專利名稱：紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表達載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及ー種提高植物抗鋁毒脅迫能力的紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因#的植物表達載體pK2-35S-#dZ#77及其在制備降低鋁吸收和抗鋁毒能力增強的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鋁毒是酸性土壌中植物生長和作物產(chǎn)量的主要限制因素。酸性土壌占世界可耕種土壌的30%，主要分布在南非、中亞和東南亞等對糧食需求量最大的發(fā)展中國家。我國的酸 性土壌主要分布在長江以南的熱帶、亞熱帶及云貴川等地區(qū)，面積達204萬公頃，大部分土壤的PH值小于5. 5，其中很大一部分小于5. O。農(nóng)業(yè)上通?？渴┘由乙跃徑馑嵝酝翂粗械匿X毒問題，然而這種方法只能改良表層土壌，并不能改變深層土壤的pH值，且耗費大量的經(jīng)濟和人力。因此，在降低土壌酸度的同時，挖掘植物自身的抗鋁潛力，利用基因工程手段在植物中過量表達抗鋁基因，是解決酸性土壌中鋁毒害和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的有效策略。鋁誘導的植物根尖蘋果酸的分泌是植物抗鋁的主要機制，蘋果酸的分泌由蘋果酸通道蛋白基因(ALMT1)所控制。ALMTl是ー類含有UPR)005結(jié)構(gòu)域且具有5_7個跨膜結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白。TaALMTl是從耐招小麥(Triticum aestivum)ET8中克隆得到的第一個植物耐鋁基因，生理及電生理實驗發(fā)現(xiàn)，鋁耐受性小麥品種在鋁脅迫下有機酸的分泌是通過開啟有機酸陰離子通道來實現(xiàn)。如抗鋁小麥ET8主要的抗鋁基因TaALMTl在水稻和煙草細胞中異源表達后引起鋁誘導的蘋果酸外流，因而提高煙草細胞的耐鋁能力。將TaALMTl基因轉(zhuǎn)入大麥中過量表達，轉(zhuǎn)基因大麥具有與ET8相似的蘋果酸分泌和抗鋁毒能力。如Delhaize等發(fā)現(xiàn)表達TaALMTl的轉(zhuǎn)基因大麥具有ー個鋁激活的蘋果酸流，當轉(zhuǎn)基因大麥收到鋁脅迫時可以増加蘋果酸分泌和對鋁毒的抗性。進ー步的研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大麥在酸性土壌上可以更有效的吸收磷元素，產(chǎn)量也比非轉(zhuǎn)基因株系高。Pereira等在小麥種過量表達TaALMTl基因，結(jié)果9個T2代轉(zhuǎn)基因株系的TaALMTl表達增強，蘋果酸的分泌量和鋁耐受性顯著提高。ー些T2代轉(zhuǎn)基因株系在含有鋁溶液和土壌中培養(yǎng)時鋁耐受性都高于抗鋁小麥品種ET8，。抗鋁油菜品種中鋁誘導根的蘋果酸分泌與也#/7取BnALMT2的高表達有夫。過量表達BnALMTl取BnALMT2的轉(zhuǎn)基因煙草細胞在鋁脅迫下蘋果酸分泌比野生型細胞高8_11倍，鮮重増加3-4倍。AtALMTl是擬南芥的重要抗鋁基因之一，該基因的突變使其對鋁敏感性增カロ。Ryan等的研究證實過表達的轉(zhuǎn)基因擬南芥RRG比野生型高大約3倍。然而，值得我們關(guān)注的是，目前用于轉(zhuǎn)基因的メ1#77基因的植物來源還很不廣泛，基因均來源于単一的抗鋁或模式植物。紫花苜蓿由于產(chǎn)草量高、莖葉富含蛋白質(zhì)和適ロ性好等特點而被稱為“牧草之王”，在我國廣泛種植。渝苜一號為西南大學玉永雄教授培育的具有耐濕、耐貧瘠且在西南地區(qū)廣泛種植的苜蓿新品種。我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在紫花苜蓿渝苜一號根中，鋁誘導了#基因的上調(diào)表達和蘋果酸的分泌。為了進一歩開發(fā)該基因在植物抗鋁中的應(yīng)用，本發(fā)明使用紫花苜蓿渝苜一號的根為材料，克隆獲得了鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因(MsALMTO0本發(fā)明通過Gateway技術(shù)構(gòu)建了植物表達載體pK2-35S-#dZ#77，通過葉盤轉(zhuǎn)化法成功將MsALMTI基因轉(zhuǎn)入煙草中實現(xiàn)了過表達。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提聞植物抗招韋能力基因的植物表達載體，該載體是含有來自于紫花苜蓿根中的鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因(即基因)的植物表達載體；同時提供該載體的構(gòu)建方法，以及該載體在制備降低鋁吸收和提高抗鋁能力的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的用于提高植物抗鋁能力的載體，是具有組成型啟動子和蘋果酸通道蛋白基因cDNA的植物表達載體。上述載體中，所述的蘋果酸通道蛋白基因的cDNA來源 于紫花苜蓿鋁敏感性栽培種渝苜一號(Uicago sativa L. cv. YMl),所述的來源于紫花苜猜的蘋果酸通道基WsALMTI 的 GenBank 登錄號為⑶550122。上述蘋果酸通道蛋白基因cDNA的上游為CaMV 35S的組成型啟動子。本發(fā)明中用于構(gòu)建所屬植物表達載體的起始載體為pK2GW7 (購自FlandersInteruniversity Institute for Biotechnology, VIB)。本發(fā)明的上述植物表達載體mHMsALMTl由下述方法構(gòu)建而成
