專利名稱：運用核酸恒溫擴增技術(shù)檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試劑及其擴增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病原體檢驗技術(shù)，具體地說是運用核酸恒溫擴增反應(yīng)來檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的技術(shù)。
背景技術(shù)：
小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，屬于腸桿菌科耶爾森菌屬，是該菌屬三種致病性菌之一。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是一種腸道病原菌，流行病學(xué)特點與假結(jié)核耶爾森菌很相似，感染率高于假結(jié)核耶爾森菌。該菌可在低溫環(huán)境下生存，冰箱貯存食物是現(xiàn)代社會發(fā)生該菌感染的一個重要傳染源。因此能夠快速有效的檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌對于與之相關(guān)的疾病防控具有重要的意義。小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測方法有常規(guī)培養(yǎng)和生理生化反應(yīng)檢測等多種方法，與 傳統(tǒng)檢測手段相比，本發(fā)明很好的解決了目前大多數(shù)檢測技術(shù)手段的弊端。首先，無需任何復(fù)雜的儀器，只需要一臺簡單的加熱器，如普通的水浴鍋或以電、電池為能源的加熱器，使得核酸診斷可以前所未有地用于現(xiàn)場診斷。其次，可以加快反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時間。第三，易于操作者掌握，對反應(yīng)條件的要求相對寬松，使得以該技術(shù)為基礎(chǔ)的產(chǎn)品對操作人員的技能要求不高，這也為核酸試劑的普及創(chuàng)造了條件。

發(fā)明內(nèi)容
針對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供一種運用等溫擴增技術(shù)快速、便捷、低成本的試劑和檢測方法。本發(fā)明提供了更加快速和低成本通過等溫擴增方法檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的(I)設(shè)計特異性寡核苷酸引物用于等溫擴增技術(shù)檢測；(2)整合各引物使之不相互干擾。(3)以引物序列組，擴增待測樣品模板，進行目的基因的特異性擴增；(4)擴增完畢后可通過使用商業(yè)化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產(chǎn)物進行檢測，陽性結(jié)果呈現(xiàn)兩條紫紅色條帶，陰性結(jié)果呈現(xiàn)一條紫紅色條帶。該方法包括應(yīng)用該方法檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌所使用的引物組和與之配套的等溫擴增反應(yīng)條件。其中引物序列如下該引物序列參照GenBank 中的序列 EU29431. I Yersinia enterocoliticasubsp.enterocolitica strain ATCC 9610 中 16S-23S rDNA 基因間序列為基礎(chǔ)進行設(shè)計。引物SEQ ID NO. I :5’ -GAGGTCAGCGGTTCGASEQ ID NO. 2 :5’ -TGTGGCTGCGAACACACTSEQ ID NO. 3 :5’ -GCGTCGTTGTGCAGTTTTTGTACTGCGGTCGCAAG
SEQ ID NO. 4 :5’ -GCGTCGTTGTGCAGTSEQ ID NO. 5 :5’ -ACAGCAACCGGAGTGAAC。其中序列SEQ ID NO. 4和SEQ ID NO. 5使用特殊基團標(biāo)記，擴增產(chǎn)物中包含上述基團，以便同核酸恒溫擴增檢測試紙條反應(yīng)。本發(fā)明中反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
Bst 酶5U/pLIpL
Bst酶緩沖液-5 μι
SEQ ID NO. I10 μ mol/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:ΙΟμιηοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 410 μ mol/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 5:ΙΟμηιοΙ/L2μΙ
DNA樣品2 μ L
雙蒸水8 μ L
總體積20 μ L其中Bst 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質(zhì)量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。等溫擴增程序為63°C 60分鐘。擴增完畢后可通過使用商業(yè)化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產(chǎn)物進行檢測，陽性結(jié)果呈現(xiàn)兩條紫紅色條帶(分別為檢測線和質(zhì)控線)，陰性結(jié)果呈現(xiàn)一條紫紅色條帶(質(zhì)控線)。如出現(xiàn)其它結(jié)果則表明此次檢驗失敗不能確定樣品中是否存在小腸結(jié)腸炎耶爾森囷，需重新檢驗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是相比傳統(tǒng)生理生化檢測方法，基于等溫擴增的鑒定方法適用于直接從臨床樣品中擴增靶基因，只需要一次等溫擴增反應(yīng)就能夠檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌是否存在，大大提高了效率節(jié)約了時間。相比較其它PCR方法，本方法制僅需要簡單的設(shè)備——一個恒溫水浴即可，大大提高了性價比節(jié)約了成本。等溫擴增方法具有檢測準確、特異性強、靈敏度高的特點，可以快速、準確地鑒定特異的目的病原體。它通過擴增靶基因，避免了反復(fù)培養(yǎng)，節(jié)約時間；該鑒定方法不受培養(yǎng)條件和病原體生理狀態(tài)的影響，較生理生化鑒定方法更為準確。


圖I樣品檢測結(jié)果，樣品DNA使用核酸恒溫擴增小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的檢測技術(shù)檢測，擴增完畢后可通過使用商業(yè)化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產(chǎn)物進行檢測，陽性結(jié)果呈現(xiàn)兩條紫紅色條帶(分別為檢測線和質(zhì)控線)，陰性結(jié)果呈現(xiàn)一條紫紅色條帶(質(zhì)控線)，試紙條I為陰性對照，試紙條2為I株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準株擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果，試紙條3和4分別為2株小 腸結(jié)腸炎耶爾森菌野生株擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖與具體實施方式
對本發(fā)明作進一步詳細描述。實施例I樣本1株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準株的細菌培養(yǎng)物，2株小腸結(jié)腸炎耶爾森菌野生株的細菌培養(yǎng)物。I.樣品DNA抽提取Iml樣品培養(yǎng)物，離心得到沉淀物質(zhì)在Iml緩沖液中重懸，加入Iml裂解液，沸水浴10分鐘，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，取上清液置-20°c保存。3.等溫擴增體系中反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
