專利名稱：一種模擬重組無痕克隆方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種模擬重組無痕克隆方法。
背景技術：
利用引物5’末端加酶切位點及其保護堿基，PCR擴增目的基因片段，酶切后再連接入特定載體中，已成為經典的克隆方法。這種方法也存在著一些問題:當載體上的酶切位點與目的基因片段有沖突時，往往要改造載體；當目的基因GC含量高或具有穩(wěn)定的二級結構時，我們常常難以獲得足量的PCR擴增產物；此外，當目的基因片段很長時，容易導致擴增效率低、突變率高的問題。Fu J.等人(2012)發(fā)明了一種利用全長RecE、RecT、Redy及RecA等重組酶在大腸桿菌體內實現(xiàn)了對大片段DNA間進行重組的方法(Fu J,Bian X, Hu S，Wang H, Huang F，Seibert PM, Plaza A, Xia L, Miiller R, StewartAF, Zhang Y.Full-length RecE enhances linear-linear homologous recombinationand facilitates direct cloning for bioprospecting.Nat Biotechnol.2012May ;30(5):440-6.)，然而這種方法所依賴重組酶同時具有使目的基因內部產生非特異性重組的風險。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種用λ Exonuclease和Τ4 DNA聚合酶體外模擬大腸桿菌體內重組的方法。本發(fā)明采用的技術方案是:一種模擬重組無痕克隆方法，所述方法包括:( I)載體DNA制備:以克隆載體質粒為模板，按常規(guī)方法以目的基因插入位點兩端的序列為結合位點設計引物，然后在引物5’端分別加上與目的基因匹配的長度為20 30bp (優(yōu)選25bp)的序列，最終所得上游引物記為primerl,下游引物記為primer2,以primerl和primer2為引物進行PCR擴增獲得載體DNA ；(2)目的基因制備:按常規(guī)方法進行酶切獲得包含目的基因的片段；或者按常規(guī)方法針對目的基因設計擴增引物，所得引物以含有目的基因的DNA為模板進行PCR擴增，得到包含目的基因的片段；(3)基因重組:將步驟(I)載體DNA和步驟(2)所得片段混合，先加入入Exonuclease, 37°C反應 30 min，72°C溫浴 5min , 50°C溫浴 30min,然后溫度降至 37°C,力口入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37°C反應15 min，獲得重組DNA。

本發(fā)明原理參見圖1。λ Exonuclease (Lambda exonuclease)具有依賴于5’憐酸基團的5’一 3’外切核酸酶活性，T4 DNA聚合酶具有3’一 5’外切核酸酶活性及5’一 3’聚合酶活性。如圖1C所不,利用T4 polynucleotide kinase (T4 PNK)憐酸化DNA,使λExonuclease對雙鏈DNA的末端起外切核酸酶的作用而形成單鏈區(qū),若載體末端和目的基因內部具有匹配區(qū)域(overlap,圖1中分別用EZZ3和KSSS表示)，單鏈區(qū)域就能夠根據(jù)堿基互補配對的原則特異性退火。退火后的產物經T4 DNA聚合酶的3’一 5’外切核酸酶活性及5’ 一 3’聚合酶活性作用后，形成具有切刻(Nick)的環(huán)狀雙鏈DNA。轉化入細菌后，就能完成目的基因到目的載體的克隆。利用這種方法克隆目的基因時，目的基因的兩端可以有多余的DNA序列(圖1A)。這種方法要求設計載體引物時，在引物的5’末端要分別增加與目的基因序列相同的一段DNA堿基(圖1B)，該序列相同區(qū)域不必對應于目的基因的末端(圖1中分別用wm和表示)。以Lambda DNA中4kb的目的片段為例，具體的，所述方法如下:(I)載體DNA制備:以克隆載體pBlueScript II KS (_)質粒為模板，以引物MR4kbPl和MR4kbP2進行PCR擴增，得到載體DNA ；引物MR4kbPl序列如下:5’ -GCATAGGCGGGTTCAAGCATCAGCGATCGAATTCCTGCAGCC-3’ ；引物MR4kbP2序列如下:5’ -CTGGGCTATGCGCTGCAGCATCAACATCAAGCTTATCGATACCG-3’ ；(2)目的基因制備:以Lambda DNA為模板，用引物MR4kbPF和MR4kbPR進行PCR擴增，得到目的基因； 引物MR4kbPF 序列如下:5’ - AGGAGGAGAAGAGTGACAGCA -3’ ；引物MR4kbPR 序列如下:5’ - GTCATGCTTCTCCAGTGCATC -3’ ；(3)基因重組:將步驟(I)載體DNA和步驟(2)所得片段混合，先加入入Exonuclease, 37°C反應 30 min，72°C溫浴 5min , 50°C溫浴 30min,然后溫度降至 37°C,力口入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37°C反應15 min，獲得重組DNA。