專利名稱：：獨(dú)特型疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用重組克隆型免疫球蛋白(Ig)作為疫苗來治療HCV相關(guān)性和非HCV相關(guān)性淋巴組織增生。具體地，本發(fā)明提供由來自患有淋巴組織增生的患者的Ig輕鏈的蛋白質(zhì)節(jié)段VK3-20和VK3-15而衍生出的具有免疫原性的重組蛋白質(zhì)的用途。
背景技術(shù)：
：丙型肝炎是由特定病毒(丙型肝炎病毒，HCV)引起的肝炎類型。在許多病例中，急性丙型肝炎沒有癥狀并轉(zhuǎn)為慢性，對肝臟造成長期損害，例如導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌。丙型肝炎可引起的其他相關(guān)癥狀例如為甲狀腺炎、冷球蛋白血癥和某些類型的腎小球性腎炎。術(shù)語"冷球蛋白血癥"具體指的是血清中存在一或多種如下免疫球蛋白(Ig)，所述免疫球蛋白在低于37t:時(shí)發(fā)生沉淀，而在再次加熱后可再溶解。冷球蛋白血癥通常分為3個(gè)亞組單純型冷球蛋白血癥(1型)，其特征在于存在單克隆Ig，l型通常與血液系統(tǒng)疾病相關(guān)，且經(jīng)常是無癥狀的；混合型冷球蛋白血癥或MC(2型和3型)，特征在于存在循環(huán)免疫復(fù)合物，所述免疫復(fù)合物由作為自身抗原的多克隆IgG和作為相應(yīng)的自身抗體的單克隆IgM(2型)或多克隆IgM(3型)組成。MC可繼發(fā)于多種感染或免疫??；當(dāng)分離的MC代表一種獨(dú)立的疾病時(shí)，稱為"原發(fā)性"MC。鑒于其與HCV感染的驚人關(guān)聯(lián)性(>90%)，術(shù)語"預(yù)防性"現(xiàn)在僅涉及MC患者的少數(shù)(<5%)。HCV可感染淋巴組織，并可觸發(fā)單-多克隆B淋巴細(xì)胞增生，產(chǎn)生不同的自身抗體，包括冷球蛋白。MC綜合征是全身性血管炎，其繼發(fā)于循環(huán)免疫復(fù)合物和補(bǔ)體在小血管的沉淀。其臨床特征為累及補(bǔ)體器官紫癜、皮膚潰瘍、肝炎、腎小球腎炎、周圍神經(jīng)病和/或彌漫性血管炎。一些患者可出現(xiàn)惡性腫瘤，這通常是晚期并發(fā)癥，特別是B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(10%)、肝細(xì)胞癌(<5%)、或甲狀腺癌(<1%)。MC的一線治療應(yīng)該是通過干擾素和利巴韋林來清除HCV;但是，這一治療通常無法清除病毒，并可并發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)(腎病、甲狀腺炎等等)。應(yīng)該根據(jù)患者臨床表現(xiàn)的活動(dòng)度和嚴(yán)重程度為每一個(gè)患者制定病因?qū)W治療(血漿置換、免疫抑制劑和/或腎上腺皮質(zhì)激素類)。使用干擾素治療HCV相關(guān)性冷球蛋白血癥綜合征是基于這樣的假設(shè)，即B-淋巴細(xì)胞增生是病毒依賴性的，且由此對降低病毒負(fù)荷具有潛在地反應(yīng)性；因此，其并不是以治療淋巴組織增生為直接目的的治療。使用干擾素或聚乙二醇化干擾素(適合于增加藥物的血漿半衰期)治療也伴有毒性和不良反應(yīng)，例如易激惹、情緒不穩(wěn)定、抑郁狀態(tài)、睡眠障礙、恐懼、躁狂、認(rèn)知(記憶、注意力)障礙、錯(cuò)亂狀態(tài)。因此，有必要尋找用于治療在此所述的淋巴組織增生的替代性預(yù)防和/或治療手段。已經(jīng)使用獨(dú)特型Ig進(jìn)行免疫接種來治療B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)，不過，由于為每個(gè)患者產(chǎn)生獨(dú)特型Ig具有顯著的復(fù)雜性且成本高昂，嚴(yán)重限制了在大對象群體中應(yīng)用這一免疫接種策略。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為淋巴組織增生性疾病提供新的疫苗，該疫苗克服了迄今所采用的技術(shù)的局限性和不便利之處，并可用于大數(shù)量的患者群體。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供鑒定、分離和評(píng)價(jià)那些適合用于制備所述疫苗的蛋白質(zhì)節(jié)段的免疫原性的方法。還一個(gè)目的是提供制備組成所述疫苗的蛋白質(zhì)節(jié)段的方法。優(yōu)選實(shí)施方式描述通過使用克隆型重組免疫原性節(jié)段治療HCV相關(guān)性和非HCV相關(guān)性淋巴組織增生可實(shí)現(xiàn)這些和其他目標(biāo)。