lái)的，在應(yīng)用制備出的TALENs之前，通常會(huì)在細(xì)胞水平上檢測(cè)該TALENs是否對(duì)基因組內(nèi)該特定基因有敲除效果。
目前傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要有測(cè)序、酶切和雙熒光素酶檢測(cè)三種方法。這三種方法盡管各有千秋，但是都有很大的局限性。第一，測(cè)序和酶切轉(zhuǎn)染細(xì)胞后的工作量大，研究周期長(zhǎng)，工序復(fù)雜。第二，通過(guò)測(cè)序的方式檢測(cè)將耗費(fèi)大量的資金。如果敲除效率按1%計(jì)算，至少測(cè)100條可能才能測(cè)出I條突變，耗費(fèi)將為2500元，如需更精確將測(cè)定更多克隆，耗費(fèi)將更大。第三，雙熒光素酶法雖然檢測(cè)過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，但需要螢火蟲熒光素酶質(zhì)粒(用于檢測(cè)TALENs效率)、海腎熒光素酶質(zhì)粒(用于矯正轉(zhuǎn)染效率)、TALENs本身兩個(gè)質(zhì)粒，加上兩個(gè)熒光素酶質(zhì)粒共四個(gè)質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，很難保證轉(zhuǎn)染效率高效一致，其中的一個(gè)熒光素酶基因也很難發(fā)揮矯正作用，檢測(cè)出的結(jié)果誤差很大、不精確。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有雙熒光基團(tuán)的質(zhì)粒及其作為標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用。本發(fā)明提供的質(zhì)粒，包括表達(dá)盒甲(hRluc表達(dá)盒)和表達(dá)盒乙(hFluc表達(dá)盒);所述表達(dá)盒甲包括啟動(dòng)子甲、特異DNA片段甲和終止子甲；所述表達(dá)盒乙包括啟動(dòng)子乙、特異DNA片段乙和終止子乙；所述特異DNA片段乙為編碼序列表的序列3所示的hFluc蛋白的DNA分子；所述特異DNA片段甲為如下(a)或(b):(a)自上游至下游依次包括如下元件hRlucl片段、hRluc2片段、特異DNA片段丙、所述hRluc2片段和hRlu3片段；所述hRlucl片段、所述hRluc2片段和所述hRlu3片段順次連接后編碼序列表的序列4所示的hRluc蛋白；編碼所述hRluc蛋白的起始密碼子位于所述hRlucl片段上；編碼所述hRluc蛋白的終止密碼子位于所述hRlu3片段上；(b)自上游至下游依次包括如下元件hRluc-X片段、特異DNA片段丙、所述hRluc-X片段和hRluc-Y片段；所述hRluc-X片段和所述hRluc-Y片段順次連接后編碼序列表的序列4所示的hRluc蛋白；編碼所述hRluc蛋白的起始密碼子位于所述hRluc-X片段上；編碼所述hRluc蛋白的終止密碼子位于所述hRluc-Y片段上；所述(a)和/或所述(b)中，所述特異DNA片段丙中具有終止所述特異DNA片段甲連續(xù)編碼的終止密碼子；所述特異DNA片段丙中具有多克隆位點(diǎn)。 所述hRluc2片段可由10-1000個(gè)核苷酸組成。所述hRluc2片段具體可由300-500個(gè)核苷酸組成。所述hRlucl片段可由200-400個(gè)核苷酸組成。所述hRlu3片段具體可由150-350個(gè)核苷酸組成。所述hRluc-X片段片段可由10-10000個(gè)核苷酸組成。所述hRluc2片段具體可如序列表的序列2自5’末端第993至1392位核苷酸所示。所述hRlucl片段具體可如序列表的序列2自5’末端第694至992位核苷酸所示。所述hRlu3片段具體可如序列表的序列2自5’末端第1908至2144位核苷酸所示。所述特異DNA片段丙可如 序列表的序列I自5’末端第7至121位核苷酸所示。所述特異DNA片段甲具體可如序列表的序列2自5’末端第694至2144位核苷酸所示。所述啟動(dòng)子甲可為SV40早期增強(qiáng)子-啟動(dòng)子。所述終止子甲可為SyntheticPoly(A)0所述SV40早期增強(qiáng)子-啟動(dòng)子具體可如序列表的序列2自5’末端第7至425位核苷酸所示。所述Synthetic poly (A)具體可如序列表的序列2自5’末端第2203至2251位核苷酸所示。所述表達(dá)盒甲具體可如序列表的序列2自5’末端第7至2251位核苷酸所示。所述所述特異DNA片段乙具體可如序列表的序列2自5’末端第3047至4699位核苷酸所示。所述啟動(dòng)子乙可為單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子。所述終止子乙可為SV401atepoly(A)。