專利名稱：誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以及利用該培養(yǎng)方法得到的角膜緣干細(xì)胞聯(lián)合脫細(xì)胞羊膜支架構(gòu)建組織工程眼表移植物的方法，屬于組織工程及眼科領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
角膜緣干細(xì)胞是角膜上皮細(xì)胞自我更新、修復(fù)及再生的根本基礎(chǔ)，也是角結(jié)膜之間重要的屏障結(jié)構(gòu)，對(duì)于維持角膜透明性、穩(wěn)定性和正常生理功能的發(fā)揮具有極其重要的作用。嚴(yán)重的眼表疾病，如眼表化學(xué)傷、炎癥、眼表免疫性疾病等，可導(dǎo)致角膜緣干細(xì)胞的缺失及屏障結(jié)構(gòu)的破壞，從而引起一系列的眼表反應(yīng)，角膜上皮反復(fù)缺損、糜爛、潰瘍、新生血
管長(zhǎng)入及假性胬肉形成，最終導(dǎo)致失明。目前角膜緣干細(xì)胞移植供體的嚴(yán)重匱乏和體外培養(yǎng)擴(kuò)增的困難情況，使得眾多患者在痛苦的等待中喪失了治療機(jī)會(huì)而導(dǎo)致終身失明。因此，尋找適合來(lái)源細(xì)胞替代角膜緣干細(xì)胞、改善角膜緣干細(xì)胞缺失對(duì)于損傷后角膜上皮的修復(fù)及穩(wěn)定眼表的重建具有重要的臨床實(shí)踐意義。自1998年Thomson等第一次從胚胎中分離培養(yǎng)出人胚胎干細(xì)胞以來(lái)，胚胎干細(xì)胞因其所具有的強(qiáng)大自我更新能力和分化全能性備受科學(xué)界的關(guān)注，其作為種子細(xì)胞，可修復(fù)受損部位，恢復(fù)機(jī)體功能，為一些難治性疾病的治療提供了新的途徑。因此選擇人胚胎干細(xì)胞作為誘導(dǎo)細(xì)胞的來(lái)源具有得天獨(dú)厚的科研優(yōu)勢(shì)?，F(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)在眼表方面的研究多關(guān)注于終末角膜上皮細(xì)胞。2007年Ahmad S等的研究表明采用角膜緣成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基可誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為表達(dá)角膜上皮特細(xì)胞異性標(biāo)記物CK3/12的細(xì)胞，且在為期21天的分化過程中p63等角膜緣干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)有高峰出現(xiàn)。Ho_a等則發(fā)現(xiàn)利用IV型膠原對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行接觸性誘導(dǎo)可在體外獲得單層類上皮樣細(xì)胞，此細(xì)胞CK12呈陽(yáng)性，而鱗狀上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK14為陰性，且將誘導(dǎo)細(xì)胞移植于角膜損傷小鼠模型上24小時(shí)可見移植細(xì)胞緊密附著于受體角膜基質(zhì)并完全覆蓋損傷表層。但此種誘導(dǎo)方法的成功率僅有不到20%。在國(guó)內(nèi)的研究中，王智崇等通過接觸誘導(dǎo)方法，將大鼠胚胎干細(xì)胞與表層角膜緣基質(zhì)共同培養(yǎng)，使前者在體外分化成為單一形態(tài)的較大細(xì)胞。誘導(dǎo)細(xì)胞在移植于裸鼠皮下后可形成細(xì)胞復(fù)層，電子顯微鏡下可觀察到角膜緣干細(xì)胞的部分形態(tài)學(xué)特征。上述體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在體外模擬的角膜上皮微環(huán)境中胚胎干細(xì)胞具有向角膜上皮細(xì)胞定向分化的潛能。但現(xiàn)有胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化方案誘導(dǎo)效率低下，誘導(dǎo)所得細(xì)胞均為終末分化角膜上皮細(xì)胞，無(wú)正常角膜緣干細(xì)胞的表型及體外分化擴(kuò)增能力，故無(wú)法滿足因角膜緣干細(xì)胞缺乏所致眼表疾病臨床治療的需要。目前國(guó)內(nèi)外尚未見關(guān)于人胚胎干細(xì)胞來(lái)源角膜緣干細(xì)胞有效誘導(dǎo)方法的文獻(xiàn)報(bào)道。綜上所述，本領(lǐng)域迫切需要具有正常角膜緣干細(xì)胞功能的替代種子細(xì)胞來(lái)源，以及利用種子細(xì)胞構(gòu)建的適于移植使用的組織工程化眼表植片。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，為了解決角膜緣干細(xì)胞移植供體嚴(yán)重匱乏的現(xiàn)狀，本發(fā)明建立了一種高效可行的人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的誘導(dǎo)方法，為組織工程角膜上皮構(gòu)建提供種子細(xì)胞。