專利名稱：運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肺炎克雷伯菌的試劑及其擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病原體檢驗(yàn)技術(shù)，具體地說(shuō)是運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)來(lái)檢測(cè)肺炎克雷伯菌的技術(shù)。
背景技術(shù)：
肺炎克雷伯菌為革蘭陰性桿菌，病變中滲出液粘稠而重，致使葉間隙下墜。細(xì)菌具有莢膜，在肺泡內(nèi)生長(zhǎng)繁殖時(shí)，引起組織壞死、液化、形成單個(gè)或多發(fā)性膿腫。病變累及胸膜、心包時(shí)，可引起滲出性或膿性積液。病灶纖維組織增生活躍，易于機(jī)化；纖維素性胸腔積液可早期出現(xiàn)粘連。在院內(nèi)感染的敗血癥中，肺炎克雷伯菌為重要病原菌，病死率較高。 肺炎克雷伯菌(KNP)是臨床分離及醫(yī)院感染的重要致病菌之一，隨著β -內(nèi)酰胺類及氨基糖苷類等廣譜抗菌素的廣泛使用，細(xì)菌易產(chǎn)生超廣譜β_內(nèi)酰胺酶(ESBLs)和頭孢菌素酶(AmpC酶)以及氨基糖苷類修飾酶(AMEs)，對(duì)常用藥物包括第三代頭孢菌素和氨基糖苷類呈現(xiàn)出嚴(yán)重的多重耐藥性。肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染率近期逐年增高，且多耐藥性菌株的不斷增加常導(dǎo)致臨床抗菌藥物治療的失敗和病程遷延。肺炎克雷伯菌耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶、生物被膜的形成、外膜孔蛋白的缺失?？咕幬镏鲃?dòng)外排等，抗菌藥物耐藥基因水平播散是多藥耐藥菌株臨床加劇的重要原因。因此能夠快速有效的檢測(cè)肺炎克雷伯菌對(duì)于與之相關(guān)的疾病防控具有重要的意義。肺炎克雷伯菌的檢測(cè)方法有常規(guī)培養(yǎng)和生理生化反應(yīng)檢測(cè)等多種方法，與傳統(tǒng)檢測(cè)手段相比，本發(fā)明很好的解決了目前大多數(shù)檢測(cè)技術(shù)手段的弊端。首先，無(wú)需任何復(fù)雜的儀器，只需要一臺(tái)簡(jiǎn)單的加熱器，如普通的水浴鍋或以電、電池為能源的加熱器，使得核酸診斷可以前所未有地用于現(xiàn)場(chǎng)診斷。其次，可以加快反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時(shí)間。第三，易于操作者掌握，對(duì)反應(yīng)條件的要求相對(duì)寬松，使得以該技術(shù)為基礎(chǔ)的產(chǎn)品對(duì)操作人員的技能要求不高，這也為核酸試劑的普及創(chuàng)造了條件。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)肺炎克雷伯菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種運(yùn)用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速、便捷、低成本的試劑和檢測(cè)方法。本發(fā)明提供了更加快速和低成本通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增方法檢測(cè)肺炎克雷伯菌的方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的(I)設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸引物用于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)；(2)整合各引物使之不相互干擾。(3)以引物序列組，擴(kuò)增待測(cè)樣品模板，進(jìn)行目的基因的特異性擴(kuò)增；(4)擴(kuò)增完畢后可通過(guò)使用商業(yè)化的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條對(duì)擴(kuò)怎產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)兩條紫紅色條帶，陰性結(jié)果呈現(xiàn)一條紫紅色條帶。
該方法包括應(yīng)用該方法檢測(cè)肺炎克雷伯菌所使用的引物組和與之配套的等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)條件。其中引物序列如下該引物序列參照GenBank 中的序列 AP006725. I Klebsiella pneumoniaesubsp.pneumoniae NTUH-K2044DNA, complete genome中的溶質(zhì)接合蛋白序列為基礎(chǔ)進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物SEQ ID NO. I :5’ -TACGCCCCGGTCTGACSEQ ID NO. 2 :5，-GCGCTTTCACCCCCAACSEQ ID NO. 3 :5’ -GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATTSEQ ID NO. 4:5’ -CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGG
SEQ ID NO. 5 :5，-TGGCAACGACTGGTCTCGCCSEQ ID N0.6 :5， -TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。其中序列SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6使用特殊基團(tuán)標(biāo)記，擴(kuò)增產(chǎn)物中包含上述基團(tuán)，以便同核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條反應(yīng)。本發(fā)明中反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
Bst 酶5U/ μ LI μ L
Bst酶緩沖液-5 μ L
SEQ ID NO. I:lOpmol/L0.2 μ L SEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/L0. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμιηοΙ/L0. 8 μ L
