專利名稱：利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物多糖的發(fā)酵，特別是指一種利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法。
背景技術(shù)：
膠凍樣類芽孢桿菌為土壤芽孢桿菌，其菌落圓形，無色，隆起，膠質(zhì)粘稠，透明或半透明，邊緣整齊。在過去的幾十年中被作為微生物肥料的主要功能菌株被開發(fā)利用，其在農(nóng)用微生物制劑領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用。近年來隨著對(duì)膠質(zhì)類芽孢桿菌研究的不斷深入，人們開始注意其胞外多糖的研究及應(yīng)用。但熱點(diǎn)依然集中在對(duì)膠質(zhì)芽孢桿菌產(chǎn)多糖成分的分析及多糖對(duì)硅酸鹽礦物的分解能力方面。對(duì)其多糖新的應(yīng)用領(lǐng)域及優(yōu)化工藝增加多糖產(chǎn)量方面的研究還較少。目前人們對(duì)微生物多糖產(chǎn)生的傳統(tǒng)工藝主要是轉(zhuǎn)接斜面法活化斜面菌·種，優(yōu)化搖瓶發(fā)酵工藝參數(shù)等常規(guī)步驟，利用上述方法生產(chǎn)的發(fā)酵液中多糖的產(chǎn)量水平為3_5g/L。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵液中的微生物多糖含量高的利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法。本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是
利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法，是將膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus )ACCC10013接種于含有碳源及氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,包括如下工藝步驟
A、菌種熱刺激
在無菌條件下將試管斜面中的菌種孢子加入無菌水，振蕩洗下孢子制成孢子懸液并置于無菌容器中，將裝有孢子懸液的無菌容器置于沸水中，均勻加熱，1-10分鐘后將無菌容器取出并迅速冷卻；
B、發(fā)酵
BI、培養(yǎng)基的配制
配制培養(yǎng)基并滅菌，將其冷卻至30°C，培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成
淀粉5%-20%，蔗糖5%-10%，硫酸銨O. 5%-5%，磷酸氫二鉀10%_20%，硫酸鎂5%_10%，三氯化鐵O. 01%-0· 5%，碳酸鈣O. 1%-5%，酵母膏O. 1%_3%，余量為無菌水，pH=7. 5 ；
B2、培養(yǎng)
將步驟A中處理后的菌種接種于步驟B制備的培養(yǎng)基中，發(fā)酵周期為60小時(shí)，培養(yǎng)溫度30°C，接種量為菌種滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為8% ;風(fēng)量調(diào)節(jié)為0-4小時(shí)通風(fēng)比(通風(fēng)比為發(fā)酵液體積每分鐘通入空氣的體積,下同。)為1:0. 2-0. 5VVM,4-12小時(shí)通風(fēng)比為 1:0. 5-0. 7VVM，12-20 小時(shí)通風(fēng)比為 1:0. 7-0. 9VVM，20-36 小時(shí)通風(fēng)比為 1:1. 1-1. 5VVM,28-36小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 5-0. 7VVM，36-60小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 3-0. 5VVM，結(jié)束培養(yǎng)，在培養(yǎng)36小時(shí)之后補(bǔ)料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉I-IOml。本發(fā)明中的具體技術(shù)內(nèi)容還有
無菌容器可以選用包括但不局限于試管或其他便于加熱的容器，為便于無菌容器的加熱，優(yōu)選的技術(shù)方案是，步驟A中的無菌容器選用試管。均勻加熱可以采用多種現(xiàn)有方式，均不脫離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，其中較為優(yōu)選的技術(shù)方案是，步驟A中的均勻加熱采用邊加熱邊振蕩的方式進(jìn)行。將無菌容器取出并迅速冷卻是采用冷水將無菌容器冷卻。步驟B中裝料量為50升小罐裝料38升。
本發(fā)明所具備的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的技術(shù)進(jìn)步在于