所述單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子具體可如序列表的序列2自5’末端第2259至3011位核苷酸所示。所述SV401ate poly (A)具體可如序列表的序列2自5’末端第4734至4955位核苷酸所示。所述表達(dá)盒乙具體可如序列表的序列2自5’末端第2259至4955位核苷酸所示。所述質(zhì)粒還可包括抗性篩選基因。所述抗性篩選基因可為氨芐青霉素抗性篩選基因，具體可如序列表的序列2自5’末端第5102至5962位核苷酸所示。所述質(zhì)粒具體可如序列表的序列2所示。以上任一所述質(zhì)粒均可用于鑒定TALENs的敲除效率。用于所述質(zhì)粒鑒定TALENs的敲除效率的方法具體如下(I)在所述質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)插入具有所述TALENs的識(shí)別序列的DNA片段，得到重組質(zhì)粒；(2)將所述重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，與所述TALENs (質(zhì)粒對(duì))共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)所述hRluc蛋白的熒光信號(hào)鑒定TALENs的敲除效率。所述hRluc蛋白的熒光信號(hào)越高，代表所述TALENs的敲除效率越高。所述應(yīng)用中，可將所述hFluc蛋白的熒光信號(hào)作為參比信號(hào)。將本發(fā)明提供的質(zhì)粒和待鑒定的TALENs質(zhì)粒對(duì)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，如果切割識(shí)別區(qū)被識(shí)別并切割，兩個(gè)hRluc2發(fā)生同源重組，從而形成有活性的海腎熒光素酶并顯示特異性熒光。螢火蟲熒光素酶基因表達(dá)螢火蟲熒光素酶并顯示特異性熒光，用于矯正轉(zhuǎn)染效率。因?yàn)楹ＤI熒光素基因和螢火蟲熒光素酶基因在同一質(zhì)粒上，所以避免了兩個(gè)基因轉(zhuǎn)染效率不一致的發(fā)生，從而降低實(shí)驗(yàn)誤差。采用本發(fā)明提供的質(zhì)粒鑒定TALENs的敲除效率，具有以下優(yōu)勢(shì)第一，檢測(cè)工序簡(jiǎn)單，省去了細(xì)胞轉(zhuǎn)染后的DNA提取、PCR擴(kuò)增、酶切或載體連接測(cè)序等多項(xiàng)操作，節(jié)約人力；第二，節(jié)約時(shí)間，比酶切節(jié)約至少3天,比測(cè)序節(jié)約I周；第三，節(jié)約成本，比測(cè)序至少節(jié)約2500元的成本；第四，與傳統(tǒng)雙熒光素酶法相比，本發(fā)明將兩個(gè)熒光素酶質(zhì)粒整合到一個(gè)上，能保證兩個(gè)熒光素酶的轉(zhuǎn)染效率一致，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。本發(fā)明提供的質(zhì)粒還適用于還可以用于同類型的ZFNs與I-SceI敲除效率的檢測(cè)。


圖I為SSA系統(tǒng)的工作原理圖。圖2為psiCHECK-2載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3為重組質(zhì)粒SSA-hRluc-ps iCHECK的酶切鑒定圖(AatII酶切)。圖4為重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5為四種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)不意圖和工作原理不意圖。圖6為重組質(zhì)粒TALE-IL具有的串聯(lián)模塊及其構(gòu)建過(guò)程的示意圖。圖7為重組質(zhì)粒TALE-IR具有的串聯(lián)模塊及其構(gòu)建過(guò)程的示意圖。圖8為重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas_lL和重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR的構(gòu)建流程圖。圖9為重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas_lL和重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR敲除效率的測(cè)序結(jié)果。圖10為重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas_lL和重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR敲除效率的熒光檢測(cè)結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。