專利名稱：：克隆目的基因5’末端的方法及其專用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及克隆目的基因5’末端的方法及其專用試劑盒。
背景技術(shù)：
：在現(xiàn)代生物學研究中，克隆全長基因是深入研究基因結(jié)構(gòu)和功能不可或缺的一步。通過文庫篩選或是同源克隆，往往只是得到基因的部分DNA序列信息，要獲得基因全長，必需獲得基因的5’末端序列信息和3’末端序列信息。目前，克隆基因的3’末端和5’末端常用的方法是cDNA末端快速擴增(RapidAmplificationofcDNAEnd，RACE)。使用cDNA末端快速擴增方法克隆基因3’末端時，mRNA3’末端具有特殊的多聚腺嘌呤標簽(polyA)，容易克?。籱RNA非常容易降解，而基因5’末端的克隆需要較多的涉及mRNA操作的步驟，所以使用cDNA末端快速擴增方法克隆基因5’末端比較煩瑣，不容易成功。而一些比較成熟的商品化RACE試劑盒也比較昂貴。mRNA通過基因組DNA轉(zhuǎn)錄而來，所以從基因組DNA中同樣也可以得到基因的末端序列。通過熱不對稱聚合酶鏈式反應(ThermalAsymmetricInterlacedPCR,TAIL-PCR)也可以獲得已知部分序列信息的旁側(cè)序列，但是此方法中使用的簡并引物簡并度較大，在用于基因末端克隆時，隨機性較大。巢式PCR是在第二輪PCR中，使用一套新的引物，它與第一套引物擴增的片段結(jié)合，形成更短的PCR產(chǎn)物，如果在第一輪中產(chǎn)生一些非特異性的產(chǎn)物，在凝膠上帶不清晰或者有許多帶，而使用巢式PCR就會確保只有目的產(chǎn)物被擴增，因為只有目的序列才會含有與兩套引物結(jié)合的位點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種克隆目的基因5’末端的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明所提供的克隆基因5’末端的方法，是用根據(jù)TATA-box保守序列設(shè)計的簡并引物分別與基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3組合成3對引物，用所述3對引物進行半巢式PCR擴增基因5’末端；所述基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3的Tm值均高于所述簡并引物3-5°C；所述基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3與所述基因的結(jié)合位置依次靠近基因5’末端。其中，根據(jù)TATA-box保守序列設(shè)計的簡并引物具體可為序列表中序列1、序列2、序列3或序列4所示。所謂的半巢式PCR就是在設(shè)計巢式PCR引物時利用第一對引物中的一個引物，在從靶序列內(nèi)部設(shè)計一個引物與其配對，也可獲得巢式PCR的效果；再結(jié)合特殊設(shè)計的PCR程序，使啟動子序列TATA-box和已知片段之間的序列有效擴增。所述基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3可根據(jù)實驗目的的不同設(shè)計不同的引物。在目的基因序列內(nèi)部設(shè)計引物GSP1、GSP2和GSP3只要滿足引物GSP1、GSP2和GSP3的Tm值均高于所述簡并引物3-5°C和所述基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3與所述基因的結(jié)合位置依次靠近基因5’末端這兩個條件，其他按照PCR引物設(shè)計的基本要求即可。所述半巢式PCR的反應程序如下第一輪PCR預變性、變性、62°C退火，延伸，循環(huán)至少6次；變性、30°C退火、延伸，循環(huán)至少1次；變性、60°C退火、延伸，循環(huán)至少6次；變性，58°C退火、延伸，循環(huán)至少5次；變性，56°C退火、延伸，循環(huán)至少10次；最后延伸；第二輪PCR預變性、變性、65°C退火，延伸，循環(huán)至少4次；變性、62°C退火、延伸，循環(huán)至少4次；變性、59°C退火、延伸，循環(huán)至少4次；變性、56°C退火、延伸，循環(huán)至少4次；最后延伸；第三輪PCR與所述第二輪PCR反應程序相同。上述的預變性、變性、延伸的溫度和時間可按照本領(lǐng)域中常規(guī)PCR反應的條件進行。如所述第一輪PCR的反應程序具體可為98V預變性3分鐘、95°C變性30秒、62°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)6次；950C變性30秒、30V退火40秒、72°C延伸3分鐘，循環(huán)1次；95"C變性30秒、60"C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)6次；950C變性30秒、58V退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)5次；950C變性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)10次；最后72°C延伸5分鐘。所述第二輪PCR的反應程序具體可為98V預變性3分鐘、95°C變性30秒、65°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95"C變性30秒、62°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95"C變性30秒、59"C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95"C變性30秒、56"C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；最后72°C延伸5分鐘。