專利名稱：一種微生物多糖及其生產(chǎn)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵的方法合成所需化合物，具體屬于一種微生物多糖及其生產(chǎn)方法，以及該多糖的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
自然界的生物多糖來自植物、動物和微生物，根據(jù)其生物學(xué)功能可分為貯存多糖、結(jié)構(gòu)多糖和具有特殊功能的多糖，許多研究表明，各類多糖在生命活動中都發(fā)揮著十分重要的作用。近些年來，活性多糖，尤其是微生物活性多糖成為科學(xué)研究和應(yīng)用開發(fā)的熱點(diǎn)，微生物活性多糖，除了其對微生物自身的生物學(xué)意義外，更重要是它的特殊結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，決定了它在人們生活和生產(chǎn)中具有廣泛而重要的用途，依照其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的不同，分別作為免疫功能增強(qiáng)劑、食品添加劑、增稠劑、懸浮劑和化工凝固劑、潤滑劑、絮凝劑、凝膠劑等，廣泛用于醫(yī)藥、食品、石油、輕工、化工等多個領(lǐng)域，在經(jīng)濟(jì)建設(shè)與人民生活中發(fā)揮著重要作用。
目前，國內(nèi)外對于微生物活性多糖的研究主要集中在開發(fā)生產(chǎn)菌株、探索代謝途徑、構(gòu)建基因工程菌、創(chuàng)建發(fā)酵工藝及調(diào)控方法、測定產(chǎn)品結(jié)構(gòu)與性能、鑒定產(chǎn)品生物活性、研究產(chǎn)品構(gòu)效關(guān)系等方面，并且已經(jīng)取得了較大進(jìn)展。
微生物多糖主要包括真菌多糖和細(xì)菌多糖。真菌多糖的研究始于20世紀(jì)50年代，60年代以后因其具有免疫促進(jìn)作用而引起人們的興趣，隨后人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)它具有更多的生物活性，不僅可以抗病菌、抗病毒、預(yù)防和治療腫瘤與艾滋病等，還可以抗輻射、抗凝血、降血糖等調(diào)節(jié)人體生理功能。尤其在治療免疫功能低下癥、癌癥和艾滋病方面取得了令人鼓舞的臨床效果。許多真菌活性多糖，如香菇多糖、茯苓多糖、云芝多糖、裂褶菌多糖等已被開發(fā)，一些已被臨床采用，一些正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。
已開發(fā)的細(xì)菌多糖種類遠(yuǎn)比真菌多糖要少得多，且主要集中在細(xì)菌胞外多糖方面。至于細(xì)菌胞內(nèi)多糖，目前僅進(jìn)行基礎(chǔ)理論研究。與真菌多糖相比，細(xì)菌胞外多糖是通過液態(tài)深層發(fā)酵的方式來生產(chǎn)，呈現(xiàn)出周期短，產(chǎn)量高，規(guī)模大和產(chǎn)品用途廣等特點(diǎn)。
近些年來，已經(jīng)用于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)菌胞外多糖主要有黃原膠(Xanthan gum)、熱凝多糖(Curdlan)和結(jié)冷膠(Gellan gum)，它們在采油、輕工業(yè)、印染、造紙、紡織、陶瓷、涂料等行業(yè)均具有重要用途。
有關(guān)細(xì)菌多糖的生物活性作用，近年來陸續(xù)開始有些報道。在Chin J MicrobiolImmunol，13(6)442(2003)中報道了一種乳酸菌胞外多糖具有增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能的作用。在微生物學(xué)報，43(2)251(2003)中報道了一種乳酸菌胞外多糖對荷瘤小鼠具有增強(qiáng)免疫功能的作用，經(jīng)搖瓶液態(tài)發(fā)酵試驗(yàn)，該多糖的最高產(chǎn)量達(dá)0.1g/L。公開號CN1425063A專利公開了一株乳酸菌突變株，該乳酸菌株在編碼α-磷酸葡萄糖變位酶的基因突變后可過度產(chǎn)生胞外多糖，經(jīng)搖瓶發(fā)酵其多糖產(chǎn)量是突變前的2.5倍，但其發(fā)酵水平僅達(dá)0.044g/L。另外，CN1104504C號專利公開了一種利用土壤桿菌1202菌株生產(chǎn)胞外多糖的生產(chǎn)工藝，該多糖也是經(jīng)搖瓶液態(tài)發(fā)酵獲得，試驗(yàn)表明該多糖具有免疫增強(qiáng)和抗腫瘤活性。