螢火蟲突光素酶即Firefly luciferases,簡(jiǎn)稱hFluc蛋白，其氨基酸序列如序列表的序列3所示。海腎熒光素酶即Renilla luciferases，簡(jiǎn)稱hRluc蛋白，其氨基酸序列如序列表的序列4所示。以下實(shí)施例中，如無(wú)特殊說(shuō)明，均采用低糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。pTALE-A CffB 10, Cat No. CW2238。pTALE-G :CWBI0 Cat No.CW2239。pTALE-C :CffBIOCat No. CW2240。pTALE-T =CffBIOCat No. CW2241。實(shí)施例I、重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK的制備SSA 系統(tǒng)全稱為 Double-Strand Break Repair via Single Strand Annealing,是一種體內(nèi)本身存在的自動(dòng)DNA重組修復(fù)系統(tǒng)。該系統(tǒng)由三段序列組成兩段完全相同的同源序列和中間的切割識(shí)別區(qū)。SSA系統(tǒng)的工作原理圖見(jiàn)圖I。當(dāng)切割識(shí)別區(qū)(切割識(shí)別區(qū)中具有終止密碼子)中間不被切割時(shí)，SSA系統(tǒng)所在的基因是被阻斷的，無(wú)法翻譯成有功能的蛋白；當(dāng)被切割后，SSA系統(tǒng)會(huì)將同源序列自動(dòng)合并，重疊序列變?yōu)閱我恍蛄?，合并后基因得到重組修復(fù)，可以被通讀翻譯，將會(huì)產(chǎn)生有功能的蛋白。按SSA系統(tǒng)的工作原理設(shè)計(jì)并制備重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK。一、人工合成SSA-hRluc片段。SSA-hRluc片段為序列表的序列I所示的雙鏈DNA分子，其中自5’末端第I至6位核苷酸為AatII酶切識(shí)別序列、第7至34位核苷酸為左側(cè)多克隆位點(diǎn)(第7至12位核苷酸為AgeI酶切識(shí)別序列、第16至23位核苷酸為AscI酶切識(shí)別序列、第27至34位核苷酸為PacI酶切識(shí)別序列；其中第28至30位核苷酸為“TAA”，除了作為酶切識(shí)別序列的一部分，還起終止密碼子的功能)，第87至121位核苷酸為右側(cè)多克隆位點(diǎn)(第87至92位核苷酸為SacI酶切識(shí)別序列、第96至101位核苷酸為SalI酶切識(shí)別序列、第105至112位核苷酸為SbfI酶切識(shí)別序列、第116至121位核苷酸為SpeI酶切識(shí)別序列)，第122至521位核苷酸為hRluc2片段(同時(shí)第516至521位核苷酸也為AatII酶切識(shí)別序列)。二、重組質(zhì)粒 SSA-hRluc-psiCHECK 的構(gòu)建 psiCHECK-2載體(Promega，Cat. #C8021 ;結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖2)是雙熒光素酶報(bào)告載體，同時(shí)含有hRluc蛋白和hFluc蛋白的全套表達(dá)元件，且兩個(gè)基因的各項(xiàng)元件都是彼此獨(dú)立的，能同時(shí)表達(dá)兩個(gè)熒光素酶基因而不受干擾。I、用限制性內(nèi)切酶AatII酶切psiCHECK-2載體，回收約6kb的載體骨架。2、用限制性內(nèi)切酶AatII酶切SSA-hRluc片段，回收約500bp的酶切產(chǎn)物。3、將步驟I的載體骨架和步驟2的酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK。重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK的酶切鑒定圖(AatII酶切)見(jiàn)圖3，顯示約6kb的預(yù)期條帶和約500bp的預(yù)期條帶。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在PsiCHECK載體的AatII酶切位點(diǎn)插入了序列表的序列I自5’末端第7-515位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK的結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖4。重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK的測(cè)序結(jié)果見(jiàn)序列表的序列2。