本發(fā)明的另一個目的是提供一種克隆基因5’末端的試劑盒。本發(fā)明所提供的克隆基因5’末端的試劑盒，包括根據(jù)TATA-box保守序列設(shè)計的簡并引物。其中，所述簡并引物的核苷酸序列具體可為序列表中序列1、序列2、序列3或序列4所示。本發(fā)明的試劑盒中還可包括PCR反應所用的試劑、瓊脂糖凝膠電泳所用的試劑和說明書等等。本發(fā)明的克隆目的基因5’末端的方法沒有涉及煩瑣RNA的操作，實驗步驟簡單可行，快速有效。實驗可以在一天內(nèi)完成，無需繁多的操作，大大節(jié)省了時間，并且結(jié)果分析簡單可靠。本發(fā)明克隆目的基因5’末端的方法避免了使用昂貴的RNA提取試劑和RACE試劑等，降低了實驗成本。圖1為本發(fā)明的克隆目的基因5’末端的方法示意圖以及引物的位置。具體實施方式下述實施例中如無特殊說明所用方法均為常規(guī)方法，所用試劑均可從商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明根據(jù)植物基因啟動子區(qū)域很保守的啟動子序列元件TATA-box設(shè)計啟動子簡并引物(TATA-boxDegeneratePrimers,TDP)和對已知片段序列信息設(shè)計的基因特異引物(GeneSpecificPrimers,GSP)進行半巢式PCR(1)設(shè)計TATA-box簡并引物(TATA-boxDegeneratePrimers,TDP)根據(jù)PlantPromDB數(shù)據(jù)庫提供的TATA-box保守序列信息(表1)設(shè)計TDP引物(表2)，分別命名為TDP1、TDP2、TDP3和TDP4，長度為24bp。表1.171種植物啟動子TATA-box核苷酸頻率矩陣~~<2~~<1~~Γ~2Γ~3Γ5Γ~67Γ~8~>1~>2~0.280.160.030.950.00~1.000.620.970.380.730.130.30~~C0.270.630.010.000.040.000.000.000.010.080.420.42~~G0.170.050.000.000.000.000.000.020.000.100.280.16~~Γ0.280.160.960.050.960.000.380.010.610.090.180.11NCTATAΛΑATTAAC/GC/A表2.TDP引物的核苷酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(2)設(shè)計基因特異引物(GeneSpecificPrimers,GSP)根據(jù)已知序列設(shè)計半巢式PCR引物，分別命名為GSP1、GSP2、GSP3，長度均為26-30bp，退火溫度均高于TDP引物3-5°C。GSP3、GSP2、GSPl引物依次遠離基因5，末端。(3)PCR反應程序第一輪PCR反應體系50μL反應體系250μΜdNTP,IOmMTris-HCl(pH8.3),50mMKCl,1.5mMMgCl2,TDP1、TDP2、TDP3或TDP4引物20μM，GSPl引物20μΜ，0·5mg基因組DNA為模板。第一輪PCR循環(huán)參數(shù)為98°C預變性3分鐘；95°C變性30秒，62°C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)6次；950C變性30秒，30V退火40秒，72°C延伸3分鐘，循環(huán)1次；95"C變性30秒，60"C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)6次；950C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)5次；95"C變性30秒，56"C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)10次；最后72°C延伸5分鐘。第二輪PCR反應體系50μL反應體系250μΜdNTP,IOmMTris-HCl(pH8.3),50mMKCl,1.5mMMgCl2,TDP1、TDP2、TDP3或TDP4引物20μΜ,GSP2引物20μΜ，適當稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物。第二輪PCR循環(huán)參數(shù)為98°C預變性3分鐘；95°C變性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95"C變性30秒，62°C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95"C變性30秒，59"C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95"C變性30秒，56"C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；最后72°C延伸5分鐘。第三輪PCR反應體系5(^1^反應體系25(^]dNTP,IOmMTris-HCl(pH8.3),50mMKCl,1.5mMMgCl2,TDP1、TDP2、TDP3或TDP4引物20μΜ,GSP3引物20μΜ，適當稀釋的第二輪PCR產(chǎn)物。第三輪PCR與第二輪PCR循環(huán)參數(shù)相同。(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，回收PCR產(chǎn)物。