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及疫苗，所述疫苗包含選自VK3-20和VK3-15中的至少一種重組免疫原性蛋白質(zhì)節(jié)段，其用于治療和/或預(yù)防淋巴組織增生性疾病。在另一方面，本發(fā)明涉及選自VK3-20、VK3-15以及它們的混合物中的重組免疫原性蛋白質(zhì)節(jié)段的用途。對于本發(fā)明的用途，選自VK3-20、VK3-15以及它們的混合物中的一或多種重組免疫原性蛋白質(zhì)節(jié)段可選地與另一種蛋白質(zhì)部分或試劑組合，用于制備用于治療和/或預(yù)防淋巴組織增生性疾病的疫苗。在另一方面，本發(fā)明涉及包含重組免疫原性蛋白質(zhì)節(jié)段VK3-20和VK3-15的疫苗在制備用于淋巴組織增生性疾病的藥物中的用途。具體地，術(shù)語"重組免疫原性蛋白質(zhì)節(jié)段"指的是通過重組DNA技術(shù)獲得的、并具有免疫原性活性(即能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答)的蛋白質(zhì)部分。術(shù)語VK3-20和VK3-15指的是IgK型輕鏈的可變區(qū)。VK3-20和VK3-15的編碼基因的核苷酸序列見于NCBI數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為對于VK3-20為AF303897/AAG33824，而對于VK3-15為AAU14891/AY704914。在另一方面，本發(fā)明涉及重組克隆型節(jié)段VK3-20和VK3-15的分離、表征、生產(chǎn)和純化。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，用于生產(chǎn)、實(shí)施和純化重組克隆型節(jié)段VK3-20和VK3-15的方法包括以下步驟1)將編碼所述蛋白質(zhì)的核苷酸序列插入合適的表達(dá)載體；2)接種至合適的培養(yǎng)基中；3)根據(jù)已知技術(shù)進(jìn)行發(fā)酵；禾口4)純化所述片段。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，所述生產(chǎn)方法的特征在于根據(jù)以下步驟(l')至(4')進(jìn)行步驟(1)至(4)的至少兩個(gè)步驟1')將所述序列插入表達(dá)載體pET26b，以形成重組菌株pET26b/VK3-20/VK3-15;2')以1%的體積比接種細(xì)菌測試樣品；3')使用以磷酸鹽緩沖液緩沖并加入葡萄糖或異丙硫半乳糖苷(IPTG)的培養(yǎng)基SB進(jìn)行發(fā)酵；4')通過離子交換層析純化。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"pET26b/VK3-20/VK3-15"指的是工程化的表達(dá)載體pET26b，其可選地含有編碼兩種重組獨(dú)特型蛋白鏈VK3-20和VK3-15中之一的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明，可選地使用針對VK區(qū)域的單克隆抗體(mAb)進(jìn)行重組獨(dú)特型蛋白鏈VK3-20和VK3-15的節(jié)段的鑒定和定量。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語mAb指的是由細(xì)胞克隆(雜交瘤)產(chǎn)生的均質(zhì)性抗體群體，所述細(xì)胞克隆通過將免疫生產(chǎn)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞(通常是惡性骨髓瘤細(xì)胞)融合而獲得，其僅對免疫原性抗原的一個(gè)表位具有特異性。根據(jù)一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式，本發(fā)明的方法包括全部步驟(l')至(4')。與已知的方法相比，本發(fā)明的改進(jìn)并優(yōu)化的方法具有多種優(yōu)勢，事實(shí)上其能夠-加快重組細(xì)菌培養(yǎng)物的生長并使得其生物量增加多達(dá)50%;-提高方法的產(chǎn)率；-降低生產(chǎn)時(shí)間和成本；禾口-根據(jù)生產(chǎn)和質(zhì)量管理規(guī)范(GMP)進(jìn)行簡化、再生產(chǎn)和擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，發(fā)酵細(xì)菌菌株可以是在37t:培養(yǎng)8-12小時(shí)，例如過夜。還根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，從培養(yǎng)基或從細(xì)菌周質(zhì)空間純化所述重組的獨(dú)特型蛋白質(zhì)鏈包括在離子交換柱例如QS印haroseFF(Amersham-GE)和SS印haroseFF(Amersham-GE)上進(jìn)行的步驟。