序列表的序列2中，自5’末端第7至425位核苷酸為SV40早期增強(qiáng)子-啟動(dòng)子(SV40early enhancer/promoter)>% 694 至 992 位核苷酸為 hRlucl 片段、第 993 至 1392位核苷酸為hRluc2片段、第1387至1907位核苷酸為SSA-hRluc片段(其中第1508至1907位核苷酸為hRluc2片段)、第1908至2144位核苷酸為hRlu3片段、第2203至2251位核苷酸為起終止轉(zhuǎn)錄作用的Synthetic poly (A)、第2259至3011位核苷酸為單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子(HSV-TK promoter)、第3047至4699位核苷酸為hFluc蛋白的編碼基因，第4734至4955位核苷酸為起終止轉(zhuǎn)錄作用的SV401ate poly (A)、第5102至5962位核苷酸為氨芐青霉素抗性篩選基因。實(shí)施例2、重組質(zhì)粒 SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN 的制備I、分別合成序列表的序列5所示的單鏈DNA分子和序列表的序列6所示的單鏈DNA分子，將兩個(gè)單鏈DNA分子退火后得到帶有粘末端的雙鏈DNA分子(MSTN片段)。序列5 :5，-CGCGCCTCGTTACCCTCTAACTGTGGATTTTGAAGCTTTTGGATGGGACTGGATTATTGCAG-3，；序列 6 5， -TCGACTGCAATAATCCAGTCCCATCCAAAAGCTTCAAAATCCACAGTTAGAGGGTAACGAGG—3，。2、用限制性內(nèi)切酶AscI和SalI雙酶切重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK，回收約6. 5kb的載體骨架。3、將步驟I得到的雙鏈DNA分子和步驟2得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN。實(shí)施例3、TALE靶點(diǎn)識(shí)別模塊的構(gòu)建一、四種模塊以及將模塊進(jìn)行組合的機(jī)理描述
TAL的核酸識(shí)別單元為間隔32個(gè)恒定氨基酸序列的雙連氨基酸。雙連氨基酸與A、G、C、T有恒定的對(duì)應(yīng)關(guān)系，即NI識(shí)別A、NG識(shí)別T、HD識(shí)別C、NN識(shí)別G。pTALE-A質(zhì)粒、PTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE_T質(zhì)粒為單模塊載體，為分別具有上述四種TAL的核酸識(shí)別單元的編碼DNA的質(zhì)粒，且在編碼DNA的5’末端具有Spe I酶切識(shí)別序列、3’末端具有連續(xù)的Nhe I酶切識(shí)別序列和Hind III識(shí)別序列。通過(guò)單模塊載體上的Spe I, NheI和Hind III酶切位點(diǎn)按照靶點(diǎn)序列相對(duì)應(yīng)的TAL單元即可串聯(lián)克隆，其中右側(cè)靶點(diǎn)序列需反向構(gòu)建模塊。四種質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖和工作原理示意圖見(jiàn)圖5。目前，TALEN系統(tǒng)利用FokI的內(nèi)切酶活性打斷目標(biāo)基因，因?yàn)镕okI需形成2聚體方能發(fā)揮活性，在實(shí)際操作中需在目標(biāo)基因中選擇兩處相鄰(間隔14-18堿基)的靶序列(一般十幾個(gè)堿基)分別進(jìn)行TAL識(shí)別模塊構(gòu)建。二、靶點(diǎn)的選擇 MSTN基因的部分序列見(jiàn)序列表的序列7，其中自5’末端第615至995位核苷酸為第三外顯子。首先通過(guò)大量序列分析和篩選工作將第三外顯子作為初步選定的靶點(diǎn)，然后通過(guò)進(jìn)一步篩選，將序列表的序列7自5’末端第713至767位核苷酸作為進(jìn)一步選定的靶點(diǎn)，通過(guò)再次的篩選，將序列表的序列7自5’末端第714-729位核苷酸和第750-766位核苷酸作為最終的靶點(diǎn)。三、重組質(zhì)粒TALE-IL (左側(cè)TALE模塊)和重組質(zhì)粒TALE-IR (右側(cè)TALE模塊)的構(gòu)建根據(jù)選定的靶點(diǎn)，用pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE-T質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒TALE-IL (具有圖6所示的串聯(lián)模塊)，構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖6。