下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明的克隆目的基因5’末端的方法。這些實施例僅用于說明本發(fā)明的方法而不用于限制本發(fā)明的使用范圍。實施例1、虎杖中查爾酮合酶基因(PcCHS2基因)5’末端的克隆根據(jù)已經(jīng)得到的虎杖基因PcCHS2部分基因序列信息，設(shè)計基因特異(GSP)引物，GSPUGSP2和GSP3，GSPUGSP2和GSP3的核苷酸序列如下GSP1:5，-CTCAACCGACTTCTTCCTCATCT-3，；GSP2:5，-GCGAGTCCCAATCACTCACATT-3，；GSP3:5，-GAAGCAGATAGCGGTTATTTCG-3，。PCR反應程序第一輪PCR反應體系50μL反應體系250μΜdNTP,IOmMTris-HCl(pH8.3),50mMKCl,1.5mMMgCl2,TDPl引物20μΜ,GSPl引物20μΜ，0·5mg虎杖基因組DNA為模板。第一輪PCR循環(huán)參數(shù)為98°C預變性3分鐘；95°C變性30秒，62°C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)6次；95°C變性30秒，30V退火40秒，72°C延伸3分鐘，循環(huán)1次；95"C變性30秒，60"C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)6次；950C變性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)5次；95"C變性30秒，56"C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)10次；最后72°C延伸5分鐘。第二輪PCR反應體系5(^1^反應體系25(^]dNTP,IOmMTris-HCl(pH8.3),50mMKCl,1.5mMMgCl2,TDPl引物20μΜ,GSP2引物20μΜ，適當稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物。第二輪PCR循環(huán)參數(shù)為98°C預變性3分鐘；95°C變性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95"C變性30秒，62°C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95"C變性30秒，59"C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95"C變性30秒，56"C退火30秒，72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；最后72°C延伸5分鐘。第三輪PCR反應體系5(^1^反應體系25(^]dNTP,IOmMTris-HCl(pH8.3),50mMKCl,1.5mMMgCl2,TDPl引物20μΜ,GSP3引物20μΜ，適當稀釋的第二輪PCR產(chǎn)物。第三輪PCR與第二輪PCR循環(huán)參數(shù)相同?；厥誔CR擴增產(chǎn)物，將PCR擴增產(chǎn)物克隆到pMD18_Τ載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，挑取陽性克隆，用引物Sl:5，-TCCGAAATAACCGCTATCTGC-3，和GSP3PCR鑒定，對PCR擴增出IOOObp左右的產(chǎn)物的克隆的質(zhì)粒測序。測序結(jié)果表明擴增片段的核苷酸序列與GenbankEU647246中公開的序列一致(序列表中的序列5)。經(jīng)BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)和DNAstar軟件分析表明，PCR擴增產(chǎn)物含有部分啟動子序列，ATG翻譯起始位點。除分別用TDP2、TDP3和TDP4代替TDPl外其他步驟均與上述方法相同，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)過測序，其核苷酸序列均與GenbankEU647246中公開的序列一致。上述實驗結(jié)果說明本發(fā)明的克隆目的基因5’末端的方法能從植物基因組DNA中成功的克隆出基因5’末端。序列表<110>中國科學院植物研究所<120>克隆目的基因5’末端的方法及其專用試劑盒<130>CGGNARW92121<160>5<210>1<211>23<212>DNA<213>人工序列0111]<220>0112]<221>misc-feature0113]<222>(10,11，12，18,20)0114]<223>y=t或c;n=a或g或t,或c=0115]<400>10116]gattctagayynctatawawacc230117]<210>20118]<211>230119]<212>DNA0120]<213>人工序列0121]<220>0122]<221>misc-feature0123]<222>(10,11，12，18,20)0124]<223>y=t或c;n=a或g或1或c=0125]<400>20126]gattctagayynctatawawage230127]<210>30128]<211>230129]<212>DNA0130]<213>人工序列0131]<220>0132]<221>misc-feature0133]<222>(10,11，12，18,20)0134]<223>y=t或c;n=a或g或1或c=0135]<400>30136]gattctagayynctatawawaca230