一種苦豆子水通道蛋白及其編碼基因及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種苦豆子水通道蛋白及其編碼基因及應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域?？喽棺铀ǖ赖鞍椎陌被嵝蛄袨镾EQ ID No.2，編碼苦豆子水通道蛋白的基因，其核苷酸序列為SEQ ID No.1，所述苦豆子水通道蛋白在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用。本發(fā)明能提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性，對豐富抗性基因資源及培育耐鹽大豆品種具有重要意義。
【專利說明】
一種苦豆子水通道蛋白及其編碼基因及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及苦豆子水通道蛋白基因⑶S序列的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 土壤鹽漬化是目前制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)全球性問題，全球約有20%的耕地受到鹽 害威脅，43%的耕地為干旱、半干旱地區(qū)。鹽害嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，造成作物減產(chǎn)，并 使生態(tài)環(huán)境日益惡化。在自然條件下，由于環(huán)境脅迫而嚴(yán)重影響了作物生長發(fā)育，其遺傳潛 力難以發(fā)揮，鹽漬不僅影響了作物的產(chǎn)量，而且限制了植物的廣泛分布，因此，提高作物的 耐鹽能力已成為抗逆育種急需解決的關(guān)鍵問題之一。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù) 的成熟，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物的耐鹽堿性，已在鹽堿土壤改良方面得到廣泛的應(yīng)用。同 時(shí)，以旱生、耐鹽堿植物為研究材料，從中分離克隆得到耐鹽堿性顯著的基因，是獲得抗性 基因資源的有效方法。
[0003] 苦豆子(Sophora alopecuroides.L)為豆科槐屬植物，別名、苦豆草、歐苦參等，為 多年生草本、根莖地下芽旱生耐鹽植物。其耐旱、耐鹽性顯著，是一個(gè)抗性基因豐富的基因 資源庫。因此，從苦豆子中篩選克隆鹽脅迫相關(guān)基因，分析其耐鹽性，闡明其相關(guān)功能，有助 于對抗鹽基因的進(jìn)一步利用。
[0004] 水通道蛋白（aqUap〇rinS，AQPs)是一類能夠高效特異轉(zhuǎn)運(yùn)水分子的膜結(jié)合蛋白， 在多種非生物脅迫下，如干旱、鹽堿、低溫等，植物都會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞水分失衡。胞內(nèi)缺水是脅迫 中常見的生理反應(yīng)，AQPs對水分高效的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，能夠起到維持細(xì)胞滲透平衡，保持細(xì)胞水 分的作用。
[0005] 1988年由Agre等分離到了第一個(gè)AQP蛋白，而后在爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)中證明 了其介導(dǎo)水分運(yùn)輸?shù)墓δ?。AQPs在不同的物種中的結(jié)構(gòu)都比較保守。
[0006] 水通道蛋白中水孔的開閉是通過特異位點(diǎn)上氨基酸的磷酸化和質(zhì)子化來調(diào)控的。 而AQPs水孔的開閉受多種胞外信號的調(diào)控，包括Ca 2+信號、PH、細(xì)胞滲透壓等。同時(shí)，AQPs還 可通過在細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)上的重新定位來調(diào)控其導(dǎo)水率。對擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，AtPIP2;l在 外界鹽脅迫下可從細(xì)胞膜內(nèi)化轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，使得根部的導(dǎo)水率下降，減少水分流失。
[0007] 鹽脅迫初期，植物首先出現(xiàn)的損害是滲透脅迫，此時(shí)植物吸水能力下降，體內(nèi)水分 缺失，此時(shí)AQP基因通過降低表達(dá)量、AQP蛋白通過磷酸化關(guān)閉水孔以及質(zhì)膜上的AQPs蛋白 內(nèi)化來降低質(zhì)膜的通透性，減少滲透失衡下水分的流失。
[0008] 在鹽害脅迫后期，由于細(xì)胞內(nèi)的Na+和cr的積累，造成離子毒害。在對鹽生植物冰 花的研究發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，冰花葉肉細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生一種小液泡，其作用是區(qū)隔化Na+，液泡 膜上存在大量的AQPs，表明AQPs參與到Na+區(qū)隔化過程，進(jìn)而維持細(xì)胞的離子平衡。