SEQ ID NO. 4ΙΟμηιοΙ/L0. 8 μ L
SEQ ID NO. 5ΙΟμηιοΙ/LI. 5 μ
SEQ ID NO. 6:10 μ mo I/LI. 5 μ L
DNA樣品2pL
雙蒸水7 μ L
總體積20 μ 其中Bs t 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM (NH4) 2S04, IOmM KCl、2mMMgS04、質(zhì)量百分比 0. 1% Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8. 8。等溫?cái)U(kuò)增程序?yàn)?1°C 60分鐘。擴(kuò)增完畢后可通過(guò)使用商業(yè)化的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條對(duì)擴(kuò)怎產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果呈現(xiàn)兩條紫紅色條帶(分別為檢測(cè)線和質(zhì)控線)，陰性結(jié)果呈現(xiàn)一條紫紅色條帶(質(zhì)控線)。
如出現(xiàn)其它結(jié)果則表明此次檢驗(yàn)失敗不能確定樣品中是否存在肺炎克雷伯菌，需重新檢驗(yàn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是相比傳統(tǒng)生理生化檢測(cè)方法，基于等溫?cái)U(kuò)增的鑒定方法適用于直接從臨床樣品中擴(kuò)增靶基因，只需要一次等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)就能夠檢測(cè)肺炎克雷伯菌是否存在，大大提高了效率節(jié)約了時(shí)間。相比較其它PCR方法，本方法制僅需要簡(jiǎn)單的設(shè)備——一個(gè)恒溫水浴即可，大大提高了性價(jià)比節(jié)約了成本。等溫?cái)U(kuò)增方法具有檢測(cè)準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定特異的目的病原體。它通過(guò)擴(kuò)增靶基因，避免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時(shí)間；該鑒定方法不受培養(yǎng)條件和病原體生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準(zhǔn)確。


圖I樣品檢測(cè)結(jié)果，樣品DNA使用核酸恒溫?cái)U(kuò)增肺炎克雷伯菌的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)，擴(kuò)增完畢后可通過(guò)使用商業(yè)化的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條對(duì)擴(kuò)怎產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié) 果呈現(xiàn)兩條紫紅色條帶(分別為檢測(cè)線和質(zhì)控線)，陰性結(jié)果呈現(xiàn)一條紫紅色條帶(質(zhì)控線)，試紙條I為I株肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，試紙條2和3分別為2株肺炎克雷伯菌野生株擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果，試紙條4為陰性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例I樣本1株肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株的細(xì)菌培養(yǎng)物，2株肺炎克雷伯菌野生株的細(xì)菌培養(yǎng)物。I.樣品DNA抽提取Iml樣品培養(yǎng)物，離心得到沉淀物質(zhì)在Iml緩沖液中重懸，加入Iml裂解液，沸水浴10分鐘，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，取上清液置-20°c保存。3.等溫?cái)U(kuò)增體系中反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量
Bst 酶5U/pLΙμΙ
Bst酶緩沖液-5 μι
SEQ ID NO. IΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμηιοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 4ΙΟμιηοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 5ΙΟμηιοΙ/LI. 5 μ
SEQ ID NO. 6:ΙΟμιηοΙ/LI. 5 μ
DNA樣品2 μ L
雙蒸水7 μ L
總體積20 μ L其中Bs t 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質(zhì)量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。等溫?cái)U(kuò)增程序?yàn)?1 °C，60分鐘。等溫?cái)U(kuò)增共進(jìn)行4管檢測(cè)，其中DNA樣品所加入的分別為樣品I為肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株培養(yǎng)物的DNA樣本；樣品2和3為肺炎克雷伯菌野生株培養(yǎng)物的DNA樣本；樣品4為陰性對(duì)照。4.被檢測(cè)樣品結(jié)果觀察擴(kuò)增完畢后通過(guò)使用商業(yè)化的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條對(duì)擴(kuò)怎產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，陰性對(duì)照顯示陰性結(jié)果，肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株和野生株均顯示陽(yáng)性結(jié)果。實(shí)施例2樣本某待測(cè)樣品。I.樣品DNA抽提某樣品懷疑含有肺炎克雷伯菌，取Iml該樣品培養(yǎng)物，離心得到沉淀物質(zhì)在Iml緩沖液中重懸，加入Iml裂解液,沸水浴10分鐘,室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘,離心5分鐘,取上清液置_20°C保存。3.等溫?cái)U(kuò)增體系中反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量