根據(jù)選定的靶點(diǎn)，用pTALE-A質(zhì)粒、pTALE-G質(zhì)粒、pTALE-C質(zhì)粒和pTALE_T質(zhì)粒構(gòu)建重組質(zhì)粒TALE-IR(具有圖7所示的串聯(lián)模塊)，構(gòu)建過(guò)程見(jiàn)圖7。重組質(zhì)粒TALE-IL識(shí)別16個(gè)核苷酸(CGTTACCCTCTAACTG),重組質(zhì)粒 TALE-1R 識(shí)別 17 個(gè)核苷酸(GCAATAATCCAGTCCCA)。重組質(zhì)粒TALE-IL和重組質(zhì)粒TALE-IR統(tǒng)稱重組質(zhì)粒TALE。四、重組質(zhì)粒pcs2-TALE_peas_lL 和重組質(zhì)粒 pcs2_TALE-peas_lR 的構(gòu)建pCS2-Fok I載體CWBI0，Cat No. CW2273 ;包括一對(duì)結(jié)構(gòu)基本相同的質(zhì)粒，pCS2-Fok I 載體(PEAS 型)和 pCS2_Fok I 載體(PERR 型)，pCS2_Fok I 載體(PEAS 型)又稱 PEAS 型 pCS2-Fok I 載體，pCS2_Fok I 載體(PERR 型)又稱 PERR 型 pCS2_Fok I 載體，pCS2-Fok I載體(PEAS型)和pCS2_Fok I載體(PERR型)的差異僅在于pCS2_Fok I載體(PEAS型)具有編碼Fok I核酸內(nèi)切酶(PEAS型)的DNA序列，pCS2_Fok I載體(PERR型)具有編碼Fok I核酸內(nèi)切酶(PERR型)的DNA序列；質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)為具有由sCMV啟動(dòng)子控制的、除目標(biāo)基因靶點(diǎn)識(shí)別域外的TALEN必需元件、編碼Fok I核酸內(nèi)切酶(PEAS型或PERR型)的DNA序列，在編碼TALE0. 5單元模塊(RVD NG,識(shí)別T堿基)的DNA序列的5 ’端嵌有限制性內(nèi)切酶NheI DNA的識(shí)別序列。Fok I核酸內(nèi)切酶(PEAS型)和Fok I核酸內(nèi)切酶(PERR型)形成2聚體后發(fā)揮內(nèi)切酶的功能。重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lL 和重組質(zhì)粒 pcs2_TALE-peas_lR 統(tǒng)稱 pcs2_TALEN,構(gòu)建流程圖見(jiàn)圖8。I、用限制性內(nèi)切酶Spe I和NheI雙酶切重組質(zhì)粒TALE-1L，回收約1600bp的DNA片段。
2、用限制性內(nèi)切酶NheI酶切pCS2_Fok I載體(PEAS型)，回收約5500bp的載體骨架。3、將步驟I得到的DNA片段和步驟2得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lL (左側(cè)表達(dá)質(zhì)粒)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，對(duì)重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lL進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pCS2-Fok I載體(PEAS型)的NheI酶切位點(diǎn)插入了序列表的序列8所不的雙鏈DNA分子(序列表的序列8所不的DNA分子編碼序列表的序列9所不的蛋白質(zhì)；序列9中的雙連氨基酸分別為第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸 殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基)；重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lL中，在CMV啟動(dòng)子的作用下,表達(dá)序列9所示蛋白質(zhì)與Fok I內(nèi)切酶單體的融合蛋白(命名為融合蛋白-L)，該融合蛋白中，序列9所示蛋白質(zhì)位于N末端。4、用限制性內(nèi)切酶Spe I和NheI雙酶切重組質(zhì)粒TALE-1R，回收約1700bp的DNA片段。5、用限制性內(nèi)切酶NheI酶切pCS2_Fok I載體(PERR型)，回收約5500bp的載體骨架。6、將步驟4得到的DNA片段和步驟5得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lR(右側(cè)表達(dá)質(zhì)粒)。