(I)根據(jù)MtALMTl的ORF設(shè)計的引物為
上游引物5' - GGATCCATGGTGTCTGAACCAAATTCAAG-3 ’ (.BamHl)
下游引物5’ - AAGCTTTAGTTAATTATAATAACATGTTG -3’ (.HincIlll)
上游引物5 ’端加GGATCC特征序列，并由此形成及 /TI酶切位點；下游引物3 ’加AAGCTT特征序列，形成ガifldll酶切位點，以紫花苜蓿第一鏈cDNA為模板擴增，得到#基因的全長cDNA ；
2)回收并純化#全長基因cDNA片段，并將其連接到pMD_18T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得重組質(zhì)粒pMD18-#dZ#77。對該質(zhì)粒進行測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與#^#77具有95%的相似性，NCBI的登錄號為⑶550122 ；
(3)構(gòu)建中間載體pENTRTM2B- MsALMTI，覓 BamHl 和沿/ t/III 酶切 pMD18_i&也#77 和pENTR^-PrbcS-^T-67^ (Invitrogen)得到目的基因片段和載體片段pENTRTM_2B，回收后進行連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞，得到重組載體PENTRTM2B- MsALMTI ；
(4)構(gòu)建植物表達載體pK2-35S-#dZ#77，通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把#亞克隆到植物表達載體PK2GW7中，獲得MsMMn基因的植物表達載體pK2-35S-#dZ#77。本發(fā)明另一目的是將重組載體pK2-35S-#dZ#77在制備吸收和抗鋁毒能力增強的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。本發(fā)明利用組成型CaMV 35S啟動子構(gòu)建#基因的植物表達載體，以便在轉(zhuǎn)基因植物中過量表達蘋果酸通道蛋白基因，由于該基因編碼了鋁誘導的蘋果酸通道蛋白，因此增強了植物蘋果酸分泌的同時，也提高了轉(zhuǎn)基因植物的抗鋁能力和降低了植物根尖對鋁的吸附。


圖I是本發(fā)明中間載體pMD18-#dZ#77的構(gòu)建策略示意 圖2是本發(fā)明中中間載體pENTRTM2B-#dZ#77的構(gòu)建策略示意 圖3是本發(fā)明中間載體pMD18-#^Z#77的構(gòu)建和檢測；其中A是MsALMTI的PCR擴增產(chǎn)物，圖中1為使用鋁處理的植物根提取的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈為模板的擴增產(chǎn)物；2為以水為負對照；M為Maker III ；B是重組質(zhì)粒_18-MsALMn的酶切檢測，圖中1為 BatnHI 和 HindIII 酶切 pMD18_i&也#77 產(chǎn)物；M 為 Maker III。圖4是本發(fā)明中間載體pENTRTM2B-#dZ#77的檢測電泳示意圖；其中A是pENTRTM2B-#^Z#ri的質(zhì)粒提取電泳檢測圖，圖中1_3為pENTRTM2B-ifejZ#77的質(zhì)粒，M為Maker III ;B是pENTRTM2B-#dZ#77的質(zhì)粒酶切檢測示意圖，圖中I為SalI和油a/的雙 酶切檢測，2為BamHI和HindIII的雙酶切檢測，3為pENTRTM2B-#dZ#77的質(zhì)粒對照，M為Maker III。圖5是本發(fā)明中用Gateway的LR反應(yīng)構(gòu)建#基因的植物表達載體的策略示意圖。圖6是本發(fā)明中MsALMTI植物表達載體pK2-35S_i&也#77的檢測電泳示意圖；其中A是重組質(zhì)粒pENTRTM2B-#d Z#77和pK2GW7質(zhì)粒電泳圖，圖中I為中間克隆載體pENTRTM2B-i&也#77，2和3為植物表達載體pK2GW7，M為Maker III ;B是植物表達載體pK2-35S-#^Z#ri的質(zhì)粒提取電泳示意圖，圖中1_4為pK2-35S-ifejZ#77質(zhì)粒，5為pK2GW7質(zhì)粒，M 為 Maker III。