[0009] 鹽脅迫條件下，AQPs基因的表達(dá)受到ΑΒΑ的調(diào)控。對番茄噴施ΑΒΑ進(jìn)行處理24h，其 根的導(dǎo)水率顯著升高，同時(shí)番茄根部的多個(gè)AQPs基因表達(dá)量顯著上升。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供一種苦豆子水通道蛋白及其編碼基因及應(yīng)用，能提高植物耐鹽性。 [0011]本發(fā)明苦豆子水通道蛋白，其氨基酸序列為SEQ ID No.2。
[0012] 本發(fā)明編碼苦豆子水通道蛋白的基因，其核苷酸序列為SEQ ID No. 1。
[0013] 本發(fā)明所述苦豆子水通道蛋白在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用。
[0014] 我們利用苦豆子cDNA酵母表達(dá)文庫對苦豆子抗鹽相關(guān)基因進(jìn)行篩選，得到了一鹽 脅迫相關(guān)基因，水通道蛋白基因，命名為SaAQP。
[0015] 在苦豆子中，到目前為止，關(guān)于SaAQP的作用還未見報(bào)道。
[0016] 利用任何一種能夠引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的SaAQP 編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。使用本發(fā)明的 基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟 動(dòng)子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加工，如 加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光素酶基因等）或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉 素、卡那霉素等）。攜帶有本發(fā)明SaAQP的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載 體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將 轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物。本 發(fā)明的基因?qū)μ岣咧参锬望}性，提別是培育耐鹽大豆品種具有重要意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1是SD/-Ura(含NaCl 0.68mol/l)篩選培養(yǎng)基菌落圖；
[0018] 圖2是酵母陽性克??？0?檢測圖，]\1:200(^口1]^冰61'，1-6:酵母擴(kuò)增結(jié)果；
[0019]圖3是SaAQP基因在苦豆子不同組織中的表達(dá)結(jié)果圖；
[0020]圖4是SaAQP基因在NaCl脅迫下的表達(dá)結(jié)果圖；
[0021] 圖5是SaAQP基因的農(nóng)桿菌菌液PCR結(jié)果圖，]\1:200(^口1^11?^，1-5 :5340?基因；
[0022] 圖6A是大豆發(fā)狀根的誘導(dǎo)及⑶S檢測陰性對照圖；
[0023]圖6B是轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根的誘導(dǎo)及GUS檢測圖；
[0024]圖7是轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根中SaAQP基因的qRP-PCR檢測圖，1，2，3為3次重復(fù)，PCHF-1301為陰性對照；
[0025]圖8是帶子葉轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根耐鹽表型圖；
[0026]圖9是帶子葉轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根在不同濃度NaCl脅迫下發(fā)狀根的干重比較圖，*表 示達(dá)到0.05概率顯著水平；
[0027]圖10是離體轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根耐鹽表型圖，左邊:對照（空載），右邊:轉(zhuǎn)基因發(fā)狀 根；
[0028]圖11是離體轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根在不同濃度NaCl脅迫下的濕重比較圖，*表示達(dá)到 〇. 05概率顯著水平**表示達(dá)到0.01概率極顯著水平；
[0029]圖12是離體轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根在不同濃度NaCl脅迫下的存活數(shù)比較圖，*表示達(dá) 到0.05概率顯著水平；
[0030]圖13是轉(zhuǎn)SalAQP基因大豆發(fā)狀根復(fù)合體植株的耐鹽表型圖；
[0031]圖14是轉(zhuǎn)SaAQP基因大豆發(fā)狀根復(fù)合體植株在不同濃度NaCl脅迫下發(fā)狀根的濕重 比較，*表示達(dá)到0.05概率顯著水平。
【具體實(shí)施方式】
[0032] 實(shí)施例1苦豆子SaAQP基因的篩選與克隆