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,對(duì)重組質(zhì)粒pcs2_TALE-peas_lR進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下在pCS2-Fok I載體(PERR型)的NheI酶切位點(diǎn)之間插入了序列表的序列10所不的DNA分子(序列表的序列10所不的DNA分子編碼序列表的序列11所不的蛋白質(zhì)；序列11中的雙連氨基酸分別為第2-3位氨基酸殘基、第36-37位氨基酸殘基、第70-71位氨基酸殘基、第104-105位氨基酸殘基、第138-139位氨基酸殘基、第172-173位氨基酸殘基、第206-207位氨基酸殘基、第240-241位氨基酸殘基、第274-275位氨基酸殘基、第308-309位氨基酸殘基、第342-343位氨基酸殘基、第376-377位氨基酸殘基、第410-411位氨基酸殘基、第444-445位氨基酸殘基、第478-479位氨基酸殘基、第512-513位氨基酸殘基、第546-547位氨基酸殘基)；重組質(zhì)粒pcs2-TALE-peas-lR中，在CMV啟動(dòng)子的作用下，表達(dá)序列11所示蛋白質(zhì)與Fok I內(nèi)切酶單體的融合蛋白(命名為融合蛋白-R)，該融合蛋白中，序列11所示蛋白質(zhì)位于N末端。實(shí)施例4、重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK的應(yīng)用I、細(xì)胞轉(zhuǎn)染將PIEC細(xì)胞(上海復(fù)祥生物科技有限公司，PIEC豬髖動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞)接種至24孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后分成三組，分別進(jìn)行如下處理第一組(測(cè)序組)每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染O. 5ug重組質(zhì)粒pcs2-TALE_peas-lL、0. 5ug重組質(zhì)粒 pcs2-TALE-peas-lR 和 O. 5ug 重組質(zhì)粒 SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN ；第二組(實(shí)驗(yàn)組)每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染O. 5ug重組質(zhì)粒pcs2-TALE_peas-lL、0. 5ug重組質(zhì)粒 pcs2-TALE-peas-lR 和 O. 5ug 重組質(zhì)粒 SSA-hRluc-psiCHECK-MSTN ；第三組(對(duì)照組)每孔細(xì)胞轉(zhuǎn)染O. 5ug重組質(zhì)粒pcs2-TALE_peas-lL、0. 5ug重組質(zhì)粒 pcs2_TALE-peas_lR 和 O. 5ug 重組質(zhì)粒 SSA-hRluc-ps iCHECK。
每個(gè)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用用脂質(zhì)體Lip2000并按說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后進(jìn)行結(jié)果檢測(cè)。第一組提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增MSTN片段后測(cè)序，結(jié)果見(jiàn)圖9，融合蛋白-L和融合蛋白-R能特異識(shí)別MSTN片段，將MSTN片段中兩個(gè)識(shí)別區(qū)域之間和邊緣的核苷酸刪除，并通過(guò)細(xì)胞的自身修復(fù)在刪除區(qū)域發(fā)生突變。第二組和第三組均裂解細(xì)胞并測(cè)定每孔突光值(儀器為L(zhǎng)uminometer, DLReady,型號(hào)是TD-20/20)，并進(jìn)行比較分析。第二組和第三組的結(jié)果見(jiàn)圖10 (F/R，即hF luc蛋白的熒光強(qiáng)度/hRluc蛋白的熒光強(qiáng)度)。結(jié)果表明，在重組質(zhì)粒SSA-hRluc-psiCHECK的多克隆位點(diǎn)插入目的片段，可以作為標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒檢測(cè)TALENs的敲除效率?，F(xiàn)有技術(shù)中，檢測(cè)TALENs敲除效率時(shí)，作為參照的熒光蛋白和用于檢測(cè)TALENs敲除效率的熒光蛋白位于不同質(zhì)粒上，質(zhì)粒的表達(dá)效率不同從而影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性。本發(fā)明中，作為參照的熒光蛋白和用于檢測(cè)TALENs敲除效率的熒光蛋白位于同一質(zhì)粒上，可以避免表達(dá)效率對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，且可以少轉(zhuǎn)染一個(gè)質(zhì)粒，操作更為簡(jiǎn)便。