圖7是本發(fā)明中MsALMTI植物表達載體pK2-35S-#dZ#77的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子菌落的檢測電泳示意圖；其中A是pK2-35S-#dZ#77質(zhì)粒雙酶切檢測電泳示意圖，圖中I為BamHl和沿/ t/III雙酶切，M為Maker III ；B是農(nóng)桿菌菌落PCR檢測pK2-35S-ife^Z#77的轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的效果示意圖，圖中1-5為轉(zhuǎn)化子，6為vmMsALMTl質(zhì)粒正對照，7為pK2GW7負對照，M 為 Maker III。圖8是本發(fā)明中#轉(zhuǎn)基因煙草的中基因組水平和轉(zhuǎn)錄水平的檢測示意圖；其中A是轉(zhuǎn)基因植物的基因組水平的檢測電泳圖，圖中M為Maker III，I為以m-^-MsALMTl為模板進行PCR的正對照，2為WT植物，3為轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)4，4為轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)5，5為轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)6，6為轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)9 ；B是RT-PCR分析轉(zhuǎn)基因植物#的表達水平電泳圖，圖中A5-A9為轉(zhuǎn)基因株系，WT為野生型煙草。圖9是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因和野生型植物根尖蘋果酸分泌量結(jié)果比較示意圖，圖中+Al為0. 5 mM CaCl2 (pH4. 2)的處理液中添加30 u M AlCl3處理24 h，_Al為不添加AlCl3的CaCl2溶液(pH4. 2)處理24 h，WT為野生型煙草，A5-A9為轉(zhuǎn)基因株系。圖10是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因和野生型煙草的抗鋁能力一鋁脅迫下根的相對生長率分析比較示意圖；圖中WT為野生型煙草，A5-A9為轉(zhuǎn)基因株系。圖11是本發(fā)明中轉(zhuǎn)基因和野生型煙草的抗鋁能力一鋁脅迫后根尖鋁含量分析比較示意 WT為野生型煙草，A5-A9為轉(zhuǎn)基因株系。
具體實施方式
本實施例中采用的試劑主要分為分子生物學實驗試劑、植物遺傳轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)基因植物鑒定和檢測所需的各種試劑。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP等為寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購自博大泰克生物技術(shù)有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑盒、Gateway LR clonase EnzymeMix kit購自invitrogen公司。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。所用儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器。所有引物序列均在大連寶生物公司合成。本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。實施例I -MsALMTI基因cDNA擴增、TA克隆和序列分析 由于模式植物截形苜蓿和紫花苜蓿具有很高的相似性，因此根據(jù)NCBI上公布的截形苜蓿的鋁誘導的蘋果酸通道蛋白的基因序列(#MZ#77，ABD32183)，設(shè)計引物如下
上游引物5' - GGATCCATGGTGTCTGAACCAAATTCAAG-3 ’ (.BamHl)
下游引物5’ - AAGCTTTAGTTAATTATAATAACATGTTG -3’ (.HincIlll)
上游引物5 ’端加GGATCC特征序列，并由此形成及 /TI酶切位點；下游引物3 ’加AAGCTT特征序列，形成Hindi 11酶切位點。鋁敏感性紫花苜蓿YMl經(jīng)鋁處理24 h后，剪取0. Ig根，使用液氮研磨后加入Iml的TRIzoL提取液，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0. 2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min (12000rpm),轉(zhuǎn)移上清液至新管,加入0. 5ml異丙醇,混勻室溫放置IOmin, 4°C離心IOmin (12000rpm),棄上清，沉淀用75%こ醇Iml清洗,4°C離心5min (7500rpm),棄こ酉享真空干燥沉淀或自然晾干，用20 焦碳酸ニこ酯(DEPC)處理水溶解RNA，取I 電泳檢測。