具體的，所述目的基因為SoxlO基因的編碼區(qū)(0RF)，所述方法如下: (I)載體DNA制備:以pGEX-4T-l載體質粒為模板，以引物SoxlO-pGEX-Pl和SoxlO-pGEX-P2進行PCR擴增，得到載體DNA ；弓丨物SoxlO-pGEX-Pl序列如下:5’ - AGGTCTTGTTCCTCGGCCATGAATTCCGGGGATCCACGC -3’ ；引物SoxlO-pGEX_P2 序列如下:5’ - CGACTCTATCCCGACCTTAGCTCGAGCGGCCGCATCGTG -3’ ；(2)目的基因制備:包含SoxlO ORF的pBlueScript II KS(_)質粒用內切酶EcoR1-HF和XhoI進行酶切(37°C，4h)，獲得SoxlO ORF酶切片段；(3)基因重組:將步驟(I)載體DNA和步驟(2)所得片段混合，先加入入Exonuclease, 37°C反應 30 min，72°C溫浴 5min , 50°C溫浴 30min,然后溫度降至 37°C,力口入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37°C反應15 min，獲得重組DNA。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在:(1)不需要經PCR擴增目的基因，減少了 PCR引起的突變；(2)可以從DNA混合物中特異性地克隆目的片段；(3)不留酶切位點的痕跡。


圖1為本發(fā)明原理和流程圖；圖2為Lambda DNA的一段Alu I酶切序列；克隆位點距離各自的最近末端均為約400 bp,分別用EZ3和ISSS表示。
圖3為插入片段檢測結果；泳道1-7為7個隨機挑選的白色菌落用PCR檢測插入片段，其中泳道3、5和6所代表的細菌克隆經測序鑒定為含目的DNA片段的克隆；M，IOkbmarker。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此:實施例1:1.1、檢測模擬重組無痕克隆的效率。首先利用模擬重組無痕克隆方法從Lambda DNA的144個Alu I酶切片段中克隆一段(圖2)來檢測效率。1.1.1、目的DNA片段的制備。在40 μ I IXNEB Buffer (New England Biolabs)中，將 2yg Lambda DNA(Sangon)用 20U 的 AluI 內切酶(New England Biolabs)在 37°C 反應 4h,使 Lambda DNA被徹底酶切。接著加熱到70°C并溫浴IOmin使內切酶失活，所得產物為終濃度50ng/μ I的Lambda DNA酶切產物。表1:檢測模擬重組無痕克隆效率所用引物
權利要求
1.一種模擬重組無痕克隆方法，所述方法包括:(1)載體DNA制備:以克隆載體質粒為模板，以目的基因插入位點兩端的序列為結合位點設計引物，并在引物5’端分別加上與目的基因匹配的長度為2(T30bp的序列，所得上游引物記為primerl,下游引物記為primer2,以primerl和primer2為引物進行PCR擴增獲得載體DNA ；(2)目的基因制備:經酶切或擴增獲得包含目的基因的片段；(3)基因重組:將步驟(I)載體DNA和步驟(2)所得片段混合,先加入λExonuclease,37°C反應30 min，72°C溫浴5min，50°C溫浴30min，然后溫度降至37°C，加入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37°C反應15 min，獲得重組DNA。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述目的基因為SoxlO基因的編碼區(qū)，所述方法如下:(1)載體DNA制備:以pGEX-4T-l載體質粒為模板，以引物SoxlO-pGEX-Pl和SoxlO-pGEX-P2進行PCR擴增，得到載體DNA ；引物SoxlO-pGEX-Pl序列如下:5’ - AGGTCTTGTTCCTCGGCCATGAATTCCGGGGATCCACGC -3’ ；引物SoxlO-pGEX-P2序列如下:5’ - CGACTCTATCCCGACCTTAGCTCGAGCGGCCGCATCGTG -3’ ；(2)目的基因制備:包含SoxlOORF的pBlueScript II KS (-)質粒用內切酶EcoR1-HF和XhoI進行酶切，獲得SoxlO ORF酶切片段；(3)基因重組:將步驟(I)載體DNA和步驟(2)所得片段混合,先加入λExonuclease,37°C反應30 min，72°C溫浴 5min，50°C溫浴30min，然后溫度降至37°C，加入T4 DNA聚合酶和dNTPs，37°C反應15 min，獲得重組DNA。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種模擬重組無痕克隆方法，所述方法是設計載體引物時，在引物的5’末端要分別增加與目的基因序列相同的一段DNA堿基，所得載體DNA末端和目的基因內部具有匹配區(qū)域，再將載體DNA和目的基因混合，先后用λ Exonuclease和T4 DNA聚合酶處理，獲得重組DNA。本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在(1)不需要經PCR擴增目的基因，減少了PCR引起的突變；(2)可以從DNA混合物中特異性地克隆目的片段；(3)不留酶切位點的痕跡。
文檔編號C12N15/70GK103074358SQ201210444589
公開日2013年5月1日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權日2012年11月8日
發(fā)明者戴忠敏, 齊瀛川, 孫淑慧, 邱猛生 申請人:杭州師范大學