137]<210>40138]<211>230139]<212>DNA0140]<213>人工序列0141]<220>0142]<221>misc-feature0143]<222>(10,11，12，18,20)0144]<223>y=t或c;n=a或g或1匕或c=0145]<400>40146]gattctagayynctatawawaga230147]<210>50148]<211>1800149]<212>DNA<213>虎杖(P01ygonumcuspidatum)]<400>5atggctccggcggttgcagacattagaaaggctcagagggcggaggggcccgccaccgtc60ctcgccatcggcaccgccactcctcccaattgtgtctaccagaaggactaccccgactac120tactttcgtgtcaccaacagcgatcacatgaccgacctcaaggagaaattccgtcgcatg180權(quán)利要求克隆基因5’末端的方法，是用根據(jù)TATA-box保守序列設(shè)計的簡并引物分別與基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3組合成3對引物，用所述3對引物進行半巢式PCR擴增基因5’末端；所述基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3的Tm值均高于所述簡并引物3-5℃；所述基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3與所述基因的結(jié)合位置依次靠近基因5’末端。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述簡并引物的核苷酸序列為序列表中序列1、序列2、序列3或序列4所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述半巢式PCR的反應程序如下第一輪PCR預變性、變性、62°C退火，延伸，循環(huán)至少6次；變性、30°C退火、延伸，循環(huán)至少1次；變性、60°C退火、延伸，循環(huán)至少6次；變性，58°C退火、延伸，循環(huán)至少5次；變性，56°C退火、延伸，循環(huán)至少10次；最后延伸；第二輪PCR預變性、變性、65°C退火，延伸，循環(huán)至少4次；變性、62°C退火、延伸，循環(huán)至少4次；變性、59°C退火、延伸，循環(huán)至少4次；變性、56°C退火、延伸，循環(huán)至少4次；最后延伸；第三輪PCR與所述第二輪PCR反應程序相同。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述第一輪PCR的反應程序為98°C預變性3分鐘、95°C變性30秒、62°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)6次；95°C變性30秒、30°C退火40秒、72°C延伸3分鐘，循環(huán)1次；95°C變性30秒、60°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)6次；95°C變性30秒、58°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)5次；95°C變性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)10次；最后72°C延伸5分鐘。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述第二輪PCR的反應程序為98°C預變性3分鐘、95°C變性30秒、65°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95°C變性30秒、62°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95°C變性30秒、59°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；95°C變性30秒、56°C退火30秒、72°C延伸2.5分鐘，循環(huán)4次；最后72°C延伸5分鐘。6.克隆基因5’末端的試劑盒，包括根據(jù)TATA-box保守序列設(shè)計的簡并引物。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述簡并引物的核苷酸序列為序列表中序列1、序列2、序列3或序列4所示。全文摘要本發(fā)明公開了一種克隆目的基因5’末端的方法及其專用試劑盒。本發(fā)明所提供的克隆基因5’末端的方法，是用根據(jù)TATA-box保守序列設(shè)計的簡并引物TDP分別與基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3組合成3對引物，用所述3對引物進行半巢式PCR擴增基因5’末端；所述基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3的Tm值均高于所述TDP簡并引物3-5℃；所述基因特異引物GSP1、GSP2和GSP3與所述基因的結(jié)合位置依次靠近基因5’末端。本發(fā)明克隆目的基因5’末端的方法避免了使用昂貴的RNA提取試劑和RACE試劑等，降低了實驗成本。文檔編號C12P19/34GK101824448SQ20091007883公開日2010年9月8日申請日期2009年3月3日優(yōu)先權(quán)日2009年3月3日發(fā)明者劉本葉,葉和春,李國鳳,王紅,郭艷武,馬蘭青申請人:中國科學院植物研究所