誘導(dǎo)細(xì)胞具有與正常角膜緣干細(xì)胞相似的形態(tài)和表型，及良好的體外分化增殖能力，可體外傳代4代以上；其與脫細(xì)胞羊膜支架材料具有良好的生物相容性；在角膜緣干細(xì)胞失代償動(dòng)物模型中，誘導(dǎo)細(xì)胞移植物可有效修復(fù)損傷角膜上皮，抑制新生血管生成,減少炎癥反應(yīng)及瘢痕生成。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，步驟如下首先，采用DMEM/F12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代角膜緣干 細(xì)胞，制備角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基；然后，利用該角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基聯(lián)合IV型膠原體外培養(yǎng)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞。所述“采用DMEM/F12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代角膜緣干細(xì)胞，制備角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基”的具體方法如下采用DMEM/F12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代角膜緣干細(xì)胞，每日換液；當(dāng)相鄰角膜緣干細(xì)胞克隆團(tuán)開始融合時(shí)，用移液槍吸取培養(yǎng)基上清并通過O. 22 μ m濾器進(jìn)行過濾，即為角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。所述DMEM/F12條件培養(yǎng)基是在普通的DMEM/F12培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加以下物質(zhì)制成的胎牛血清，人表皮生長(zhǎng)因子，氫化可的松，胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛垂體提取物；其中，添加后，胎牛血清占總液體量的10% (在本專利申請(qǐng)中，如無(wú)特別說明，溶液百分比均表示添加物在終溶液中的體積分?jǐn)?shù))，牛垂體提取物占總液體量的O. 2%，人表皮生長(zhǎng)因子的濃度為5ng/ml,氫化可的松的濃度為O. 18 μ g/ml,胰島素的濃度為5 μ g/ml,轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為
5μ g/mlο所述人原代角膜緣干細(xì)胞是通過以下方法制備得到的取角膜環(huán)組織，用含青霉素-鏈霉素的PBS平衡鹽溶液(青霉素和鏈霉素的終末濃度各為100U/ml,下同)沖洗消毒，去除角膜內(nèi)皮及后彈力層，將剩余角膜組織置于2. 4U/ml DispaseII內(nèi)，于37°C 5%C02孵箱內(nèi)孵育90分鐘；用顯微鑷子分離角膜上皮組織；收集分離獲得的角膜上皮組織，于O. 25%胰酶(將O. 25g胰酶溶于PBS平衡鹽溶液，定容至IOOml制備而成)37°C消化10分鐘，即得角膜緣干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，以lX103/cm2的密度接種于經(jīng)絲裂霉素C處理過的3T3細(xì)胞上，即得人原代角膜緣干細(xì)胞。所述“利用該角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基聯(lián)合IV型膠原體外培養(yǎng)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞”的具體方法如下利用角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基聯(lián)合IV型膠原體外模擬角膜緣微環(huán)境，采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞6 12天(優(yōu)選9天)，誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞；其中，I) IV型膠原的使用方式為每直徑35_培養(yǎng)皿內(nèi)添加ImlIV型膠原(終濃度O. 5mg/ml )，包被培養(yǎng)皿2小時(shí)以上，在接種人胚胎干細(xì)胞前吸除包被液體，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基是由75%的角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基和25%的DMEM/F12條件培養(yǎng)基(含胎牛血清等添加劑)所組成的。