專利名稱：一種增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制功能的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制功能的方法。
技術(shù)背景間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cell,MSC)是中胚層起源的，能夠進(jìn)行自我更新,并具備向成骨、軟骨和脂肪細(xì)胞分化潛能的一種成體干細(xì)胞。因?yàn)镸SC易于分離培養(yǎng)，增殖能力強(qiáng)，免疫原性較低，且來(lái)源廣泛不存在倫理學(xué)問(wèn)題，這使其在細(xì)胞治療方面的應(yīng)用具備了其他干細(xì)胞所沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)。MSC不僅具有低免疫原性，還具有調(diào)節(jié)免疫功能的作用。MSC不僅可以通過(guò)抑制樹突狀細(xì)胞的成熟和抑制T淋巴細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞的免疫功能抑制免疫反應(yīng)，還能分泌多種因子調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)形成免疫抑制。間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制功能使間充質(zhì)干細(xì)胞成為一種良好的生物免疫抑制劑，可以用于器官移植抗排斥反應(yīng)和自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、紅斑狼瘡、硬皮病、膜腎球腎炎、炎性腸病和自身免疫性溶血貧血等。但間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制療法需要較大的細(xì)胞量才能起到作用，回輸大劑量的間充質(zhì)干細(xì)胞可能會(huì)產(chǎn)生急性肺栓塞，肝栓塞，腎栓塞，發(fā)熱，皮疹等副作用，因此如果能提高單個(gè)細(xì)胞 的免疫抑制能力，在較少細(xì)胞量的情況下，間充質(zhì)干細(xì)胞就能起到充分的免疫抑制作用，在提高細(xì)胞治療效力，減少不良副反應(yīng)，降低治療成本等方面具有重要意義
發(fā)明內(nèi)容
為了解決以上間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫抑制能力較低、需要較大的細(xì)胞量才能起作用的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種通過(guò)MSC免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中的關(guān)鍵蛋白的上調(diào)來(lái)增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制功能的方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)的一種增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制功能的方法，將分離的間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)，用含有培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞70%匯合，再更換溶有IFN- Y、IL-I β和黃體酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
所述的方法，優(yōu)選溶有IFN- Y、IL-I β和黃體酮的培養(yǎng)基中含有l(wèi)_600ng/mL的 IFN- Y U-200ng/mL 的 IL-1 β 和 1-100 μ g/mL 的黃體酮。
所述的方法，優(yōu)選溶有IFN-Y、IL-I β和黃體酮的培養(yǎng)基中含有50ng/mL的 IFN- Y、20ng/mL 的 IL-1 β 和 10 μ g/mL 的黃體酮。
所述的方法，優(yōu)選含有培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基中含有EGF l-50ng/mL、FGF l_50ng/mL、 VEGF l-50ng/mL和 PDGF l_50ng/mL。
所述的方法，優(yōu)選含有培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基中含有EGF 2ng/mL、FGF 2ng/mL、VEGF 2ng/mL 和 PDGF 2ng/mL。
所述的方法，優(yōu)選含有培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基和溶有IFN- Y、IL-I β和黃體酮的培養(yǎng)基中均含10% (體積比)的胎牛血清和2mM/mL的谷氨酰胺。
所述的方法，優(yōu)選含有培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基和溶有IFN- Y、IL-I β和黃體酮的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為DMEM/F12。3
所述的方法，優(yōu)選取傳代2-5代的間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)24-48小時(shí)，使其達(dá)到70%匯合。
所述的方法，優(yōu)選間充質(zhì)干細(xì)胞在溶有IFN-Y、IL-I β和黃體酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-5天后，棄培養(yǎng)基，收獲免疫抑制功能增強(qiáng)的間充質(zhì)干細(xì)胞。