使用 M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (TaKaRa)進行 cDNA 的合成，取植物總RNA 約 0. Iii g-5ii g，oligo(dT) 50ng, IOmM dNTP mix I ii 1，用 DEPC 處理水補足至 10 y 1，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于72°C加熱5min，冰浴lOmin，加入反應(yīng)混合物9 yl(5 Xreaction buffer 4 u l,25mM MgCl2 4u 1,0. IM DTT 2 y 1，RNA 酶抑制劑 I y 1)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫2min，加入Iiil M-MuLV ReverseTranscriptase,將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底,25°C保溫20min,然后42°C保溫70min,合成cDNA。以cDNA為模板，用MsALMTI基因上下游特異性引物進行PCR，擴增得到全長MsALMTI的序列(圖3A)。切膠回收并純化#全長基因片段，并將其連接到pMD_18T(大連寶生物公司)載體上(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞(天根生化科技)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒做進ー步的雙酶切并測序和測序。根據(jù)陽性重組質(zhì)粒pMD18-#^Z#77載體兩端的多克隆位點，用BamHl和#iflJIII雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒pMD18-#dZ#77單酶切產(chǎn)物理論上為I. 4kb左右的條帶(圖3B)。測序結(jié)果表明，#
的全長序列為1347 bp，且編碼了一個編碼由448個氨基酸組成的跨膜蛋白(上傳至NCBI的登錄號為⑶550122)。使用 CLUSTAL (http://clustalw. genome, jp)對 MsALMTl 預(yù)測的蛋白與其他已知的抗鋁基因編碼的蛋白如BnALMTl，BnALMT2, AtALMl和TaALMTl序列比對發(fā)現(xiàn)，它們均具有ー個ALMTl結(jié)構(gòu)域，且具有極高的相似性。實施例2 :構(gòu)建中間載體pENTRTM2B_JfcZメ#77用 Hindlll 和 BamHl 雙酶切 pMD18_i&也#77 和 pENTt^-PrbcSiT-ffP 載體(圖 2)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，分別回收pMD18-#dZ#77被切割后產(chǎn)生的#基因片段(約I. 4kb)和pENTR*-PrbcS-*T-ffP被切割后產(chǎn)生的載體片段PENTRTM2B，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試劑盒連接pENTRTM2B和Jfe也#77基因的DNA片斷產(chǎn)生中間載體pENTRTM2B-#dZ#77 (圖2)。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(IO8)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5 a，購自天根生化科技公司)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km，50 ii g/ml)的平板上，于37°C過夜培養(yǎng)，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，選出連接成功的質(zhì)粒載體pENTRTM2B-#dZ#77 (圖4A )。用Hindi 11和BamHl以及SalI和XbaI雙酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產(chǎn)生兩條帶，均分別為約2. 7kb和1.4kb (圖4B)。確認是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pENTRTM2B-#dZ#77。實施例3 :植物表達載體pK2-35S-#dZ#77的構(gòu)建