I、將熱刺激后的菌種用結(jié)晶紫染色，涂片，鏡檢發(fā)現(xiàn)弱菌及一些較弱的芽孢減少了，芽孢較整齊，著色較深，在50升小罐上進(jìn)行發(fā)酵的表現(xiàn)是芽孢萌發(fā)快，生長延遲期縮短，減少了總的發(fā)酵時(shí)間，且菌體生長同步性好有利于后邊的工藝控制，比如表面活性劑的加入。2、膠質(zhì)類芽孢桿菌在營養(yǎng)貧乏時(shí)產(chǎn)生大量的莢膜，其能達(dá)到菌體大小的5-10倍，本發(fā)明在發(fā)酵過程中采取了波段培養(yǎng)的方法，即在培養(yǎng)的前期給菌種很好的生長環(huán)境以提高其生物量，在發(fā)酵培養(yǎng)的后期，嚴(yán)格控制溶氧并加入表面活性劑，創(chuàng)造營養(yǎng)貧乏的環(huán)境同時(shí)改變細(xì)胞膜的通透性使其在發(fā)酵液大量積累多糖，以達(dá)到提高多糖產(chǎn)量的目的。3、發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定多糖含量。檢測(cè)方法為蒽酮比色法，其含量最高可達(dá)7. 5g/L，與目前報(bào)道工藝比較可提高產(chǎn)糖量10-50%。4、發(fā)酵產(chǎn)生的發(fā)酵液用sevag法進(jìn)行初步的提取分離之后進(jìn)行紫外掃描檢測(cè)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其基本不含核酸和蛋白質(zhì)。并初步測(cè)得其含有豐富的羥基和羧基，而且此多糖的粘度高，與黃原膠粘度相仿，且其具有很好的假塑性和懸浮性，將其應(yīng)用到高檔陶瓷制作上，發(fā)現(xiàn)很少量的此多糖可以產(chǎn)生很好的作用，提高陶瓷表面的光潔度，提高成品率，提升產(chǎn)品檔次，能產(chǎn)生很好的經(jīng)濟(jì)效益。但相對(duì)于黃原膠此多糖的發(fā)酵時(shí)間短，發(fā)酵后期對(duì)氧的需求較少，減少了由于發(fā)酵液粘度增加引起的通氣攪拌電能消耗，省去特殊的設(shè)備要求?？蛇@為膠質(zhì)芽孢桿菌產(chǎn)多糖的應(yīng)用開創(chuàng)了很好的領(lǐng)域。另外，由于其具有的高粘度，假塑性和懸浮性等特性，其還可以在石油勘探，礦物浮選方面也有很好的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例作進(jìn)一步及描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求記載的內(nèi)容為準(zhǔn)，任何依據(jù)說明書作出的等效技術(shù)手段替換，均不脫離本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例I
利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法，是將膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus ) ACCC10013接種于含有碳源及氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，包括如下工藝步驟
A、菌種熱刺激
在無菌條件下將試管斜面中的菌種孢子加入無菌水，振蕩洗下孢子制成孢子懸液并置于無菌容器中，將裝有孢子懸液的無菌容器置于沸水中，均勻加熱，I分鐘后將無菌容器取出并迅速冷卻；B、發(fā)酵
BI、培養(yǎng)基的配制
配制培養(yǎng)基并滅菌，將其冷卻至30°C，培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成
淀粉5%，蔗糖5%，硫酸銨0. 5%，磷酸氫二鉀10%，硫酸鎂5%，三氯化鐵0. 01%,碳酸鈣0. 1%，酵母膏0. 1%，余量為無菌水，pH=7. 5 ；
B2、培養(yǎng)
將步驟A中處理后的菌種接種于步驟B制備的培 養(yǎng)基中，發(fā)酵周期為60小時(shí)，培養(yǎng)溫度30°C，接種量為菌種滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為8% ;風(fēng)量調(diào)節(jié)為0-4小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 2VVM, 4-12小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 5VVM，12-20小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 7VVM, 20-36小時(shí)通風(fēng)比為1:1. 1VVM，28-36小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 5VVM，36-60小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 3VVM，結(jié)束培養(yǎng)，在培養(yǎng)36小時(shí)之后補(bǔ)料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉1ml。步驟A中的無菌容器選用試管。步驟A中的均勻加熱采用邊加熱邊振蕩的方式進(jìn)行。將無菌容器取出并迅速冷卻是采用冷水將無菌容器冷卻。步驟B中裝料量為50升小罐裝料38升。發(fā)酵結(jié)束后，采用蒽酮比色法測(cè)定發(fā)酵液中的多糖含量。其含量可達(dá)6. 85g/L。實(shí)施例2
本實(shí)施例中步驟A中將無菌容器均勻加熱10分鐘后，將無菌容器取出并迅速冷卻；
B、發(fā)酵
BI、培養(yǎng)基的配制
配制培養(yǎng)基并滅菌，將其冷卻至30°C，培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成
淀粉20%，蔗糖10%，硫酸銨5%，磷酸氫二鉀20%，硫酸鎂10%，三氯化鐵0. 5%，碳酸鈣5%，酵母膏3%，余量為無菌水，pH=7. 5 ；
B2、培養(yǎng)