Bst 酶5U/ μ LIpL
Bst酶緩沖液-5 μ L
SEQ ID NO. I:10 μ mol/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμπιοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 410 μ mol/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 5:10 μ mol/LI. 5 μ L
SEQ ID NO. 6:10 μ mol/LI. 5 μ L
DNA樣品2 μ L
雙蒸水7 μ L
總體積20 μ L其中Bst 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質(zhì)量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。等溫?cái)U(kuò)增程序?yàn)?3 °C，60分鐘。 等溫?cái)U(kuò)增共進(jìn)行3管檢測(cè)，其中DNA樣品所加入的分別為樣品I為陰性對(duì)照；樣品2為陽(yáng)性對(duì)照，即含肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株的DNA樣本；樣品3為待測(cè)樣本。4.被檢測(cè)樣品結(jié)果觀察擴(kuò)增完畢后通過(guò)使用商業(yè)化的核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)試紙條對(duì)擴(kuò)怎產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，陰性對(duì)照顯示陰性結(jié)果，肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)株的DNA樣本和待測(cè)樣本的DNA顯示陽(yáng)性結(jié)果。6天后，通過(guò)常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)證明，所檢驗(yàn)的目的樣本中含有肺炎克雷伯菌。核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢驗(yàn)結(jié)果與常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測(cè)結(jié)果一致。以上所述的實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點(diǎn)，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，不能僅以本實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的專利范圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肺炎克雷伯菌的試劑及其擴(kuò)增方法，其特征在于，包括以下六個(gè)引物SEQ ID NO. I :5’ -TACGCCCCGGTCTGACSEQ ID NO. 2 :5’ -GCGCTTTCACCCCCAACSEQ ID NO. 3 :5’ -GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATTSEQ ID NO. 4 :5’ -CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGGSEQ ID NO. 5 :5’ -TGGCAACGACTGGTCTCGCCSEQ ID NO. 6 :5’ -TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肺炎克雷伯菌的試劑及其擴(kuò)增方法，其特征在于，核酸擴(kuò)增反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量 Bst 酶 5U/pLΙμ Bst酶緩沖液 -5μ SEQ ID NO. I ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ L SEQ ID NO. 2 ΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L SEQ ID NO. 3: 10 μ mo I/LO. 8 μ L SEQ ID NO. 4 10 μ mol/LO. 8 μ L SEQ ID NO. 5: 10 μ mol/LI. 5 μ L SEQ ID NO. 6: 10 μ mol/LI. 5 μ L DNA樣品2 μ L 雙蒸水7 μ L總體積20 μ L 其中 Bst 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質(zhì)量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肺炎克雷伯菌的試劑及其擴(kuò)增方法，其特征在于，核酸擴(kuò)增程序?yàn)?1°C，60分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)肺炎克雷伯菌的試劑及其擴(kuò)增方法，設(shè)計(jì)了六個(gè)引物組序列，5’-TACGCCCCGGTCTGAC；5’-GCGCTTTCACCCCCAAC；5’-GTCCCTTTTGCCCGAGGTCGACGGCACGGCCATT；5’-CGACGGCACGGCCATTTGTCCCTTTTGCCCGAGG；5’-TGGCAACGACTGGTCTCGCC；5’-TCGCGTAGGGGGAGGCTGTT。針對(duì)肺炎克雷伯菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點(diǎn)，提供一種運(yùn)用核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速低成本的檢測(cè)方法。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102899419SQ201210448968
公開(kāi)日2013年1月30日 申請(qǐng)日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者張霞, 鄭文杰, 劉偉, 張宏偉, 曲鵬, 吳冬雪, 趙良娟, 劉培, 高旗利 申請(qǐng)人:天津出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心