通過Gateway技術(shù)的LR反敦把MsALMTI亞克隆到植物表達載體pK2GW7 (Gateway的目的載體，比利時VIB/Gent公司)中。具體的做法是用質(zhì)粒抽提試劑盒純化Gateway的目的載體pK2GW7(圖6A)，在Gateway的LR反應(yīng)體系中加pENTRTM2B_i&也#77和pK2GW7各150ng, Iul LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen),混均于 25°C反應(yīng)過夜，通過整合酶的作用把整合到pK2GW7中獲 得#的植物表達載體pK2-35S-#dZ#77(圖5)。用反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5 a，購自天根生化科技公司)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素(Spe，50iig/ml)的平板上，于37°C過夜培養(yǎng)，篩選Spe抗性重組子菌落。從Spe抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，選出大小和對照質(zhì)粒pK2GW7相似的整合成功的質(zhì)粒pK2-35S-i&也#77進行酶切檢測(圖6B)。用Hindlll取BamHl酶切檢測pK2-35S-#WZ#77，酶切結(jié)果得到11. Ikb和I. 4 kb左右的兩條帶(圖7A)。確認是整合成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。PK2GW7攜帯的篩選標記基因為卡那霉素抗性基因(Knf)，這樣可用加有卡那霉素的平板篩選轉(zhuǎn)基因植物。實施例4 用MsALMTI基因的植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
制備農(nóng)桿菌的感受態(tài)細胞，用電脈沖法將上述構(gòu)建好的植物表達載體pK2-35S-MsALMH轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壯觀霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子。取少量質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀(BIO-RAD)滑槽中，用Imm的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參數(shù)進行電擊，電擊后立即取出電轉(zhuǎn)化杯，迅速加入0. 5ml SOC培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到I. 5ml的離心管中；28°C，200rpm搖床培養(yǎng)3_5h ;室溫下，7500rpm離心Imin,棄大部分上清,保留IOOii I將細胞懸??；把農(nóng)桿菌涂布于有壯觀霉素(Spe, 50 u g/ml)的LB固體培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2天獲得單菌落；首先用滅菌牙簽挑取農(nóng)桿菌菌落于20 u I ddH20中，98°C處理5分鐘后取出10 u I農(nóng)桿菌裂解液作為PCR反應(yīng)的模板。PCR檢測pK2-35S-#dZ#77轉(zhuǎn)化結(jié)果，正對照擴增體系模板使用pK2-35S-#dZ#77質(zhì)粒，負對照使用PK2GW7質(zhì)粒，擴增片斷理論長度約為I. 4 kb，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析顯示其片段大小與理論預(yù)測值相符，表明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(圖7B)。實施例5 :用含有#基因植物表達載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草挑取攜帯有質(zhì)粒mHMsALMTl的農(nóng)桿菌單菌落接種于50ml的LB培養(yǎng)基中(含Spe, 100 u g/ml), 180rpm, 28°C培養(yǎng) 24h,待菌液 OD600 至 I. 0 左右，離心 IOmin (3000rpm),沉淀菌體。再用IOml左右的MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心IOmin (3000rpm)，沉淀菌體。重復以上操作2 3次。最后加入一定體積的MS液體培養(yǎng)基重懸浮，使菌體的OD6tltl值為0. 5。制備煙草tabacum cv. Xanth)的無菌苗,通過農(nóng)桿菌介導,用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，進ー步篩選獲得所需的轉(zhuǎn)基因植物。把無菌煙草的葉片切成小片葉盤，在制備好的農(nóng)桿菌菌液中浸染15-20min，用無菌吸水紙吸干后，平鋪于愈傷組織誘導培養(yǎng)基MSI (MS+NAA02. I u g/ml+BAP 0. 02 u g/ml)上黑暗共培養(yǎng)2天，將外植體轉(zhuǎn)移至含卡那霉素(50 u g/ml)的芽誘導培養(yǎng)基MS4 (MS+NAA0. 53 u g/ml+BAPO. 5 u g/ml)上進行芽的誘導，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉(zhuǎn)入含卡那霉素(50 y g/ml)的MS培養(yǎng)基上進行根的誘導。 實施例6 -MsALMTI基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況及轉(zhuǎn)錄水平檢測