將步驟A中處理后的菌種接種于步驟B制備的培養(yǎng)基中，發(fā)酵周期為60小時(shí)，培養(yǎng)溫度30°C，接種量為菌種滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為8% ;風(fēng)量調(diào)節(jié)為0-4小時(shí)通風(fēng)比為I:. 5VVM，4-12小時(shí)通風(fēng)比為I: 0. 7VVM, 12-20小時(shí)通風(fēng)比為1: 0. 9VVM，20-36小時(shí)通風(fēng)比為I: I. 5VVM, 28-36小時(shí)通風(fēng)比為I: 0. 7VVM, 36-60小時(shí)通風(fēng)比為I: 0. 5VVM，結(jié)束培養(yǎng)，在培養(yǎng)36小時(shí)之后補(bǔ)料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉10ml。其余內(nèi)容同實(shí)施例I。發(fā)酵結(jié)束后，采用蒽酮比色法測(cè)定發(fā)酵液中的多糖含量。其含量可達(dá)7. 2g/L。實(shí)施例3
本實(shí)施例的步驟將裝有孢子懸液的無菌容器置于沸水中均勻加熱，8分鐘后將無菌容器取出并迅速冷卻；
B、發(fā)酵
BI、培養(yǎng)基的配制
配制培養(yǎng)基并滅菌，將其冷卻至30°C，培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成
淀粉15%，蔗糖8%，硫酸銨3%，磷酸氫二鉀15%，硫酸鎂8%，三氯化鐵0. 3%，碳酸鈣3%，酵母膏1%，余量為無菌水，pH=7. 5 ；B2、培養(yǎng)
將步驟A中處理后的菌種接種于步驟B制備的培養(yǎng)基中，發(fā)酵周期為60小時(shí)，培養(yǎng)溫度30°C，接種量為菌種滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為8% ;風(fēng)量調(diào)節(jié)為0-4小時(shí)通風(fēng)比為I: 0. 3VVM，4-12小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 6 VVM, 12-20小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 8VVM，20-36小時(shí)通風(fēng)比為1:1. 3VVM，28-36小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 6VVM，36-60小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 4VVM，結(jié)束培養(yǎng)，在培養(yǎng)36小時(shí)之后補(bǔ)料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉8ml。其余內(nèi)容同實(shí)施例I。發(fā)酵結(jié)束后，采用蒽酮比色法測(cè)定發(fā)酵液中的多糖含量。其含量可達(dá)7. 5g/L。實(shí)施例4
本實(shí)施例的步驟將裝有孢子懸液的無菌容器置于沸水中均勻加熱，6分鐘后將無菌容 器取出并迅速冷卻；
B、發(fā)酵
BI、培養(yǎng)基的配制
配制培養(yǎng)基并滅菌，將其冷卻至30°C，培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成
淀粉8%，蔗糖6%，硫酸銨1%，磷酸氫二鉀13%，硫酸鎂7%，三氯化鐵0. 1%，碳酸鈣1%，酵母膏0. 5%，余量為無菌水，pH=7. 5 ；
B2、培養(yǎng)
將步驟A中處理后的菌種接種于步驟B制備的培養(yǎng)基中，發(fā)酵周期為60小時(shí)，培養(yǎng)溫度30°C，接種量為菌種滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為8% ;風(fēng)量調(diào)節(jié)為0-4小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 3VVM, 4-12小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 6VVM, 12-20小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 8VVM, 20-36小時(shí)通風(fēng)比為1:1. 3VVM，28-36小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 6VVM，36-60小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 5VVM，結(jié)束培養(yǎng)，在培養(yǎng)36小時(shí)之后補(bǔ)料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉3ml。其余內(nèi)容同實(shí)施例I。發(fā)酵結(jié)束后，采用蒽酮比色法測(cè)定發(fā)酵液中的多糖含量。其含量可達(dá)7. Og/L。實(shí)施例5
本實(shí)施例的步驟將裝有孢子懸液的無菌容器置于沸水中均勻加熱，3分鐘后將無菌容器取出并迅速冷卻；
B、發(fā)酵
BI、培養(yǎng)基的配制
配制培養(yǎng)基并滅菌，將其冷卻至30°C，培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成
淀粉18%，蔗糖9%，硫酸銨0. 6%，磷酸氫二鉀18%，硫酸鎂9%，三氯化鐵0. 07%,碳酸鈣0. 9%，酵母膏0. 8%，余量為無菌水，pH=7. 5 ；
B2、培養(yǎng)