本申請?jiān)趯?shí)驗(yàn)部分給出了本發(fā)明方法的詳細(xì)描述。如本申請說明書實(shí)驗(yàn)部分實(shí)施例5所示，已經(jīng)觀察到重組免疫原性節(jié)段VK3-20能夠識(shí)別22種免疫原性表位。在另一方面，本發(fā)明涉及能夠識(shí)別由蛋白質(zhì)節(jié)段VK3-20所識(shí)別的這22種免疫原性表位中的至少一種表位的任何蛋白質(zhì)節(jié)段，其優(yōu)選地識(shí)別一種以上表位，其有利地識(shí)別所有22種表位。本發(fā)明的疫苗用于HCV相關(guān)性和非HCV相關(guān)性淋巴組織增生。事實(shí)上已經(jīng)觀察到，由衍生自HCV相關(guān)性淋巴瘤的原型輕鏈VK3-20剌激產(chǎn)生的細(xì)胞毒反應(yīng)表現(xiàn)出顯著的交叉反應(yīng)性，甚至對由同一基因編碼但來自不同患者的獨(dú)特型VK蛋白也是如此，正因如此，本發(fā)明所制備的疫苗可有效地施用于大量代表性患者群體，以治療和/或預(yù)防淋巴組織增生性疾病。因此，也可治療非HCV相關(guān)性淋巴組織增生。例如濾泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)、粘膜相關(guān)性淋巴組織(MALT)的淋巴瘤以及自身免疫病(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征)相關(guān)性淋巴瘤。對于其治療和/或預(yù)防，本發(fā)明的疫苗優(yōu)選地以合適的藥物組合物來施用。本發(fā)明還涉及以下任何蛋白質(zhì)節(jié)段在制備用于治療和/或預(yù)防HCV相關(guān)性和非HCV相關(guān)性淋巴組織增生的疫苗中的用途，所述蛋白質(zhì)節(jié)段能夠識(shí)別由蛋白質(zhì)節(jié)段VK3-20所識(shí)別的22種免疫原性表位中的至少一種表位，其優(yōu)選地識(shí)別一種以上表位，其有利地識(shí)別所有22種表位。含有所述疫苗的藥物組合物是本發(fā)明的另一方面。在本發(fā)明的用于口服、皮下、靜脈、經(jīng)皮或局部施用的藥物組合物中，所述蛋白質(zhì)節(jié)段優(yōu)選地以單劑施用，例如作為與常規(guī)賦形劑或藥用可接受載體的混合物施用。根據(jù)患者的年齡、體重和健康狀況，或根據(jù)疾病嚴(yán)重程度水平和施用途徑，可使用不同的劑量(有優(yōu)選的范圍，例如0.1至lmg，優(yōu)選地0.3至0.7mg，例如每一劑量單元0.5mg)。本發(fā)明的疫苗和/或藥物組合物最終可與治療中所使用的其他藥物組合使用，例如與沙格司亭(sargramostim)(GM-CSF，50iig/m7劑)和/或重組IFN-a2a(1，000，000UI/m7劑)組合。在另一方面，本發(fā)明包括用于治療和/或預(yù)防淋巴組織增生性疾病的試劑盒，其包括本發(fā)明的藥物組合物和/或沙格司亭和/或重組IFN-a2a。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選地包括劑量單元形式的本發(fā)明的藥物組合物，所述劑量單元含有0.5mg量的有效成分和/或沙格司亭(GM-CSF，50yg/m2/劑)和/或重組IFN-a2a(1.000.000UI/m2/劑)。附圖簡述以下通過非限制性實(shí)施例并結(jié)合附圖闡述本發(fā)明，所述附圖僅用于示例本發(fā)明而非對其加以限制，其中-圖1顯示了由重組免疫原性蛋白質(zhì)節(jié)段VK3-20和VK3-15致敏的多克隆細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)系的特異性細(xì)胞毒活性；-圖2顯示了來自不同患者的由重組免疫原性蛋白質(zhì)節(jié)段VK3-20致敏的多克隆CTL細(xì)胞系的特異性細(xì)胞毒活性，用于檢測它們的交叉識(shí)別性；-圖3顯示了由重組免疫原性蛋白質(zhì)節(jié)段VK3-20或VK3-15致敏的多克隆CTL細(xì)胞系的特異性細(xì)胞毒活性，用于識(shí)別"匹配的"或"不匹配的"自身靶標(biāo)；-圖4顯示VK3-20-特異性CTL能夠以I類HLA限制性方式識(shí)別并殺傷天然表達(dá)蛋白VK3-20的淋巴瘤B細(xì)胞(DG75)和天然表達(dá)分子相關(guān)蛋白VK3-15的B_類淋巴母細(xì)胞系(SHP);-圖5顯示，經(jīng)INF-Y-ELISPOT測定，患有HCV相關(guān)性淋巴瘤的患者的CD8+T-淋巴細(xì)胞對VK3-20或VK3-15具有記憶特異性應(yīng)答；-圖6顯示了使用iTOPIA系統(tǒng)所確定的蛋白VK3-20的肽鍵與8種不同的I類HLA等位基因的肽鍵的相對百分比；-圖7顯示了HLA-A*0201P20肽和P33肽特異性CTL細(xì)胞系的細(xì)胞毒活性。