[0033] 選取籽粒飽滿的苦豆子種子10g，加入5ml濃度98%的濃硫酸浸泡處理20min。洗凈 種子后播種于花土中盆栽。培養(yǎng)條件為：16h光照，溫度26°C，濕度65%，光強(qiáng)30000勒克斯。 萌發(fā)四周后，分別將幼苗轉(zhuǎn)移至NaCl濃度為200mmol、Na2C03濃度為140mmol和PEG6000濃度 為8 %的hoagland營養(yǎng)液中分別處理3h，12h，24h，72h。取各處理下的苦豆子根部，分別提取 不同處理?xiàng)l件下苦豆子根的totalRNA。取上述提取的4個(gè)處理的苦豆子根部RNA，等質(zhì)量混 合各組樣品用于cDNA文庫構(gòu)建。提取構(gòu)建完成的cDNA文庫質(zhì)粒，將文庫質(zhì)粒大規(guī)模轉(zhuǎn)化釀 酒酵母INVSC1感受態(tài)細(xì)胞構(gòu)建苦豆子苗期酵母表達(dá)cDNA文庫。利用酵母植物抗逆基因篩選 體系篩選苦豆子抗鹽相關(guān)基因，篩選方法如下：
[0034]取適量文庫菌液（使克隆總數(shù)達(dá)文庫滴度的5-10倍），涂布SD/_Ura(含NaCl 0.68mol/l)篩選平板，30°C倒置培養(yǎng)2-4天至菌落出現(xiàn)，如圖1所示;保存篩選到的酵母菌 株，根據(jù)酵母表達(dá)載體序列設(shè)計(jì)引物，引物為：
[0035]
[0036] 按照表1反應(yīng)和表2程序進(jìn)行PCR檢測：
[0037] 表1PCR反應(yīng)體系
[0038]
[00洲」 表2PCK捏序
[0040]
[0041] 如圖2所示;參照Sangon酵母質(zhì)粒提取試劑盒的方法分別提取上述酵母菌液的質(zhì) 粒，選取大于700的片段提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Ecoli DH5a，保存菌液并進(jìn)行測序，將測序后的序列 去除載體序列，淘汰小于50(^?的序列，利用1^81數(shù)據(jù)庫81&^(11^? :// blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast. cgi?PR0GRAM = b las tn&PAGE_TYPE = Blast Search & LINK_LOC = blasthome)進(jìn)行序列比對分析，得到苦豆子水通道蛋白（SaAQP)基因。由753個(gè) 堿基對組成，讀碼框自5'端第1位到第753位堿基，編碼一個(gè)由250個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白 質(zhì)SaAQP蛋白具有膜內(nèi)在蛋白（MIP)家族結(jié)構(gòu)域，MIPs屬于水通道蛋白的一類蛋白，其N端之 后帶有六條跨膜螺旋，在質(zhì)膜上具有選擇性輸水的作用。說明SaAQP也屬于MIP家族，與MIP 有相似的功能。
[0042] 實(shí)施例2苦豆子SaAQP基因的組織特異性表達(dá)
[0043] 對苦豆子進(jìn)行NaCl鹽脅迫處理，處理方法同實(shí)施例1。處理時(shí)間分別為lh，2h，4h， 8h，12h，24h，48h。取各處理下苦豆子根部，同時(shí)取在hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)的苦豆子的根、 莖、葉。參照sangon公司的柱式植物總RNA抽提純化試劑盒提取處理材料的總RNA，經(jīng)1 %瓊 脂糖電泳檢測RNA的完整性。cDNA的合成按照Reverse Transcriptase M_MLV(RNase H-)的 說明書進(jìn)行。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對SaAQP基因在苦豆子不同組織及不同鹽處理時(shí)間根中 的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)操作按照sangong公司SGExcel FastSYBR Mixture(With R0X) 說明書在在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI 7500中進(jìn)行。以苦豆子Lectin為內(nèi)參基因，引物如下：
[0044]
[0045] PCR反應(yīng)體系及程序如表3:
[0046] 表3PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序
[0047]
[0048]
[0049] 采用2_ΛΛετ法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對表達(dá)量。試驗(yàn)共設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，3次生物 學(xué)重復(fù)。
[0050] 結(jié)果（圖3)表明SaAQP基因在苦豆子的根、莖尖、葉片中均有表達(dá)，其中，根中的表 達(dá)量最高，其他組織表達(dá)量相對較低，SaAQP基因在莖尖中的表達(dá)量最低，絕大多數(shù)AQPs蛋 白都定位于植物根系的質(zhì)膜上，故SaAQP基因在根中的表達(dá)量顯著高于其他組織。同時(shí) SaAQP基因的表達(dá)水平在鹽處理lh就迅速上升，4h達(dá)到最大，之后迅速下降。（圖4)。這是由 于SaAQP基因的表達(dá)受ΑΒΑ的調(diào)控，在鹽脅迫條件下，植物根系能在很短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量 的ΑΒΑ，受ΑΒΑ調(diào)控的基因的表達(dá)量也隨之變化。
[0051 ]實(shí)施例3SaAQP在大豆中的表達(dá)及對耐鹽性的分析