將步驟A中處理后的菌種接種于步驟B制備的培養(yǎng)基中，發(fā)酵周期為60小時(shí)，培養(yǎng)溫度30°C，接種量為菌種滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為8% ;風(fēng)量調(diào)節(jié)為0-4小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 4VVM，4-12小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 6VVM, 12-20小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 85VVM，20-36小時(shí)通風(fēng)比為1:1. 45VVM，28-36小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 6VVM，36-60小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 35VVM，結(jié)束培養(yǎng)，在培養(yǎng)36小時(shí)之后補(bǔ)料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉9ml。其余內(nèi)容同實(shí)施例I。
發(fā)酵結(jié)束后，采用蒽酮比色法測(cè)定發(fā)酵液中的多糖含量。其含量 可達(dá)6. 95g/L。
權(quán)利要求
1.利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法，是將膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus )ACCC10013接種于含有碳源及氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵,其特征在于包括如下工藝步驟 A、菌種熱刺激 在無菌條件下將試管斜面中的菌種孢子加入6ml無菌水，振蕩洗下孢子制成孢子懸液并置于無菌容器中，將裝有孢子懸液的無菌容器置于沸水中，均勻加熱，ι- ο分鐘后將無菌容器取出并迅速冷卻； B、發(fā)酵 BI、培養(yǎng)基的配制 配制培養(yǎng)基并滅菌，將其冷卻至30°C，培養(yǎng)基由如下質(zhì)量百分?jǐn)?shù)的組分組成 淀粉5%-20%，蔗糖5%-10%，硫酸銨O. 5%-5%，磷酸氫二鉀10%_20%，硫酸鎂5%_10%，三氯化鐵O. 01%-0· 5%，碳酸鈣O. 1%-5%，酵母膏O. 1%_3%，余量為無菌水，pH=7. 5 ； B2、培養(yǎng) 將步驟A中處理后的菌種接種于步驟B制備的培養(yǎng)基中，發(fā)酵周期為60小時(shí)，培養(yǎng)溫度30°C，接種量為菌種滅菌后培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比為8% ;風(fēng)量調(diào)節(jié)為0-4小時(shí)通風(fēng)比為 1:0. 2-0. 5VVM,4-12 小時(shí)通風(fēng)比為 1:0. 5-0. 7VVM, 12-20 小時(shí)通風(fēng)比為 1:0. 7-0. 9VVM,20-36小時(shí)通風(fēng)比為1:1. 1-1. 5VVM，28-36小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 5-0. 7VVM, 36-60小時(shí)通風(fēng)比為1:0. 3-0. 5VVM，結(jié)束培養(yǎng)，在培養(yǎng)36小時(shí)之后補(bǔ)料流加表面活性劑十二烷基磺酸鈉I-IOml。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的步驟A中的無菌容器選用試管。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的步驟A中的均勻加熱采用邊加熱邊振蕩的方式進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的將無菌容器取出并迅速冷卻是采用冷水將無菌容器冷卻。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法，其特征在于所述的步驟B中裝料量為50升小罐裝料38升。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物多糖的發(fā)酵，特別是指一種利用膠質(zhì)類芽孢桿菌生產(chǎn)微生物多糖發(fā)酵液的方法。是將膠質(zhì)類芽孢桿菌接種于含有碳源及氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，通過菌種熱刺激和在發(fā)酵過程中添加表面活性劑等方式優(yōu)化生產(chǎn)工藝，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的發(fā)酵液中多糖的產(chǎn)量低的問題，具有發(fā)酵液中多糖產(chǎn)量高、菌體生長好、發(fā)酵周期短等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102952834SQ20121042510
公開日2013年3月6日 申請(qǐng)日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者陳文杰, 章淑艷, 魏亞新, 李軍, 秦艷梅, 趙從波, 韓濤, 王云鵬, 古述江, 劉麗娜 申請(qǐng)人:河北省微生物研究所