利用本發(fā)明的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法得到的角膜緣干細(xì)胞，經(jīng)體外光學(xué)顯微鏡觀察、電子顯微鏡觀察、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、免疫熒光、流式細(xì)胞分析及克隆形成率測(cè)定等證實(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞具有與正常角膜緣干細(xì)胞相似的形態(tài)和表型，并表現(xiàn)出良好的體外分化增殖能力，可體外傳代4代以上。本發(fā)明得到的角膜緣干細(xì)胞，可以作為種子細(xì)胞用于制備角膜移植物，具體應(yīng)用時(shí)，方式如下( I)將新鮮人羊膜用含青霉素-鏈霉素的PBS平衡鹽溶液(青霉素和鏈霉素的終末濃度各為100U/ml)沖洗消毒，用O. 25%胰酶37°C消化30分鐘，去除羊膜細(xì)胞，得到脫細(xì)胞羊膜支架材料，用眼科剪于解剖顯微鏡下將脫細(xì)胞羊膜支架材料裁剪為直徑3cm的圓片；(2)用O. 125%胰酶(將O. 125g胰酶溶于PBS平衡鹽溶液，定容至IOOml制備而成)于37°C消化誘導(dǎo)干細(xì)胞(角膜緣干細(xì)胞)5分鐘，制備成單細(xì)胞懸液，然后按I. 5X104個(gè)細(xì)胞/cm2將其接種于裁剪好的脫細(xì)胞羊膜支架材料上(支架材料接種面積約為7cm2，接種總量約為10. 5X105個(gè)細(xì)胞)，體外培養(yǎng)2周，其中，浸沒培養(yǎng)7天，氣液界面培養(yǎng)7天，即可形成具有復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)細(xì)胞移植物。
采用lmol/L純堿燒傷兔角膜40秒，制備兔角膜緣干細(xì)胞失代償模型，燒傷I月后將誘導(dǎo)細(xì)胞植片(本發(fā)明所得到的具有復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)細(xì)胞移植物)移植于損傷眼表，移植3月后誘導(dǎo)細(xì)胞植片可有效修復(fù)損傷眼表，抑制新生血管生成，減少炎癥反應(yīng)及瘢痕生成。本發(fā)明建立了一套高效可行的人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的誘導(dǎo)方案，為組織工程角膜上皮構(gòu)建提供種子細(xì)胞；建立了一種采用誘導(dǎo)細(xì)胞聯(lián)合脫細(xì)胞羊膜支架構(gòu)建組織工程眼表的方法，為組織工程化眼表的構(gòu)建奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。


圖I為人原代角膜緣干細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞的光學(xué)顯微鏡圖片，其中，a :人原代角膜緣干細(xì)胞光學(xué)顯微鏡圖片山誘導(dǎo)細(xì)胞光學(xué)顯微鏡圖片，圖中可見，誘導(dǎo)細(xì)胞排列緊密，呈鋪路石樣，與正常人角膜緣干細(xì)胞形態(tài)相似。圖2為誘導(dǎo)細(xì)胞聯(lián)合脫細(xì)胞羊膜支架材料體外構(gòu)建組織工程眼表移植物HE染色圖片，圖中可見，形成了復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)。圖3為誘導(dǎo)細(xì)胞移植術(shù)前和術(shù)后3月的裂隙燈圖片，其中，a :移植術(shù)前裂隙燈圖片，圖中可見，角膜上皮缺損，大量新生血管張入；b :移植術(shù)后3月裂隙燈圖片，圖中可見，損傷角膜上皮修復(fù)，無(wú)明顯新生血管張入。圖4為誘導(dǎo)細(xì)胞移植術(shù)前和術(shù)后3月的共聚焦顯微鏡圖片，其中，a :移植術(shù)前共聚焦顯微鏡圖片，圖中可見，正常角膜上皮結(jié)構(gòu)破壞，新生血管張入及高反光的瘢痕組織山移植術(shù)后3月裂隙燈圖片，圖中可見，移植細(xì)胞排列緊密，呈鋪路石樣，瘢痕組織范圍局限，未見新生血管。圖5為誘導(dǎo)細(xì)胞聯(lián)合脫細(xì)胞豬角膜支架材料體外構(gòu)建組織工程眼表移植物HE染色圖片，圖中可見，形成了復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例I誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞，并制備角膜移植物將新鮮人羊膜用含100U/ml青霉素-鏈霉素的PBS平衡鹽溶液沖洗消毒后，用O. 25%胰酶于37°C消化30分鐘，移液槍吹打去除羊膜細(xì)胞，得到脫細(xì)胞羊膜支架材料，用眼科剪于解剖顯微鏡下將脫細(xì)胞羊膜支架材料裁剪為直徑3cm的圓片。采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞9天，使其分化為角膜緣干細(xì)胞樣細(xì)胞(如圖Ib所示)，用O. 125%胰酶于37°C消化誘導(dǎo)細(xì)胞5分鐘，制備單細(xì)胞懸液，按I. 5X104個(gè)細(xì)胞/cm2將其接種于裁剪好的脫細(xì)胞羊膜支架材料上(支架材料接種面積約為7cm2，接種總量約為10. 