為了確認通過卡那霉素篩選的轉(zhuǎn)基因煙草株系確實含有導入的目的基 因的DNA片段，用PCR方法對篩選到的轉(zhuǎn)基因煙草作進ー步的鑒定。首先采用CTAB法提取植物基因組稱取植物葉片IOOmg左右置于I. 5ml離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入900111預(yù)熱到65で的2\0^8緩沖液(!^8-11(1 pH 7. 5 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl I. 4M, CTAB 2%)，65°C度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500 氯仿-異戊醇混合液(24
I)搖勻，4°C離心IOmin (7500rpm)后轉(zhuǎn)移上清至I. 5ml EP管；再次加入500 U I氯仿ー異戊醇混合液(24 1)搖勻，4°C離心IOmin (7500rpm);取出上清置于新的EP管中，加入1/10體積3M pH5. 2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4°C離心20min (12000rpm);棄上清，用75%こ醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖液溶解并降解RNA，獲得的基因組DNA樣品?！?MsALMTI煙草抗性苗基因組作為模板，用MsALMTl基因上下游引物進行PCR擴增檢測#是否插入煙草基因組。擴增產(chǎn)物大小約為I. 4 kb左右，和預(yù)期推測一致，說明目的基因均已插入這些轉(zhuǎn)基因株系的基因組，野生型煙草基因組PCR產(chǎn)物未出現(xiàn)目標條帶(圖8A)。為了進一步檢測目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草株系中的轉(zhuǎn)錄情況，從轉(zhuǎn)基因植物中抽取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后用于RT-PCR分析，檢測MsALMTl基因在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄水平。采用 TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取 RNA,取植物根約 0. Ig,加入 Iml 的 TRIzoL提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0. 2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min (12000rpm),轉(zhuǎn)移上清液至新管,加入0. 5ml異丙醇,混勻室溫放置IOmin, 4°C離心IOmin (12000rpm),棄上清,沉淀用75%こ醇Iml清洗,4°C離心5min (7500rpm),棄こ醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 u I焦碳酸ニこ酯(DEPC)處理水溶解RNA。所獲得的RNA樣品用凝膠電泳檢測質(zhì)量和濃度。使用Reverse Transcriptase進行cDNA的合成,取植物總 RNA 約 0. I ii g-5 u g, oligo (dT) 50ng, IOmM dNTP mix I ii 1，用 DEPC 處理水補足至 10U 1，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65°C加熱5min，冰浴lOmin，加入反應(yīng)混合物9u 1(5 X reaction buffer 4u l,25mM MgCl2 4u 1,0. IM DTT 2u I，RNA 酶抑制劑 I y 1)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°C保溫2min,加入Iul M-MuLV ReverseTranscriptase,將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底,25°C保溫20min,然后42 °C保溫70min，合成cDNA。以cDNA為模板，用MsALMTl基因的上下游引物進行RT-PCR分析，考察轉(zhuǎn)基因煙草中是否有目的基因的轉(zhuǎn)錄物。結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因煙草植株均有目的基因的轉(zhuǎn)錄物，而野生型的煙草則沒有(圖SB)。實施例7 :轉(zhuǎn)基因煙草根系蘋果酸的分泌量測定