交叉反應(yīng)性肽與P33肽(VK3-20)和VK衍生鏈相比；-圖8顯示了HLA_A*0201P20肽特異性CTL細(xì)胞系對許多VK蛋白中存在的交叉反應(yīng)性肽的細(xì)胞毒活性；-圖9顯示了HLA_A*0201P33肽特異性CTL細(xì)胞系對許多VK蛋白中存在的交叉反應(yīng)性肽的細(xì)胞毒活性。實(shí)施例1:重組克隆型Ig的分離、制備、體外表征插入患有II型混合型冷球蛋白血癥的6個(gè)HCV患者的VH和VK區(qū)和伴隨的NHL-B并體外重建，產(chǎn)生來自這些序列的單鏈蛋白(single-filamentproteins,ScFv)并通過親和法純化。僅在體外進(jìn)一步以免疫學(xué)方法表征了來自兩個(gè)患者的VK鏈的蛋白質(zhì)，即VK3-20(VK-gal)和VK3-15(VK-gent)。分別從得自肝活檢和來自骨髓細(xì)胞的腫瘤細(xì)胞提取DNA，這兩種組織均被Kiel分型中的淋巴漿細(xì)胞_淋巴漿細(xì)胞樣型低度惡性非霍奇金淋巴瘤累及。在這兩個(gè)病例中，根據(jù)以前報(bào)道的方法擴(kuò)增VK區(qū)(DeReV等，Blood.2000;96:3578-84)。形成免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的基因?yàn)閂K3_20/JK1*01和VK3_15/JK1*01。隨后克隆VK序列并以單鏈形式表達(dá)。為此，從瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，以限制性酶BamHI和Xhol消化，并連接至質(zhì)粒載體pET26b(Novagen，Madison,WI，UnitedStates)的BamHI-Xhol限制性位點(diǎn)，形成表達(dá)質(zhì)粒pET26b/VK3_20和pET26b/VK3_15。下游引物FL7(5'-CGGGATCCGGAAATTGTGTTGACG-3')提供BamHI的限制性位點(diǎn)，F(xiàn)L5引物(5'CCGCTCGAGTCATTTGATTTCCACC-3')提供3'端Xhol限制性位點(diǎn)。通過使用以獨(dú)特型蛋白VK3-20和VK3-15脈沖式剌激的自體樹突狀細(xì)胞剌激來自13個(gè)健康供者的外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)而獲得多克隆細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)培養(yǎng)物，這些供者經(jīng)主要組織相容性系統(tǒng)基因型分析證實(shí)彼此之間沒有關(guān)聯(lián)。以這種方式獲得了9個(gè)經(jīng)VK3-20剌激的CTL細(xì)胞系和4個(gè)經(jīng)VK3-15剌激的CTL細(xì)胞系。為了體外評(píng)估免疫原性，使用放射性同位素(51Cr)方法和非放射性方法(鈣黃綠素釋放)進(jìn)行細(xì)胞毒性測試。對這些蛋白質(zhì)的體外免疫原性的另一測試是在存在商品化抗體怖/32的情況下評(píng)估特異性細(xì)胞毒性被抑制的百分?jǐn)?shù)，目的在于評(píng)估所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的抗原特異性，結(jié)果證實(shí)所用的機(jī)制是I類HLC限制性的(圖1)。實(shí)施例2:重組獨(dú)特型蛋白的交叉識(shí)別已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，以來自HCV相關(guān)性淋巴瘤的原型輕鏈VK3-20剌激的細(xì)胞毒性應(yīng)答出現(xiàn)了交叉反應(yīng)性，甚至對由同一基因(VK3-20)編碼但來自不同患者的淋巴瘤的獨(dú)特型VK蛋白也是如此(圖2)。圖2的數(shù)據(jù)得自4個(gè)不相關(guān)的供者(通過不同的I類HLA單元型加以區(qū)分)，這些數(shù)據(jù)顯示由重組原型蛋白VK3-20誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性免疫應(yīng)答為何在患有表達(dá)獨(dú)特型免疫球蛋白(包括輕鏈VK3-20)的淋巴瘤的無關(guān)患者中也具有顯著的免疫治療潛能。