Bst 酶5υ/μ Ιμ
Bst酶緩沖液-5pL
SEQ ID NO. I:10 μ mol/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμπιοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:10 μ mol/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 410 μ mol/L0.8 μ L
SEQ ID NO. 5:10 μ mol/L2 μ
DNA樣品2 μ L
雙蒸水8 μ L
總體積20 μ 其中Bst 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質(zhì)量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。等溫擴增程序為63 °C，60分鐘。等溫擴增共進行4管檢測，其中DNA樣品所加入的分別為樣品I為陰性對照；
樣品2為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準株培養(yǎng)物的DNA樣本；樣品3和4為小腸結(jié)腸炎耶爾森菌野生株培養(yǎng)物的DNA樣本。4.被檢測樣品結(jié)果觀察擴增完畢后通過使用商業(yè)化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產(chǎn)物進行檢測，陰性對照顯示陰性結(jié)果，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準株和野生株均顯示陽性結(jié)果。實施例2樣本某待測樣品。I.樣品DNA抽提某樣品懷疑含有小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，取Iml該樣品培養(yǎng)物，離心得到沉淀物質(zhì)·在Iml緩沖液中重懸，加入Iml裂解液，沸水浴10分鐘，室溫下10000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，取上清液置_20°C保存。3.等溫擴增體系中反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下
成分濃度加樣量
Bst 酶5U/ μ LIpL
Bst酶緩沖液-5μ
SEQ ID NO. I:ΙΟμιηοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 2ΙΟμηιοΙ/LO. 2 μ L
SEQ ID NO. 3:10 μ mol/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 4ΙΟμιηοΙ/LO. 8 μ L
SEQ ID NO. 5:ΙΟμηιοΙ/L2 μι
DNA樣品2 μ L
雙蒸水8 μ L
總體積20 μ L其中Bst 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質(zhì)量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。等溫擴增程序為63 °C，60分鐘。等溫擴增共進行3管檢測，其中DNA樣品所加入的分別為樣品I為陰性對照；樣品2為陽性對照，即含小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準株的DNA樣本；樣品3為待測樣本。4.被檢測樣品結(jié)果觀察擴增完畢后通過使用商業(yè)化的核酸恒溫擴增檢測試紙條對擴怎產(chǎn)物進行檢測，陰性對照顯示陰性結(jié)果，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌標(biāo)準株的DNA樣本和待測樣本的DNA顯示陽性結(jié)果。6天后，通過常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測證明，所檢驗的目的樣本中含有小腸結(jié)腸炎耶爾森菌。核酸恒溫擴增檢驗結(jié)果與常規(guī)微生物培養(yǎng)和生化檢測結(jié)果一致。
以上所述的實施例僅用于說明本發(fā)明的技術(shù)思想及特點，其目的在于使本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，不能僅以本實施例來限定本發(fā)明的專利范圍，即凡本發(fā)明所揭示的精神所作的同等變化或修飾，仍落在本發(fā)明的專利范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種運用核酸恒溫擴增技術(shù)檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試劑及其擴增方法，其特征在于，包括以下五個引物SEQ ID NO. I :5’ -GAGGTCAGCGGTTCGASEQ ID NO. 2 :5’ -TGTGGCTGCGAACACACTSEQ ID NO. 3 :5’ -GCGTCGTTGTGCAGTTTTTGTACTGCGGTCGCAAGSEQ ID NO. 4 :5’ -GCGTCGTTGTGCAGTSEQ ID NO. 5 :5’ -ACAGCAACCGGAGTGAAC。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種運用核酸恒溫擴增技術(shù)檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試劑及其擴增方法，其特征在于，核酸擴增反應(yīng)體系中各組分構(gòu)成比例如下成分濃度加樣量Bst 酶5U/ μ LI μ LBst酶緩沖液-5pLSEQ ID NO. I:ΙΟμιηοΙ/L0.2μΙSEQ ID NO. 2:10 μ mol/LO. 2 μ LSEQ ID NO. 3:10 μ mol/LO. 8 μ LSEQ ID NO. 4ΙΟμιηοΙ/LO. 8 μ LSEQ ID NO.510 μ mol/L2 μ LDNA樣品2 μ L雙蒸水8 μ L思體積20 μ L 其中 Bst 酶緩沖液的成分為 20mM Tris-HCl, IOmM(NH4) 2S04, IOmM KCl、2mM MgS04、質(zhì)量百分比 0· I % Triton X-IOOUOmM dNTP，且 pH 為 8· 8。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種運用核酸恒溫擴增技術(shù)檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試劑及其擴增方法，其特征在于，核酸擴增程序為63°C，60分鐘。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種運用核酸恒溫擴增技術(shù)檢測小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試劑及其擴增方法，設(shè)計了五個引物組序列，5’-GAGGTCAGCGGTTCGA；5’-TGTGGCTGCGAACACACT；5’-GCGTCGTTGTGCAGTTTTTGTACTGCGGTCGCAAG；5’-GCGTCGTTGTGCAGT；5’-ACAGCAACCGGAGTGAAC。針對小腸結(jié)腸炎耶爾森菌，本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，提供一種運用核酸恒溫擴增技術(shù)快速低成本的檢測方法。
文檔編號C12Q1/04GK102899420SQ20121044899
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月12日
發(fā)明者張霞, 鄭文杰, 趙良娟, 吳冬雪, 曲鵬, 張宏偉, 劉培, 高旗利 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心