[0052]構(gòu)建植物表達(dá)載體pCHF-1301-SaAQP。采用發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化 將植物表達(dá)載體pCHF-1301-SaAQP(圖5)轉(zhuǎn)化大豆吉林35,并對轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根進(jìn)行⑶S 表達(dá)檢測，同時(shí)檢測陽性植株中目的基因表達(dá)量，并對轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根的耐鹽性進(jìn)行分 析。具體方法及結(jié)果如下：
[0053] 3.1大豆發(fā)根的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選 [0054] 1)植物材料的處理
[0055]選取飽滿、無病害的大豆吉林35種子，平放于培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于密閉的干燥 器中，并在干燥器中放入一加有96mlNaC10和4ml濃HC1的燒杯，Cl2滅菌14-hl6h。
[0056] 2)大豆種子發(fā)芽
[0057]取上述滅菌的大豆吉林35種子，接種于發(fā)芽培養(yǎng)基上，于16h光照，溫度26°C，濕度 65%，光強(qiáng)30000勒克斯的組培室發(fā)芽4-6天。
[0058] 3)侵染菌液的配制
[0059] i .從-80 °C冰箱中取出保存的發(fā)根農(nóng)桿菌K599 (載體分別為pCHF-1301 -SaAQP和 pCHF-1301)，在YEP(含 1 OOμg/mlKan)固體平板上劃線，28 °C 培養(yǎng)24h;
[0060] ii.挑取平板上的單菌落，接種于50ml YEP(含100μg/mlKan)液體培養(yǎng)基中， 250rpm，28 °C 振蕩培養(yǎng) 8h-l Oh，使 0D6QQ = 0 · 8-1 · 0;
[0061 ] iii.取培養(yǎng)好的菌液5ml，加入到500ml YEP(含100μg/mlKan)液體培養(yǎng)基中， 250rpm，28 °C振蕩培養(yǎng)4h-6h，使OD600 = 0.6-0.8，該菌液為侵染菌液。
[0062] 4)大豆的侵染及發(fā)狀根的誘導(dǎo)
[0063] a大豆子葉節(jié)轉(zhuǎn)化
[0064] i.選取上述發(fā)芽良好的大豆吉林35種子，輕輕剝?nèi)シN皮，切掉部分胚根，留取3-5mm下胚軸；
[0065] ii.沿下胚軸豎直從中間將兩片子葉切開，去掉子葉，用手術(shù)刀沿子葉節(jié)處平行劃 傷10次，然后將外植體置于上述侵染菌液中浸泡侵染30min;
[0066] iii.將外植體從侵染菌液中取出，內(nèi)面向下平放于墊有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中， 于16h光照，溫度26°C，濕度65%，光強(qiáng)30000勒克斯的組培室共培養(yǎng)4-5天。
[0067] iv.將共培養(yǎng)后的外植體用根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基清洗3-4次，再浸泡30min，然后用濾 紙吸取外植體表面液體，用手術(shù)刀去除芽，使外植體內(nèi)面向上，傾斜45°斜插入根誘導(dǎo)固體 培養(yǎng)基中，于16h光照，溫度26°C，濕度65%，光強(qiáng)30000勒克斯的組培室培養(yǎng)15天。
[0068] b大豆復(fù)合體植株轉(zhuǎn)化
[0069] i.選取上述發(fā)芽良好的大豆吉林35種子，輕輕剝?nèi)シN皮，切掉部分胚根，留取3-5mm下胚軸；
[0070] ii.用手術(shù)刀在子葉下胚軸中間切十字2-3次，然后將外植體置于上述侵染菌液中 浸泡侵染30min;
[0071] iii.將外植體從侵染菌液中取出，內(nèi)面向下平放于墊有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基中， 于16h光照，溫度26°C，濕度65%，光強(qiáng)30000勒克斯的組培室共培養(yǎng)4-5天。
[0072] iv.將共培養(yǎng)后的外植體用根誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基清洗3-4次，再浸泡30min，然后用濾 紙吸取外植體表面液體，將外植體胚根向下，豎直插入到根誘導(dǎo)固體培養(yǎng)基中，于16h光照， 溫度26°C，濕度65%，光強(qiáng)30000勒克斯的組培室培養(yǎng)15天。
[0073] 3.2轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根GUS表達(dá)檢測
[0074] 隨機(jī)選取部分發(fā)狀根，用X-Gluc染色，37 °C黑暗染色12-14h，用70 %的乙醇脫色數(shù) 次，檢測GUS基因的表達(dá)。圖6A，圖6B為裝SaAQP基因的大豆發(fā)狀根的⑶S染色鑒定結(jié)果。結(jié)果 表明，SaAQP基因已在大豆發(fā)狀根中表達(dá)。
[0075] 3.3轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根的目的基因的表達(dá)檢測