實(shí)施例3:評(píng)估VK3-20-特異性CTL和VK3-15-特異性CTL的交叉反應(yīng)性進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以評(píng)估VK3-20-特異性CTL和VK3-15-特異性CTL識(shí)別并殺傷自體的匹配靶標(biāo)(或其攜帶相應(yīng)的用于產(chǎn)生所述CTL的蛋白質(zhì))和自體的不匹配靶標(biāo)(或其攜帶分子相關(guān)性蛋白質(zhì)VK3)的能力。在所考慮的3個(gè)供者中，如圖3所示，VK3-20-特異性CTL和VK3-15-特異性CTL甚至能夠以I類限制性方式殺傷分別攜帶VK3-15和VK3-20的靶標(biāo)(不匹配靶標(biāo))。實(shí)際上，這兩種VK3蛋白的序列同源性超過80X，這可以解釋它們的交叉反應(yīng)性。這為將這些重組蛋白用作治療和預(yù)防表達(dá)分子相關(guān)性獨(dú)特型的淋巴組織增生的疫苗提供了依據(jù)。已經(jīng)顯示了VK3-20-特異性CTL是如何以I類限制性方式識(shí)別并殺傷天然表達(dá)蛋白VK3-20的淋巴瘤B細(xì)胞(DG75)和天然表達(dá)分子相關(guān)性蛋白VK3-15的B-類淋巴母細(xì)胞系(SH9)(圖4)。這說明，由淋巴組織增生B細(xì)胞表達(dá)的VK3-20和VK3-15可被天然地加工，并以生理學(xué)方式產(chǎn)生能夠介導(dǎo)具有潛在臨床價(jià)值的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的免疫原性表位。實(shí)施例4:鑒定記憶應(yīng)答為了鑒定淋巴腫瘤患者內(nèi)針對選定的獨(dú)特型Ig的特異性記憶細(xì)胞，基于鑒定分泌干擾素-Y的CD8+T-淋巴細(xì)胞而進(jìn)行ELISP0T分析。該分析顯示，在患有VK+淋巴瘤的患者中存在針對VK3-15和VK3-20的特異性記憶應(yīng)答，見圖5。以ELISPOT方法在48小時(shí)對13個(gè)患有HCV相關(guān)性淋巴瘤的患者的PBMC進(jìn)行測定，其中使用攜帶所述選定的重組蛋白質(zhì)的自體單核細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞，以CD8+T-淋巴細(xì)胞作為"應(yīng)答"細(xì)胞。實(shí)施例5:鑒定并驗(yàn)證免疫原性表位為了鑒定能夠結(jié)合最常見的I類HLA等位基因的VK3-20肽，使用預(yù)測表位的計(jì)算機(jī)方法(Syfpeithi，Net-MHC，Bimas)分析來自HCV-相關(guān)性淋巴組織增生的克隆型Ig的VH和VL區(qū)域。僅對于HLA-A*0201等位基因就鑒定到了35個(gè)能夠結(jié)合這一限制元件的潛在表位。為了鑒定和驗(yàn)證蛋白VK3-20的免疫原性表位，使用了iTopiahigh-throughputEpitopeDiscoverySystem(BeckmanCoulter)。隨后鑒定了蛋白VK3-20的免疫原性表位。通過對肽與重組形式HLA分子的結(jié)合、不結(jié)合以及親和力的一系列ELISA樣測試，分析了來自VK3-20蛋白的100個(gè)九聚物的文庫，所述九聚物彼此重疊一個(gè)氨基酸。隨后鑒定到22個(gè)肽，它們對7種不同的HLA-A和_B等位基因的每一個(gè)具有中等結(jié)合能力(圖6和表1)。還已證實(shí)，以蛋白VK3-20在不同供者中誘導(dǎo)的CTL可以A2限制性方式識(shí)別并殺傷攜帶A*0201肽的靶標(biāo)以及天然表達(dá)蛋白VK3-15的SJ9類淋巴母細(xì)胞系。這進(jìn)一步證實(shí)蛋白VK3-20的表位所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的交叉反應(yīng)性。結(jié)合結(jié)果肽l類HLA分子N"|序列A*0201JAM0301JA"10l|A*2402|B*0702|B'O訓(xùn)J2IVLTQSPGT，111103VLTQSPGTL0.〗、0180105TQSPGTLSF20TLSCRASQI111214025ASQIVSSSY9136274926SQIVSSSYL1244316103—1928IVSSSYLAW0643,3452029VSSSYLAWY429、12，232SYLAWYQQK010■■:23:.'.2Sh'_2941033YLAWYQQKP042"1462240KPGQAPRLL0071042GQAPRLUY01010712——6'24946RLLIYGASS00600o-047LLIYGASSR48LIYGASSRA72FTLTISRLE01——3:二、'32.、，&6855,607—;1861116117SRLEFEDFAV1,19227402VYYCQQYGS1I0，-2150190QQYGSSPRT112■161二-24WQYGSSPRTFI01156，2"SPRTFGQGT102012297RTFGQGTKV1.30':;3:K158i24表1實(shí)施例6:產(chǎn)生重組克隆型Ig為了產(chǎn)生重組克隆型IgVK3-20和VK3-15并實(shí)施所述生產(chǎn)和純化方法，將這些衍生自HCV相關(guān)性淋巴瘤的片段插入細(xì)菌表達(dá)載體pET26b，后者適合用于臨床目的的生產(chǎn)。