5X105個(gè)細(xì)胞)，體外培養(yǎng)2周，其中，浸沒培養(yǎng)7天，氣液界面培養(yǎng)7天，即可形成具有復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞角膜移植物，如圖2所示。所述“采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞9天，使其分化為角膜緣干細(xì)胞樣細(xì)胞”具體步驟如下利用角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基聯(lián)合IV型膠原體外模擬角膜緣微環(huán)境，采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞9天，誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞；其中，I) IV型膠原的使用方式為每直徑35mm培養(yǎng)皿內(nèi)添加ImlIV型膠原，終濃度O. 5mg/ml，包被培養(yǎng)皿2小時(shí)以上，在接種人胚胎干細(xì)胞前吸除包被液體，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基是由·75%的角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基和25%的DMEM/F12條件培養(yǎng)基所組成的。所述角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基是通過以下方法制備得到的采用DMEM/F12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代角膜緣干細(xì)胞，每日換液；當(dāng)相鄰角膜緣干細(xì)胞克隆團(tuán)開始融合時(shí)，取培養(yǎng)基上清，即為角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基。所述DMEM/F12條件培養(yǎng)基是在普通的DMEM/F12培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加以下物質(zhì)制成的胎牛血清，人表皮生長(zhǎng)因子，氫化可的松，胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛垂體提取物；其中，添加后，胎牛血清占總液體量的10%，牛垂體提取物占總液體量的O. 2%，人表皮生長(zhǎng)因子的濃度為5ng/ml,氫化可的松的濃度為O. 18 μ g/ml,胰島素的濃度為5 μ g/ml,轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為 5 μ g/mlο所述人原代角膜緣干細(xì)胞是通過以下方法制備得到的取角膜環(huán)組織，用含青霉素-鏈霉素的PBS平衡鹽溶液沖洗消毒，去除角膜內(nèi)皮及后彈力層，將剩余角膜組織置于2. 4U/mlDispaseII內(nèi)，于37°C 5%C02孵箱內(nèi)孵育90分鐘；用顯微鑷子分離角膜上皮組織；收集分離獲得的角膜上皮組織，于O. 25%胰酶37°C消化10分鐘，即得角膜緣干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，以lX103/cm2的密度接種于經(jīng)絲裂霉素C處理過的3T3細(xì)胞上，即得人原代角膜緣干細(xì)胞(如圖Ia所示)。實(shí)施例2構(gòu)建的組織工程化眼表修復(fù)化學(xué)損傷角膜上皮將環(huán)形濾紙片于lmol/L純堿內(nèi)浸泡20秒，用無(wú)菌紗布吸去多余液體，置于兔眼表燒灼40秒后，予大量無(wú)菌生理鹽水沖洗眼表，制備兔角膜緣干細(xì)胞失代償模型。燒傷I月后，選擇構(gòu)建成功的兔角膜緣干細(xì)胞失代償模型，顯微鏡下小心去除新生血管纖維膜，清理植床，將誘導(dǎo)細(xì)胞植片(實(shí)施例I制備)置于準(zhǔn)備好的植床上，用10-0尼龍線在植片邊緣進(jìn)行縫合固定。術(shù)后每3日于裂隙燈下觀察植片情況，每I月于共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。移植3月后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行組織學(xué)檢測(cè)，如圖3所示。實(shí)施例3構(gòu)建的組織工程化眼表修復(fù)機(jī)械損傷角膜上皮利用板層刀于顯微鏡下環(huán)形切除兔角膜緣組織，制備兔角膜緣干細(xì)胞失代償模型。手術(shù)損傷I月后，選擇構(gòu)建成功的兔角膜緣干細(xì)胞失代償模型，顯微鏡下小心去除新生血管纖維膜，清理植床，將誘導(dǎo)細(xì)胞植片(實(shí)施例I制備)置于準(zhǔn)備好的植床上，用10-0尼龍線在植片邊緣進(jìn)行縫合固定。