選取在MS培養(yǎng)基上生長兩周、大小一致的煙草幼苗,于1/2 MS液體培養(yǎng)基上生長I周后，分別置于15 mL含30iiM AlCl3和不含AlCl3的CaCl2 (0.5 mM/L，pH4. 2)溶液中，置于25°C恒定光照(100 u mol/mVs1)下處理24 h后，收集處理液用于蘋果酸分泌量的測定。將得到的煙草根尖分泌物，使用真空干燥儀真空干燥后，溶于I mL蒸餾水中。將0.35 mL樣品與0. 45 mL緩沖液Tris-HCl (0. I mol/L，pH 9. 0)以及30 y L氧化型輔酶I (NAD)溶液(30 g/L)混合,讀取波長為340 nm處的OD值(Al)。接著加入2 y L蘋果酸脫氫酶懸浮液(16.5 U/iiL)于上述反應(yīng)溶液中并混合均勻。15 min后，讀取340 nm處的OD值A(chǔ)2。根據(jù)樣品和蘋果酸標準溶液吸光度的增加值(A2-A1)計算樣品中蘋果酸的含量。結(jié)果表明，在沒有鋁的情況下，轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)5，A6和A9根系分泌的蘋果酸分別為野生型的2. 92,4. 19和4. 09倍。在鋁處理下，野生型和轉(zhuǎn)基因煙草根尖蘋果酸的分泌均有所増加，轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)5、A6和A9分泌的蘋果酸分別是WT根系的2. 88、3. 56和3. 88倍(圖9)?？梢?，在煙草中過表達基因可以有效的増加鋁脅迫下煙草根系蘋果酸的分泌。實施例8 :鋁脅迫下轉(zhuǎn)基因和野生型煙草的抗鋁能力和根尖鋁含量
選取在MS培養(yǎng)基上生長兩周、大小一致的煙草幼苗,于1/2 MS液體培養(yǎng)基上生長I周后，分別置于15 mL含30 uM AlCl3和不含AlCl3的CaCl2(0. 5 mM/L，pH4. 2)溶液中，使用直尺測定根的長度；隨后置于25°C恒定光照(100 u mol/mVs1)下處理24 h后，使用直尺測定根的長度。每個株系測定9個根尖的長度，相對根伸長率為鋁溶液處理植株的根伸長量/無鋁溶液處理植株的根伸長量。鋁處理結(jié)束后，取根尖稱鮮重后在65°C烘箱烘至衡重，用灰化爐550°C灰化10 h左右，使用Iml濃硝酸溶解過夜，定容至50 ml，使用原子吸收分光光度法測定鋁的含量。結(jié)果表明，鋁處理使野生型煙草的根明顯受到了抑制，其根的RRG僅為未經(jīng)鋁處理的0. 48。而轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)5、A6和A9的RRG與野生型相比分別提高了 I. 58、I. 80和I. 59倍(圖10)。對于根尖鋁含量測定結(jié)果表明，30 ii M處理24 h后，轉(zhuǎn)基因株系A(chǔ)5、A6和A9根尖的鋁含量僅為野生型根尖鋁含量的60%、48%和50%(圖11)?？梢?，是紫花苜蓿中編碼蘋果酸通道蛋白的ー個重要抗鋁基因，在煙草中過表達可以有效的提高轉(zhuǎn)基因煙草對鋁的抗性。
權(quán)利要求
1.紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因#的植物表達載體，其特征在干含鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因MsALMTI。
2.如權(quán)利要求I所述的紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因#的植物表達載體，其特征在于-MsALMTI基因cDNA的上游連接有CaMV 35S組成型啟動子。
3.如權(quán)利要求I所述的紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因#的植物表達載體，其特征在于MsALMTI基因的cDNA來源于紫花苜蓿渝苜一號，GenBank登錄號為⑶550122。
4.權(quán)利要求I所述的紫花苜蓿蘋果酸通道蛋白基因#的植物表達載體在制備降低鋁吸收和抗鋁毒能力增強的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紫花苜蓿鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因的植物表達載體pK2-35S-MsALMT1，其為含有花椰菜花葉病毒的組成型啟動子(35S)和紫花苜蓿鋁誘導的蘋果酸通道蛋白基因MsALMT1的植物表達載體。從紫花苜蓿中擴增出MsALMT1基因，用組成型啟動子控制它在煙草中過量表達，提高煙草抗鋁毒的能力。實驗表明轉(zhuǎn)MsALMT1基因煙草在含有30μM的AlCl3溶液中脅迫生長24h后，轉(zhuǎn)基因煙草的根尖分泌的蘋果酸和抗鋁能力均顯著性高于野生型對照植物，而根尖鋁含量顯著性低于野生型植物。
文檔編號C12N15/82GK102952821SQ20121043799
公開日2013年3月6日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者陳麗梅, 陳奇, 武孔煥, 李昆志, 玉永雄 申請人:昆明理工大學