所述的方法，優(yōu)選所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人類新生兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
通過(guò)一些細(xì)胞因子和生物分子來(lái)刺激MSC細(xì)胞表面受體，通過(guò)分子通路激活內(nèi)源基因，上調(diào)細(xì)胞免疫抑制蛋白的表達(dá)和免疫抑制活性物質(zhì)的分泌，能達(dá)到增強(qiáng)MSC免疫抑制功能的效果。Y干擾素(IFN- Y )、白介素I β (IL-I β )和黃體酮不僅能增強(qiáng)MSC對(duì)T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的接觸抑制，還可以激活MSC內(nèi)源基因，增加細(xì)胞釋放的免疫抑制活性物質(zhì)。細(xì)胞因子激活是在不影響MSC細(xì)胞內(nèi)在基因構(gòu)成，保證生物安全性的基礎(chǔ)上提高M(jìn)SC免疫抑制功能的最好方法。IFN- Y ,IL-I β和黃體酮三種因子聯(lián)合激活MSC細(xì)胞，對(duì)于活化不同位置的內(nèi)源基因，促進(jìn)多種不同免疫抑制蛋白的分泌起到了強(qiáng)化高效的協(xié)同誘導(dǎo)作用。
Y干擾素等細(xì)胞因子與MSC表面的受體結(jié)合后，通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)染色體上相應(yīng)基因的表達(dá)，上調(diào)細(xì)胞表面蛋白和免疫抑制活性物質(zhì)的分泌，增強(qiáng)MSC 的免疫抑制功能。因子與靶受體結(jié)合，使受體的單鏈形成二聚體，連接受體的JAK蛋白彼此接近并相互磷酸化激活自己。JAK蛋白一旦被激活，就會(huì)磷酸化因子受體的細(xì)胞內(nèi)部分，創(chuàng)建一個(gè)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)STAT蛋白可以?？康膮^(qū)域，STAT—旦與其結(jié)合，它的氨基酸順序上的一個(gè)酪氨酸殘基就被JAK磷酸化，從而STAT蛋白被激活。磷酸化的STAT形成二聚體并從受體上脫離下來(lái)，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核作為轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別特定的DNA序列，上調(diào)免疫抑制蛋白的表達(dá)。
本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明使用多種細(xì)胞因子聯(lián)合激活細(xì)胞表面的受體，活化MSC內(nèi)源基因，上調(diào)免疫抑制蛋白和分泌性因子的產(chǎn)量，不僅可以增強(qiáng)MSC對(duì)免疫系統(tǒng)樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞的接觸抑制，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子的濃度使局部的免疫反應(yīng)進(jìn)一步減弱；(2)Y干擾素等因子副作用小，成本低，激活細(xì)胞受體的效率高，是MSC細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的有效輔助劑；(3)經(jīng)過(guò)IFN-Y ,IL-I β和黃體酮共培養(yǎng)激活后，MSC細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率提高了 2-7倍，MSC細(xì)胞內(nèi)免疫抑制蛋白的表達(dá)提高了 2-12倍，細(xì)胞分泌抗炎因子的能力提高了 5-20倍，分泌促炎因子的能力降低了 10%-30%，MSC細(xì)胞的免疫抑制活性大為增加。


圖I為實(shí)施例I得到的MSC參與混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比圖，圖2為實(shí)施例I得到的MSC免疫抑制蛋白表達(dá)上調(diào)情況圖，圖3為實(shí)施例I得到的MSC分泌抗炎因子和促炎因子的變化情況，圖4為實(shí)施例2得到的MSC參與混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比圖，圖5為實(shí)施例2得到的MSC免疫抑制蛋白表達(dá)上調(diào)情況圖，圖6為實(shí)施例2得到的MSC分泌抗炎因子和促炎因子的變化情況，圖7為實(shí)施例3得到的MSC參與混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖抑制率對(duì)比圖，圖8為實(shí)施例3得到的MSC免疫抑制蛋白表達(dá)上調(diào)情況圖，圖9為實(shí)施例3得到的MSC分泌抗炎因子和促炎因子的變化情況，各圖中的“+因子”代表使用含有IFN-Y、IL-I β、黃體酮為培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)后得到的MSC。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
實(shí)施實(shí)例I :I、增強(qiáng)MSC的免疫抑制功能臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的提取使用經(jīng)產(chǎn)婦同意授權(quán)的新生兒臍帶作為間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源。將新生兒臍帶在含1% 雙抗的生理鹽水中洗滌三次，去除表面的血污，然后剪成約I厘米長(zhǎng)的小段。用眼科剪將臍帶沿血管平行方向縱向剖開，將2根臍動(dòng)脈和I根臍靜脈血管從臍帶中剝離干凈。剩余華通膠部分用含1%雙抗的生理鹽水充分洗滌3次，剪碎至約Imm3大小。