術(shù)后每3日于裂隙燈下觀察植片情況，每I月于共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況。移植3月后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物行組織學(xué)檢測(cè)，如圖4所示。實(shí)施例4體外聯(lián)合脫細(xì)胞豬角膜支架構(gòu)建組織工程化前板層收集新鮮豬角，用含青霉素-鏈霉素的平衡鹽溶液沖洗消毒，顯微鏡下將豬角膜處理為直徑10毫米的組織片。將處理的組織片置于O. 5%SDS溶液中于4°C攪拌24小時(shí)，再使用無(wú)菌平衡鹽溶液漂洗組織片8次，每次時(shí)間為2小時(shí)，共計(jì)16小時(shí)，即可獲得脫細(xì)胞豬角膜支架材料。使用O. 125%胰酶消化誘導(dǎo)細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，按I. 5X104個(gè)細(xì)胞/cm2將其接種于脫細(xì)胞豬角膜支架材料上(支架材料接種面積約為O. 8cm2，接種總量約為I. 2X104個(gè)細(xì)胞)體外氣液界面培養(yǎng)2周，其中浸沒培養(yǎng)7天，氣液界面培養(yǎng)7天，可形成具有復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)細(xì)胞移植物，如圖5所示。在實(shí)施例2中，誘導(dǎo)細(xì)胞植片可有效修復(fù)損傷眼表，抑制新生血管生成，減少炎癥
反應(yīng)及瘢痕生成。在實(shí)施例4中，培養(yǎng)2周后，誘導(dǎo)細(xì)胞可在脫細(xì)胞豬角膜支架上形成具有復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)細(xì)胞移植物。以上實(shí)施例表明，本發(fā)明構(gòu)建的誘導(dǎo)分化方法可有效誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞，且誘導(dǎo)移植物在移植動(dòng)物上起到了良好的修復(fù)作用，具有廣闊的開發(fā)前景。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于步驟如下首先，采用DMEM/F12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代角膜緣干細(xì)胞，制備角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基；然后，利用該角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基聯(lián)合IV型膠原體外培養(yǎng)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞； 所述“采用DMEM/F12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代角膜緣干細(xì)胞，制備角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基”的具體方法如下采用DMEM/F12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代角膜緣干細(xì)胞，每日換液；當(dāng)相鄰角膜緣干細(xì)胞克隆團(tuán)開始融合時(shí)，取培養(yǎng)基上清，即為角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基； 所述“利用該角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基聯(lián)合IV型膠原體外培養(yǎng)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞”的具體方法如下利用角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基聯(lián)合IV型膠原體外模擬角膜緣微環(huán)境，采用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞6 12天，誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞；其中，I) IV型膠原的使用方式為每直徑35mm培養(yǎng)皿內(nèi)添加ImlIV型膠原，終濃度0. 5mg/ml，包被培養(yǎng)皿2小時(shí)以上，在接種人胚胎干細(xì)胞前吸除包被液體，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基是由75%的角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基和25%的DMEM/F12條件培養(yǎng)基所組成的。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所述DMEM/F12條件培養(yǎng)基是在普通的DMEM/F12培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加以下物質(zhì)制成的胎牛血清，人表皮生長(zhǎng)因子，氫化可的松，胰島素，轉(zhuǎn)鐵蛋白和牛垂體提取物；其中，添加后，胎牛血清占總液體量的10%，牛垂體提取物占總液體量的0. 2%，人表皮生長(zhǎng)因子的濃度為5ng/ml,氫化可的松的濃度為0. 18 u g/ml,胰島素的濃度為5 y g/ml,轉(zhuǎn)鐵蛋白的濃度為 5 u g/ml o