權(quán)利要求
1.一種質(zhì)粒，包括表達(dá)盒甲和表達(dá)盒乙；所述表達(dá)盒甲包括啟動(dòng)子甲、特異DNA片段甲和終止子甲；所述表達(dá)盒乙包括啟動(dòng)子乙、特異DNA片段乙和終止子乙； 所述特異DNA片段乙為編碼序列表的序列3所示的hFluc蛋白的DNA分子； 所述特異DNA片段甲為如下(a)或(b) Ca)自上游至下游依次包括如下元件hRlucl片段、hRluc2片段、特異DNA片段丙、所述hRluc2片段和hRlu3片段；所述hRlucl片段、所述hRluc2片段和所述hRlu3片段順次連接后編碼序列表的序列4所示的hRluc蛋白；編碼所述hRluc蛋白的起始密碼子位于所述hRlucl片段上；編碼所述hRluc蛋白的終止密碼子位于所述hRlu3片段上； (b)自上游至下游依次包括如下元件hRluc-X片段、特異DNA片段丙、所述hRluc-X片段和hRluc-Y片段；所述hRluc-X片段和所述hRluc-Y片段順次連接后編碼序列表的序列4所示的hRluc蛋白；編碼所述hRluc蛋白的起始密碼子位于所述hRluc-X片段上；編碼所述hRluc蛋白的終止密碼子位于所述hRluc-Y片段上； 所述(a)和/或所述(b)中，所述特異DNA片段丙中具有終止所述特異DNA片段甲連續(xù)編碼的終止密碼子；所述特異DNA片段丙中具有多克隆位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求I所述的質(zhì)粒，其特征在于所述hRluc2片段由300-500個(gè)核苷酸組成。
3.如權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒，其特征在于所述hRluc2片段如序列表的序列2自5’末端第993至1392位核苷酸所示；所述hRlucl片段如序列表的序列2自5’末端第694至992位核苷酸所示；所述hRlu3片段如序列表的序列2自5’末端第1908至2144位核苷酸所示。
4.如權(quán)利要求I至3中任一所述的質(zhì)粒，其特征在于所述特異DNA片段丙如序列表的序列I自5’末端第7至121位核苷酸所示。
5.如權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，其特征在于所述特異DNA片段甲如序列表的序列2自5’末端第694至2144位核苷酸所示。
6.如權(quán)利要求I至5中任一所述的質(zhì)粒，其特征在于所述啟動(dòng)子甲為SV40早期增強(qiáng)子-啟動(dòng)子；所述終止子甲為Synthetic poly (A)。
7.如權(quán)利要求I至6中任一所述的質(zhì)粒，其特征在于所述所述特異DNA片段乙如序列表的序列2自5’末端第3047至4699位核苷酸所不。
8.如權(quán)利要求I至7中任一所述的質(zhì)粒，其特征在于所述啟動(dòng)子乙為單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子；所述終止子乙為SV401ate poly (A)。
9.如權(quán)利要求I至8中任一所述的質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒還包括抗性篩選基因。
10.權(quán)利要求I至9中任一所述的質(zhì)粒在鑒定TALENs的敲除效率中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有雙熒光基團(tuán)的質(zhì)粒及其作為標(biāo)準(zhǔn)品的應(yīng)用。本發(fā)明提供的質(zhì)粒，包括表達(dá)盒甲和表達(dá)盒乙；表達(dá)盒甲包括啟動(dòng)子、特異DNA片段甲和終止子；表達(dá)盒乙包括啟動(dòng)子、特異DNA片段乙和終止子；特異DNA片段乙為編碼序列表的序列3所示的hFluc蛋白的DNA分子；特異DNA片段甲自上游至下游依次包括hRluc1片段、hRluc2片段、特異DNA片段丙、所述hRluc2片段和hRlu3片段；hRluc1片段、hRluc2片段和hRlu3片段順次連接后編碼序列表的序列4所示的hRluc蛋白；特異DNA片段丙中具有終止所述特異DNA片段甲連續(xù)編碼的終止密碼子和多克隆位點(diǎn)。本發(fā)明提供的質(zhì)粒可作為標(biāo)準(zhǔn)品鑒定TALENs的敲除效率，結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102965385SQ20121050994
公開日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月3日
發(fā)明者李奎, 阮進(jìn)學(xué), 李和剛, 劉楠, 吳添文, 牟玉蓮, 楊述林 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所