然后進(jìn)行以下操作-將編碼VK3-20和VK3-15的核苷酸序列插入細(xì)菌載體pET26b-以占總體積1%的濃度接種在含有1%葡萄糖的緩沖SB培養(yǎng)基中-37t:發(fā)酵8-12小時(shí)-純化所述片段在片段插入步驟中，將片段穩(wěn)定插入至卡那霉素抗性細(xì)菌表達(dá)載體pET26b中，并使用針對VK區(qū)的單克隆抗體(mAb)鑒定并定量所產(chǎn)生的片段。在接種步驟中，將細(xì)菌測試樣品，pET26b/VK3-20/VK3-15，其相當(dāng)于總體積的1%，接種至添加了磷酸鹽緩沖液和1%葡萄糖的改良SB培養(yǎng)基中，以IPTG誘導(dǎo)并將培養(yǎng)物在37t:過夜培養(yǎng)發(fā)酵。在純化步驟中9由培養(yǎng)基和細(xì)菌周質(zhì)空間純化目的片段。該方法包括使提取物和培養(yǎng)基通過離子交換樹脂QS印haroseFF(Amersham-GE)以結(jié)合不需要的產(chǎn)物，而將目的片段VK3-20和VK3-15作為柱的洗脫產(chǎn)物而收集，并進(jìn)一步在陽離子交換樹脂SS印haroseFF(Amersham-GE)上處理。通過SDS-PAGE分析評(píng)估VK3-20和VK3-15片段的純度。上述過程在默認(rèn)范圍內(nèi)可從周質(zhì)空間提取物中純化大約37mg的片段，產(chǎn)率為4mg/L，從培養(yǎng)基中純化大約30mg的片段，產(chǎn)率為20mg/L。實(shí)施例7:由特異性肽CTLVK3-20誘導(dǎo)的針對與VK蛋白不相關(guān)的類似表位的交叉反應(yīng)性細(xì)胞毒應(yīng)答特異性CTLVK3-20可誘導(dǎo)針對VK3-15的交叉反應(yīng)性細(xì)胞毒應(yīng)答這一結(jié)果提示這樣一種假設(shè)，即VK3-20可能含有針對同樣屬于VK-III家族或其他家族輕鏈的類似肽的潛在交叉反應(yīng)性免疫原性表位。因此進(jìn)行了免疫信息學(xué)分析，即通過ImMunoGeneTicsinformationsystem⑧來比對VK3-20的表位THLA_A*0201的序列與所收集的所有VK鏈的序列。就保守性而言，僅考慮了具有單個(gè)氨基酸變異的肽。所做的分析似乎提示表位VK3-20在VK-III家族內(nèi)具有高度的保守性。對于肽P20，鑒定到了兩種屬于VK-III家族的其他蛋白質(zhì)的潛在交叉反應(yīng)性表位(表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>^1:HLA-A*0201交叉反應(yīng)性肽與P20肽(VK3-20)和VK衍生鏈相比。令人感興趣的是指出VK3-20的表位P33如何與屬于其他家族的VK蛋白(VK-l、VK-V和VK-V1)的一些具有潛在交叉反應(yīng)性的類似表位相對應(yīng)(表3)，此外，它們在淋巴腫瘤中的表達(dá)并不少見。<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>^1:HLA-A*0201交叉反應(yīng)性肽與P33肽(VK3-20)和VK衍生鏈相比。[OO93]為了證明交叉反應(yīng)性的實(shí)際效力，從2個(gè)HLA-A*0201供者獲得了對VK3-20的肽P20和P33具有特異性的2個(gè)CTL細(xì)胞系。所獲得的細(xì)胞系能夠以特異性方式和HLA-A2限制性方式裂解經(jīng)誘導(dǎo)肽或經(jīng)完整VK3-20脈沖式剌激的自體類淋巴母細(xì)胞系、以及細(xì)胞系DG75(VK3-20+)和SH9(VK3_15+)(圖7)。這些結(jié)果進(jìn)一步支持蛋白Vk3_20的免疫原性，且同時(shí)表明，可以比較容易地從健康供者的外周血單個(gè)核細(xì)胞獲得對VK3-20的表位HLA-A*0201具有特異性的離體CTL。隨后分析了以這種方式獲得的CTL細(xì)胞系裂解自體靶標(biāo)(LCL)的能力，所述自體靶標(biāo)可選地呈遞誘導(dǎo)肽和一系列屬于不同VK蛋白的"交叉反應(yīng)性"肽(表2和3)。該分析證實(shí)，對P20或P33具有特異性的CTL細(xì)胞系能夠?qū)λ斜谎芯康?交叉反應(yīng)性"肽施加HLA-A*0201限制性高細(xì)胞毒性(圖8和9)。對從2個(gè)不同供者獲得的肽特異性CTL進(jìn)行分析，針對所有被研究的"交叉反應(yīng)性"肽HLA-A柳201得到了相當(dāng)?shù)慕Y(jié)果。