將剪碎的組織塊均勻的平鋪在75cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入5mL培養(yǎng)基，放置在37°C，5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5-10天。培養(yǎng)基成分為DMEM/F12 (Hyclone)中加入10% (體積)FBS (胎牛血清，購(gòu)自 Gibco)、2mM 谷氨酰胺(Sigma)、2ng/mL FGF(R&D)、2ng/m L EGF(R&D)、2ng/ mL VEGF (R&D)和2ng/mL PDGF (R&D)。每隔三天更換一次培養(yǎng)基，細(xì)胞長(zhǎng)滿后傳代培養(yǎng)。
取傳代2-5代的間充質(zhì)干細(xì)胞重鋪于75cm2培養(yǎng)瓶(Corning)中，在與傳代培養(yǎng)時(shí)相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-48小時(shí)至細(xì)胞70%匯合。此時(shí)更換培養(yǎng)基為10% (體積)胎牛血清、2mM/mL 谷氨酰胺、IFN- y (Sigma) 50ng/mL> IL-I β (Sigma) 20ng/mL、黃體酮(Sigma) 10 μ g/mL的DMEM/F12培養(yǎng)基。IFN-Y、IL-I β、黃體酮為培養(yǎng)因子。共培養(yǎng)72小時(shí)后，棄培養(yǎng)基，收獲免疫抑制功能得到增強(qiáng)的MSC。培養(yǎng)同批次MSC細(xì)胞不加IFN- Y、IL-I β和黃體酮作為對(duì)照組。
關(guān)于IFN- Y、IL-I β和黃體酮加入培養(yǎng)基中的方式，可以先將IFN- Y、IL-I β和黃體酮溶解在溶有DMEM/F12 (Hyclone)培養(yǎng)基中，配制成較高的濃度，分裝于滅菌的EP管中，使用時(shí)，再按照終濃度加入。
將收獲的免疫抑制功能得到增強(qiáng)的MSC更換培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基組成為基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12 (Hyclone)中含有10% (體積)胎牛血清(Gibco)和2mM/mL谷氨酰胺 (Sigma),培養(yǎng)后進(jìn)行MSC細(xì)胞的免疫抑制活性檢測(cè)。
2、MSC進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)免疫抑制率取新鮮外周血50mL。利用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，天津?yàn)?分離獲得MNC IXlO8, 將細(xì)胞重懸于50mL含10%胎牛血清，2mM/mL谷氨酰胺的DMEM/F12 (Hyclone)培養(yǎng)基中，加入抗⑶3單抗、抗⑶28單抗各100ng/mL，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。此時(shí)淋巴形成大量細(xì)胞團(tuán)。
培養(yǎng)的MSC細(xì)胞棄培養(yǎng)基后用PBS洗兩遍，用溶有O. 25%胰酶(Sigma)的PBS消化貼壁的MSC細(xì)胞，400g離心10分鐘后取細(xì)胞沉淀用含10%胎牛血清(Gibco)，2mM/mL谷氨酰胺(Sigma)的DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone)重懸。調(diào)整MSC細(xì)胞懸液濃度為2X105/mL，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning)中IOOul/孔。與細(xì)胞因子共培養(yǎng)后的MSC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和不加因子的MSC細(xì)胞對(duì)照組各取3個(gè)復(fù)孔。待孔內(nèi)MSC細(xì)胞貼壁后，加入IOOul培養(yǎng)好的濃度為2 X 106/mL的淋巴細(xì)胞懸液，使MSC細(xì)胞與淋巴細(xì)胞終濃度的比值為1:10.另取3個(gè)復(fù)孔加入200ul濃度為I X IOVmL的淋巴細(xì)胞懸液作為對(duì)照組。將96孔培養(yǎng)板置于37°C， 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6天后，用CCK-8染色淋巴細(xì)胞，于450nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值確定增殖后的淋巴細(xì)胞數(shù)量。利用公式抑制率=(對(duì)照組_實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組計(jì)算MSC細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率。
( I)細(xì)胞因子激活后的MSC與外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)取新鮮外周血50mL。利用淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，天津?yàn)?分離獲得MNC IXlO8, 細(xì)胞重懸于50mL含10%胎牛血清，2mM/mL谷氨酰胺的DMEM/F12 (Hyclone)培養(yǎng)基中，加入抗⑶3單抗、抗⑶28單抗(Sigma)各100ng/mL，于37°C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。此時(shí)淋巴細(xì)胞開始增殖，出現(xiàn)大量細(xì)胞團(tuán)。