[0076]選取上述GUS檢測為陽性的轉(zhuǎn)SaAQP基因外植體發(fā)狀根和轉(zhuǎn)化pCHF-1301的發(fā)狀 根，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qRT-PCR檢測目的基因的表達(dá)量，內(nèi)參為大豆β-actin，方 法參照實(shí)施例2。結(jié)果如圖7所示，與轉(zhuǎn)化pCHF-1301的對照相比，SaAQP在轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中表 達(dá)量均有顯著提高，說明SaAQP已成功轉(zhuǎn)入大豆中。
[0077] 3.4轉(zhuǎn)SaAQP基因大豆發(fā)狀根的耐鹽性分析
[0078] 1)帶子葉轉(zhuǎn)SaAQP基因大豆發(fā)狀根耐鹽性分析
[0079]發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后的大豆外植體于根誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5-7天，將有發(fā)根跡象的 子帶葉外植體和對照轉(zhuǎn)移至含有不同濃度NaCl的固體MS (含16mg/L潮霉素)培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 15天后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果顯示，隨著NaCl濃度的增加，轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根的生長情況要優(yōu)于對 照組，并且發(fā)狀根的干重也顯著高于對照；而當(dāng)NaCl濃度達(dá)到達(dá)到200mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)SaAQP基 因的發(fā)狀根的生長受到抑制，難易誘導(dǎo)產(chǎn)生正常的發(fā)狀根，且外植體失綠變黃。見圖8和圖 9〇
[0080] 2)離體轉(zhuǎn)SaAQP基因大豆發(fā)狀根耐鹽性分析
[0081]將檢測為陽性的轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根培養(yǎng)于不同濃度NaCl的固體MS(含16mg/L潮霉 素)培養(yǎng)基中，處理15天后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在較低濃度(濃度在50mmol/L以下）的 NaCl處理時(shí)，轉(zhuǎn)SaAQP基因的發(fā)狀根的生長狀況于對照相比并無顯著差異，隨著NaCl濃度的 升高，轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的生長及濕重均明顯高于對照，見圖10;轉(zhuǎn)SaAQP基因的發(fā)狀根的濕重 增長最為顯著，濕重增量是對照的3倍，見圖11。而當(dāng)NaCl濃度達(dá)到200mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)基因發(fā) 狀根與對照的生長均受到抑制，但轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根的存活率均顯著高于對照，轉(zhuǎn)SaAQP基因的 發(fā)狀根存活率為38.4%，對照組的存活率為15.6%，見圖12。
[0082] 3)轉(zhuǎn)SaAQP基因大豆發(fā)狀根復(fù)合體植株的耐鹽性分析
[0083]將發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的整個(gè)大豆雙子葉外植體培養(yǎng)于不同濃度NaCl的固體MS(含 16mg/L潮霉素)培養(yǎng)基中，處理30天后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)。當(dāng)NaCl濃度為50、100、150mmol/L時(shí)， 轉(zhuǎn)SaAQP基因的發(fā)狀根植物復(fù)合體的長勢均好于對照，見圖13;在NaCl濃度為100、150mmo 1 / L脅迫條件下，SaAQP基因的發(fā)狀根植物復(fù)合體的濕重均顯著高于對照。見圖14。
[0084]我們對轉(zhuǎn)SaAQP基因的大豆發(fā)狀根進(jìn)行鹽脅迫處理，分析其對大豆根系耐鹽的影 響，結(jié)果表明，SaAQP基因在發(fā)狀根中的過表達(dá)均使得轉(zhuǎn)基因大豆發(fā)狀根表現(xiàn)出了一定的耐 鹽性。對轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根在不同濃度鹽脅迫條件下發(fā)狀根的生長狀態(tài)、存活率、增重等進(jìn)行了 統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，在NaCl濃度為100、150mmol/L時(shí)，其生長狀態(tài)良好，耐鹽效果顯著;在NaCl 濃度為200mmol/L時(shí)，雖然其生長受到抑制，但存活率顯著高于對照。說明SaAQP和基因的過 表達(dá)均能不同程度的提高轉(zhuǎn)基因植物的耐鹽性。 序列表 <110，吉林大學(xué) <120〉一種苦豆子水通道蛋白及其編碼基因及應(yīng)用 <13Q> j1uwangqy-2016D1 <160> 2 <170> Patentln version 3：. 3 <21:〇> 1 <2U> 7.53 <212> DNA <213〉苦豆子永通道蛋白.基因 CDS. <400) 1 atgccgatca gaaacatcgc aatcggaagg cccgaagagg caattcaccc agacacgttg 60 aaggcaggtc tagctgagtt Gatttecacc c^teatctttg tcttcgctgg ctcaggctCG 120