所獲得的數(shù)據(jù)支持如下結(jié)論，即可以認(rèn)為蛋白VK3-20是由最常見的I類HLA所呈遞的眾多免疫原性表位的"載體"。由淋巴瘤VK3-20+細(xì)胞天然呈遞的這些表位所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答很可能不僅對于表達(dá)VK-III家族輕鏈的淋巴瘤是有效的，而且對于表達(dá)不同家族的VK蛋白的淋巴瘤也是有效的。因此，這些結(jié)果為基于使用不同B細(xì)胞淋巴組織增生之間所共有的Id來構(gòu)建用于"交叉反應(yīng)性"免疫治療的重組疫苗提供了堅(jiān)實(shí)的臨床前期依據(jù)。實(shí)施例8:在生物反應(yīng)器Wave內(nèi)產(chǎn)生蛋白VK3-20為了獲得能夠在GMP競爭中快速轉(zhuǎn)化的蛋白VK3-20生產(chǎn)方法，建立了在一次性生物反應(yīng)器WaveEHTD20/50(GEHealthcare)中的發(fā)酵方法。該方式采用無菌一次性袋，因此與傳統(tǒng)發(fā)酵罐相比能夠消除不同批次之間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。出于同樣的原因也不需要清潔和無菌化驗(yàn)證過程。根據(jù)以下方案進(jìn)行發(fā)酵-制備預(yù)培養(yǎng)物將單個(gè)袋連接于生物反應(yīng)器振蕩板，并在無菌條件下充入100ml的SBT培養(yǎng)基。從甘油儲(chǔ)存液中取50iU細(xì)菌，移液至1ml的SBT培養(yǎng)基中，然后通過注射器接種在袋內(nèi)。該預(yù)培養(yǎng)物在37t:搖動(dòng)培養(yǎng)過夜，該生物反應(yīng)器被設(shè)置為擺動(dòng)12°，速度為40rpm。-發(fā)酵次日，通過充入10L的SBT培養(yǎng)基制備新的一次性袋。使用袋上所裝的具有路厄連接(luerjunction)的管子將100ml預(yù)培養(yǎng)物接種在10L培養(yǎng)基內(nèi)。然后在37。C發(fā)酵該培養(yǎng)物3小時(shí)，搖動(dòng)(12°，40rpm)。3小時(shí)后使用注射器向培養(yǎng)物內(nèi)加入誘導(dǎo)劑IPTG，終濃度為lmM，然后使培養(yǎng)物在相同的溫度和搖動(dòng)條件下生長過夜。通過在600nm讀取光密度而監(jiān)測細(xì)菌生長，結(jié)果如下時(shí)間(分鐘)吸光度(600nm)00.168580.39830.697900.80612<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>這些數(shù)據(jù)說明細(xì)菌群體在生物反應(yīng)器Wave內(nèi)的生長趨勢與在傳統(tǒng)系統(tǒng)(搖瓶)內(nèi)的生長相當(dāng)。發(fā)酵方法獲得的生物量為每升細(xì)菌培養(yǎng)物平均18克沉淀物，且蛋白VK3-20的產(chǎn)量與傳統(tǒng)發(fā)酵方法獲得的產(chǎn)量相當(dāng)。因此，可以使用發(fā)酵用生物反應(yīng)器Wave產(chǎn)生適合于GMP生產(chǎn)的具有可重復(fù)性的理想方法。該生物反應(yīng)器還允許處理規(guī)模線性擴(kuò)大至500L，且因此能夠產(chǎn)生足夠用于臨床的原料。實(shí)施例9:蛋白VK3-20與KLH偶聯(lián)為了增強(qiáng)VK3-20蛋白的免疫原性，建立了將多肽偶聯(lián)于血藍(lán)蛋白(鑰孔血藍(lán)蛋白，KLH，Vacm皿e)的方法。所述偶聯(lián)蛋白用于免疫方案以產(chǎn)生單克隆抗體。根據(jù)以下方法將純化的蛋白質(zhì)偶聯(lián)于KLH。在PBS中制備濃度為4.8mg/ml的SulfoSMCC溶液。取260的KLH儲(chǔ)存液(濃度20mg/ml)并加入44y1所制備的SulfoSMCC溶液，并加入200y1的PBS:然后將混合物室溫溫育30分鐘。使用Centricon(50KDa截?cái)嘀?，Millipore)去除多余的交聯(lián)劑。向制備的溶液中加入6mg預(yù)先純化并在PBS中透析的蛋白VK3-20，然后室溫溫育30分鐘。通過在將終產(chǎn)物通過具有50KDa截?cái)嘀档哪みM(jìn)行過濾之后定量流通部分和保留部分中的蛋白質(zhì)含量而評(píng)估該偶聯(lián)方法的效力。權(quán)利要求疫苗，其包含選自VK3-20和VK3-15中的至少一種蛋白質(zhì)節(jié)段。2.權(quán)利要求l的疫苗，其包含蛋白質(zhì)節(jié)段VK3-20和VK3-15。3.選自VK3-20、VK3-15VK3_20、VK3-15及其混合物的蛋白質(zhì)節(jié)段在制備用于治療和/或預(yù)防淋巴組織增生性疾病的藥物或疫苗中的用途。