調(diào)整MSC細(xì)胞懸液濃度為2X 105/mL，加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中IOOul/孔。與 IFN- Y、IL-I β和黃體酮共培養(yǎng)后的MSC細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組和不加因子的MSC細(xì)胞對(duì)照組各取3 個(gè)復(fù)孔。待孔內(nèi)MSC細(xì)胞貼壁后，加入IOOul培養(yǎng)好的濃度為2X 106/mL的淋巴細(xì)胞懸液， 使MSC細(xì)胞與淋巴細(xì)胞終濃度的比值為1:10.另取3個(gè)復(fù)孔加入200ul濃度為lX106/mL 的淋巴細(xì)胞懸液作為對(duì)照組。將96孔培養(yǎng)板置于37 °C，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4_6天后，用 CCK-8 (上海貝博)染色淋巴細(xì)胞，于450nm波長(zhǎng)下測(cè)量細(xì)胞懸液OD值確定增殖后淋巴細(xì)胞數(shù)量。利用公式抑制率=(對(duì)照組_實(shí)驗(yàn)組)/對(duì)照組計(jì)算MSC細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率。另調(diào)整淋巴細(xì)胞懸液的濃度使MSC細(xì)胞與淋巴細(xì)胞終濃度的比值為1:40，重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖抑制率。IFN- Y ,IL-I β和黃體酮激活后的MSC與MSC對(duì)照組對(duì)淋巴細(xì)胞增殖抑制率的結(jié)果如圖I所示，MSC細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率提高了 2-7倍。
(2)因子激活后的MSC用定量PCR測(cè)定免疫抑制蛋白的表達(dá)細(xì)胞因子與MSC細(xì)胞共培養(yǎng)72小時(shí)后取5Χ IO5細(xì)胞，用總RNA小量制備試劑盒 (Axygen)提取細(xì)胞內(nèi)總RNA,然后用反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒(Thermo Scientific)反轉(zhuǎn)錄 mRNA為cDNA模板,再利用Cyber-green法定量PCR反應(yīng)試劑盒(Promega)配制定量PCR反應(yīng)體系，于實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(mx3000p，Agilent)上測(cè)定MSC細(xì)胞內(nèi)HLA-G、ID01、IL10、 C0X-2、HGF、TGFbl、H0-l、iN0s等免疫抑制蛋白的表達(dá)情況。檢測(cè)表明因子激活后的MSC對(duì)比對(duì)照組，免疫抑制蛋白有不同程度的上調(diào)，如圖2所示，MSC細(xì)胞內(nèi)免疫抑制蛋白的表達(dá)提高了 2-12倍。
(3)因子激活后的MSC用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定抗炎因子和促炎因子的分泌在75cm2培養(yǎng)瓶中加入因子激活培養(yǎng)MSC細(xì)胞72小時(shí)后，更換培養(yǎng)基為不含細(xì)胞因子，含10%胎牛血清，2mM/mL谷氨酰胺的DMEM/F12常規(guī)培養(yǎng)基15mL，培養(yǎng)3_6天。取該條件培養(yǎng)基在500g離心10分鐘后取上清液用ELISA試劑盒(R&D)測(cè)定犬尿氨酸、PGE2、sHLA-G、 IL10、TGF β、HGF, IL4、TNF α、IL6 和 IL12 的含量。未加 IFN- y、IL-I β 和黃體酮培養(yǎng)的 MSC細(xì)胞條件培養(yǎng)基作為對(duì)照組。因子激活后MSC細(xì)胞分泌抗炎因子和促炎因子的變化如圖3所示，細(xì)胞分泌抗炎因子的能力提高了 5-20倍，分泌促炎因子的能力降低了 10%-30%。
綜上所述，經(jīng)過(guò)IFN- Y ,IL-I β和黃體酮共培養(yǎng)激活后，MSC細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率提高了 2-7倍，MSC細(xì)胞內(nèi)免疫抑制蛋白的表達(dá)提高了 2-12倍，細(xì)胞分泌抗炎因子的能力提高了 5-20倍，分泌促炎因子的能力降低了 10-30%，MSC細(xì)胞的免疫抑制活性大為增加。
實(shí)施例2:在實(shí)施例I的基礎(chǔ)上，改變培養(yǎng)基中三種培養(yǎng)因子的濃度為IFN-Y (Sigma) Ing/mL、 IL-I β (Sigma) Ing/mL、黃體酮(Sigma) I μ g/mL,其他操作同實(shí)施例I完全一致。細(xì)胞因子激活后的MSC與外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的效果如圖4，得到的MSC對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率提高了 30%。用定量PCR測(cè)定免疫抑制蛋白的表達(dá)效果如圖5，得到的 MSC細(xì)胞內(nèi)免疫抑制蛋白的表達(dá)提高了 2%-200%。得到的MSC用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定抗炎因子和促炎因子的分泌效果如圖6，細(xì)胞分泌抗炎因子的能力提高了 10%-50%，分泌促炎因子的能力無(wú)顯著變化。
實(shí)施例3 在實(shí)施例I的基礎(chǔ)上，改變培養(yǎng)基中三種培養(yǎng)因子的濃度為IFN-Y (Sigma) 600ng/ mL、IL-I β (Sigma) 200ng/mL、黃體酮(Sigma) 100 μ g/mL,其他操作同實(shí)施例 I 完全一致。 細(xì)胞因子激活后的MSC與外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的效果如圖7，得到的MSC 對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率提高了 25%。用定量PCR測(cè)定免疫抑制蛋白的表達(dá)效果如圖8，得到的MSC細(xì)胞內(nèi)免疫抑制蛋白的表達(dá)提高了 5%-80%。得到的MSC用酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定抗炎因子和促炎因子的分泌效果如圖9，細(xì)胞分泌抗炎因子的能力提高了 15%-50%，分泌促炎因子的能力略微降低。