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于所述人原代角膜緣干細(xì)胞是通過以下方法制備得到的取角膜環(huán)組織，用含青霉素-鏈霉素的PBS平衡鹽溶液沖洗消毒，去除角膜內(nèi)皮及后彈力層，將剩余角膜組織置于2. 4U/mlDispaseII內(nèi)，于37°C 5%C02孵箱內(nèi)孵育90分鐘；用顯微鑷子分離角膜上皮組織；收集分離獲得的角膜上皮組織，于0. 25%胰酶37°C消化10分鐘，即得角膜緣干細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，以lX103/cm2的密度接種于經(jīng)絲裂霉素C處理過的3T3細(xì)胞上，即得人原代角膜緣干細(xì)胞。
4.利用權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法得到的角膜緣干細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4所述的角膜緣干細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于制備角膜移植物的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述用途，其特征在于具體應(yīng)用時(shí)，方式如下 (1)將新鮮人羊膜用含青霉素-鏈霉素的PBS平衡鹽溶液沖洗消毒，用0.25%胰酶37°C消化30分鐘，去除羊膜細(xì)胞，得到脫細(xì)胞羊膜支架材料； (2)用0.125%胰酶于37°C消化角膜緣干細(xì)胞5分鐘，制備成單細(xì)胞懸液，然后將其接種于脫細(xì)胞羊膜支架材料上，體外培養(yǎng)2周，其中，浸沒培養(yǎng)7天，氣液界面培養(yǎng)7天，即可形成具有復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)細(xì)胞移植物。
7.一種角膜移植物，其特征在于是通過以下方法制備得到的 (I)將新鮮人羊膜用含青霉素-鏈霉素的PBS平衡鹽溶液沖洗消毒，用0. 25%胰酶37°C消化30分鐘，去除羊膜細(xì)胞，得到脫細(xì)胞羊膜支架材料；(2)用O. 125%胰酶于37°C消化權(quán)利要求4的角膜緣干細(xì)胞5分鐘，制備 成單細(xì)胞懸液，然后將其接種于脫細(xì)胞羊膜支架材料上，體外培養(yǎng)2周，其中，浸沒培養(yǎng)7天，氣液界面培養(yǎng)7天，即可形成具有復(fù)層上皮樣結(jié)構(gòu)的誘導(dǎo)細(xì)胞移植物，即為角膜移植物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，步驟如下首先，采用DMEM/F12條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人原代角膜緣干細(xì)胞，制備角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基；然后，利用該角膜緣干細(xì)胞條件培養(yǎng)基聯(lián)合IV型膠原體外培養(yǎng)誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞定向分化為角膜緣干細(xì)胞。利用本發(fā)明的方法得到的角膜緣干細(xì)胞，經(jīng)體外光學(xué)顯微鏡觀察、電子顯微鏡觀察、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、免疫熒光、流式細(xì)胞分析及克隆形成率測(cè)定等證實(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞具有與正常角膜緣干細(xì)胞相似的形態(tài)和表型，并表現(xiàn)出良好的體外分化增殖能力，可體外傳代4代以上，可以作為種子細(xì)胞用于制備角膜移植物。
文檔編號(hào)C12N5/074GK102952779SQ201210501228
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年11月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月30日
發(fā)明者吳欣怡, 朱婧, 楊洪玲 申請(qǐng)人:山東大學(xué)