4.權(quán)利要求3的用途，用于治療和/或預(yù)防HCV相關(guān)性和非HCV相關(guān)性淋巴組織增生性疾病。5.用于治療淋巴組織增生的藥物組合物，其包含選自VK3-20和VK3-15中的至少一種蛋白質(zhì)節(jié)段作為有效成分，所述蛋白質(zhì)節(jié)段與至少一種藥用可接受賦形劑混合。6.權(quán)利要求5的藥物組合物，其包含VK3-20和VK3-15這兩種蛋白質(zhì)節(jié)段作為有效成分。7.權(quán)利要求5或6的藥物組合物，用于口服、胃腸外或局部施用，施用的有效成分為0.1至lmg。8.制備選自VK3-20和VK3-15中的至少一種蛋白質(zhì)節(jié)段的方法，其包括將核苷酸序列插入合適的表達(dá)載體，發(fā)酵、分離并純化所述蛋白質(zhì)節(jié)段。9.權(quán)利要求8的方法，其中所述選自VK3-20和VK3-15中的至少一種蛋白質(zhì)節(jié)段被插入卡那霉素抗性細(xì)菌表達(dá)載體pET26b以形成重組菌株pET26b/VK3-20/VK3-15。10.權(quán)利要求8或9的方法，其中使用抗VK的mAb鑒定并定量所述選自VK3-20和VK3-15中的至少一種蛋白質(zhì)節(jié)段。11.權(quán)利要求9或10中任一項(xiàng)的方法，其中所述發(fā)酵包括在SB培養(yǎng)基中接種1%的所述重組菌株pET26b/VK3-20/VK3-15。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述SB培養(yǎng)基是緩沖的。13.權(quán)利要求12的方法，其中所述培養(yǎng)基以磷酸鹽緩沖液進(jìn)行緩沖并含有1%(w/w)的葡萄糖。14.權(quán)利要求11-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述重組菌株在37t:培養(yǎng)8-12小時(shí)。15.權(quán)利要求8-14中任一項(xiàng)的方法，其中通過在離子交換樹脂QS印haroseFF(Amersham-GE)上進(jìn)行洗脫從培養(yǎng)基或細(xì)菌周質(zhì)空間分離所述選自VK3-20和VK3-15中的至少一種蛋白質(zhì)節(jié)段。16.權(quán)利要求15的方法，其中在陽離子交換樹脂SS印haroseFF(Amersham-GE)上純化所述洗脫的產(chǎn)物。17.試劑盒，其包含權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的藥物組合物和/或沙格司亭和/或重組IFN-a2a。18.試劑盒，其包含含有0.5mg有效成分的權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的藥物組合物和/或沙格司亭(GM-CSF，50iig/m2/劑)和/或重組IFN-a2a(1.000.000UI/m2/劑)。19.疫苗，其包含蛋白質(zhì)節(jié)段，所述蛋白質(zhì)節(jié)段能夠識(shí)別蛋白VK3-20的22個(gè)已鑒定的免疫原性表位中的至少一種。20.權(quán)利要求19的疫苗，其中所述蛋白質(zhì)節(jié)段能夠識(shí)別一種以上所述22個(gè)已鑒定的表位。21.權(quán)利要求19或20的疫苗，其中所述蛋白質(zhì)節(jié)段能夠識(shí)別所有所述22個(gè)已鑒定的表位。22.能夠識(shí)別蛋白VK3-20的22個(gè)已鑒定的免疫原性表位中的至少一種的至少一種蛋白質(zhì)節(jié)段在制備用于治療和/或預(yù)防淋巴組織增生性疾病的疫苗中的用途。23.權(quán)利要求22的用途，用于制備用于治療和/或預(yù)防HCV相關(guān)性和非HCV相關(guān)性淋巴組織增生性疾病的疫苗。24.權(quán)利要求22或23的用途，其中所述蛋白質(zhì)節(jié)段能夠識(shí)別一種以上所述22個(gè)已鑒定的表位。25.權(quán)利要求22或23的用途，其中所述蛋白質(zhì)節(jié)段能夠識(shí)別所有所述22個(gè)已鑒定的表位。全文摘要本發(fā)明涉及使用重組克隆型免疫球蛋白(Ig)作為疫苗來治療HCV相關(guān)性和非HCV相關(guān)性淋巴組織增生，具體涉及由來自患有淋巴組織增生的患者的Ig輕鏈的蛋白質(zhì)節(jié)段VK3-20和VK3-15衍生出的具有免疫原性的重組蛋白質(zhì)的用途。文檔編號(hào)C07K14/18GK101790382SQ200880100674公開日2010年7月28日申請日期2008年7月24日優(yōu)先權(quán)日2007年7月27日發(fā)明者D·加斯帕羅托,M·L·諾利,M·圭多伯尼,R·多爾切蒂,S·卡斯蒂繆尼,V·德雷申請人:阿雷塔國際責(zé)任有限公司