上述實(shí)施例中使用的DMEM/F12 (Hyclone)培養(yǎng)基，可以替換為其他具有相同功能作用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，如a -MEM, DMEM-LG, DMEM-HG, L-DMEM, IMDM, RPMI-1640等含有平衡鹽溶液、氨基酸、維生素和必要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基，因此在本發(fā)明的方案中，并不僅僅限于 DMEM/F12 (Hyclone)培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制功能的方法，其特征是將分離的間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)，用含有培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞70%匯合，再更換溶有IFN-Y、IL-I β和黃體酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于溶有IFN-Y、IL-1β和黃體酮的培養(yǎng)基中含有 l-600ng/mL 的 IFN- Y、l_200ng/mL 的 IL-1 β 和 1-100 μ g/mL 的黃體酮。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于溶有IFN-Y、IL-1β和黃體酮的培養(yǎng)基中含有 50ng/mL 的 IFN- y、20ng/mL 的 IL-1 β 和 10 μ g/mL 的黃體酮。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于含有培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基中含有EGFl-50ng/mL、FGF l_50ng/mL、VEGF l_50ng/mL 和 PDGF l_50ng/mL。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于含有培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基中含有EGF 2ng/mL、FGF 2ng/mL、VEGF 2ng/mL 和 PDGF 2ng/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于含有培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基和溶有 IFN-y ,IL-I β和黃體酮的培養(yǎng)基中均含10% (體積比)的胎牛血清和2mM/mL的谷氨酰胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于含有培養(yǎng)因子的培養(yǎng)基和溶有 IFN- Y、IL-I β和黃體酮的培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基均為DMEM/F12。
8.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4、6、7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于取傳代2-5代的間充質(zhì)干細(xì)胞，培養(yǎng)24-48小時(shí)，使其達(dá)到70%匯合。
9.根據(jù)權(quán)利要求1、2、4、6、7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于間充質(zhì)干細(xì)胞在溶有 IFN- Y、IL-1 β和黃體酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2-5天后，棄培養(yǎng)基，收獲免疫抑制功能增強(qiáng)的間充質(zhì)干細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人類新生兒臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)胞治療技術(shù)領(lǐng)域間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞免疫抑制功能的方法，將分離的間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，用含有IFN-γ、IL-1β和黃體酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)IFN-γ、IL-1β和黃體酮共培養(yǎng)激活后，MSC細(xì)胞對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率提高了2-7倍，MSC細(xì)胞內(nèi)免疫抑制蛋白的表達(dá)提高了2-12倍，細(xì)胞分泌抗炎因子的能力提高了5-20倍，分泌促炎因子的能力降低了10%-30%，MSC細(xì)胞的免疫抑制活性大為增加。
文檔編號(hào)C12N1/38GK102936578SQ201210449608
公開日2013年2月20日 申請(qǐng)日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者劉小盾, 李棟 申請(qǐng)人:山東省齊魯干細(xì)胞工程有限公司