[0085] ggcatcgctt acaacaagct caccgacgat gcccccgcca gccctgcagg actcatctcc 180 gcctcgattg cccatgcatt cgccetcttc gtcgccgtct ccgtcggtgc caacatctcc 240 ggtggccacg tcnnccccgc cgtcaretto ggagccttcc tcggcgggaa, catcarcttc 300 cttcgtggca tcgtttacat catcgttcag ctccttggct ccatcgtcgc ctccttgctc 360 ctcgagttcg tcaccggact tggxgttcca gcattcgggc tttctgctgg agttggtgtt 420 gggaacgcgt tggtgctgga gatcgtgatg actttcggtt tggtttacac agtttacgcc 480 aGagccg'ttg atcccaagaa gggtagttt.g ggaactattg GG〇c€atGgG tattggtttc 540 atcgttggtg ctaacatctt ggtgggtggg gctttcagtg gagcatccat gaacccagcc 600 gtgtctttcg gacctgctct tgtgagctgg acctgggcca accactggat ctactgggtt 660 gggcctctcg ttggtggtgg gcttgctggg cttgtctacg atcttctctt tatcaacaat 720 accoatgaac agctcececa gactgattac tag ?53 <210> 2 <21i> 250 <212> PRT <213〉苦豆子水通道蛋白 <400) 2 Met Pro lie Arg Asn lie Ala lie Gly Arg Pro Olu Glu ila lie His 1 .5 1.0 15 Pro Asp Thr Leu Lys Ala G]y Leu Ala Glu P：he lie Ser Thr Leu lie 20 25 30 Phe ￥al Pbe Ala Gly Ser Gly Ser Gly lie Ala, Tyr Asn Lys： Leu Thr 35 40 45 Asp Asp Ala Pro Ala Ser Pro Ala Gly Leu lie Ser Ala Ser lie Ala 50 55 60 His： Ala Phe Ala Leu Phe ￥al Ala Val Ser Val Gly Ala Asn lie Ser 65 70 75 80 Gly Gly His Val Asn Pro Ala Val Thr Phe Gly Ala Phe Leu Gly Gly 85 90 95
[0086] Asn. .il.e Thr Phe Leu Arg Gly 丄le Val Tyr 丄丄e 丄ie 'Val _(Urt Le'u Leu 100 105 110 Gly Ser lie Val Ala Ser L@u Leu Leu Glu Phe ￥al Thr Gly Leu Gly 115 120 125 Val Pro Ala Phe Gly Lau Ser Ala Gly Val Gly: Val Gly Asn Ala Leu 130 135 110 Val Leu Glu lie Val Met Thr Phe Gly Leu Val Tyr Thr Yal Tyr Ala 145 150 155 16:0 Thr Ala Val Asp Pro Lys Lys Gly Ser Leu Gly Thr He Ala Pro lie 1：65 170 175 Ala lie Gly Phe Ho Yal Gly Ala Asn lie Lgu fal Gly Gly Ala Phe 180 185 190 Ser Gly Ala Ser Met Asn Pro Ala Val Ser Phe Gly Pro Ala Leu Val 195 2：Q0 205 ：Se；r Trp Thr Trp Ala Asn His Trp He Tyr Trp Val G1K Pro Leu Val 210 215 2：2D Gly Gly Gly Leu Ala Gly Leu: ￥al Tyr: Asp Leu: Leu Phe: I:l.e Asn. Asn [0087] 225 230 235 240 Thr His Glu Gin Leu Pro Gin Thr Asp： Tyr 245 250
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種苦豆子水通道蛋白，其特征在于:其氨基酸序列為SEQ ID No.2。2. -種編碼苦豆子水通道蛋白的基因，其特征在于:其核苷酸序列為SEQ ID No.1。3. 如權(quán)利要求1所述的苦豆子水通道蛋白在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/29GK105906695SQ201610388727
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】王慶鈺, 郭文云, 劉雅婧, 王英, 李景文, 閆帆, 趙明珠, 尹智超, 王天亮, 申梓邑
【申請人】吉林大學(xué)