綜上所述，微生物多糖的開發(fā)生產(chǎn)研究已取得一定進(jìn)展，其現(xiàn)狀與特點(diǎn)如下(1)已開發(fā)的真菌多糖，多數(shù)具有免疫增強(qiáng)作用。然而從野生真菌子實(shí)體中直接提取多糖受到自然資源的嚴(yán)格限制，通過人工栽培子實(shí)體或液態(tài)發(fā)酵菌絲體的方式生產(chǎn)多糖，周期長、產(chǎn)量低、成本高，致使每支多糖含量僅0.1g的針劑售價達(dá)40～200元。(2)細(xì)菌胞外多糖可通過發(fā)酵方式大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，已投入生產(chǎn)的主要有黃原膠、熱凝多糖和結(jié)冷膠等，但未報道有免疫活性作用，目前主要用在食品與化工等方面。(3)已報道可合成具有免疫活性的細(xì)菌胞外多糖有乳酸菌和土壤桿菌1202菌株的胞外多糖，但尚處在搖瓶試驗(yàn)階段，且產(chǎn)量偏低。因此，開發(fā)具有免疫活性和可以實(shí)施大規(guī)模工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)的細(xì)菌胞外多糖，無論對于保障人們身體健康，還是對于促進(jìn)經(jīng)濟(jì)建設(shè)都是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有免疫活性的微生物多糖；其生產(chǎn)方法簡單，生產(chǎn)菌株性狀優(yōu)良，能利用廉價原料；這種微生物多糖能夠用來制備提高免疫功能的藥品。
本發(fā)明提供的一種微生物多糖，是采用保藏號為CCTCC M 205108的錦雞兒根瘤菌菌種，在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，發(fā)酵制得。
所述的菌種錦雞兒根瘤菌(Rhizobium sp.N613)，菌株的細(xì)胞形態(tài)為桿狀(見圖1)，不產(chǎn)生芽孢，革蘭氏陰性，能與相應(yīng)的豆科植物有效結(jié)瘤，共生固氮。經(jīng)發(fā)酵試驗(yàn)證明，該菌株具有基質(zhì)范圍寬、生長速率快、生產(chǎn)性狀穩(wěn)定等優(yōu)良的生產(chǎn)性狀，當(dāng)該菌株生長在葡萄糖等碳水化合物的培養(yǎng)基上時，在細(xì)胞生長的同時便合成胞外多糖，到穩(wěn)定期隨著氮源物質(zhì)濃度的降低，會利用碳源基質(zhì)合成并在細(xì)胞外大量積累胞外多糖，其多糖的發(fā)酵類型屬于部分生長關(guān)聯(lián)型。該菌株分離自植物錦雞兒根部。該菌種保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC M 205108。
所述的培養(yǎng)基，包括斜面固體培養(yǎng)基和液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組分及其含量按g/L計。
斜面固體培養(yǎng)基葡萄糖5～10，(NH4)2SO40.3～0.8，KH2PO4·12H2O 0.3～0.61，K2HPO40.2～0.39，NaCl0～0.1，酵母水解粉0.5～1，H3BO30.002，Na2MoO40.002，瓊脂20～23，余量為水；培養(yǎng)基pH7.0～7.2。
液體發(fā)酵培養(yǎng)基糖(葡萄糖、蔗糖或淀粉水解液)10～30，(NH4)2SO40.8～3.0，KH2PO4·12H2O0.61～1.22，K2HPO40.39～0.78，NaCl0～0.1，酵母水解粉0.5～2，H3BO30.002，Na2MoO40.002，余量為水；培養(yǎng)基pH7.0～7.2。
其中淀粉水解液制備取淀粉20g，加水80mL，制成淀粉乳，調(diào)節(jié)pH6.5，加熱糊化后，加入20000U/mL的α-淀粉酶0.05mL，在95℃水浴中液化2h，再加入50000U/g的糖化酶0.02g，調(diào)pH至4.5，在60℃水浴條件下水解6h，過濾，將濾液減壓濃縮至30mL。用3，5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量0.5g/mL。
本發(fā)明微生物多糖生產(chǎn)方法，包括斜面種子培養(yǎng)、搖瓶種子培養(yǎng)、種子罐種子培養(yǎng)、液態(tài)發(fā)酵和多糖產(chǎn)物分離純化等。具體生產(chǎn)方法包括如下步驟(1)斜面種子培養(yǎng)將保藏號為CCTCC M 205108的錦雞兒根瘤菌接種到斜面固體培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h～24h，制得斜面種子；(2)搖瓶種子培養(yǎng)將斜面種子接入液體培養(yǎng)基中，在28℃～31℃條件下，搖床培養(yǎng)16h～18h，制得搖瓶種子液；(3)種子罐種子培養(yǎng)將搖瓶種子液按7％～10％的接種量接入種子罐液體培養(yǎng)基中，裝料系數(shù)0.7，控制溫度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧飽和度10％以上，培養(yǎng)24h～30h，制得種子罐種子液；(4)分批發(fā)酵將種子罐種子液按7％～10％的接種量接入液體培養(yǎng)基中，裝料系數(shù)0.7，控制溫度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧飽和度10％以上，培養(yǎng)30h～32h，收集發(fā)酵液；(5)多糖的提取將發(fā)酵液稀釋、離心分離，將離心液濃縮至1/6～1/12體積，用食用酒精沉淀，將沉淀物用水溶解，再經(jīng)酒精沉淀、真空干燥后，得多糖產(chǎn)品，并回收酒精。
所述的步驟(4)可以是補(bǔ)料分批發(fā)酵將種子罐種子液按7％～10％的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝料系數(shù)0.7，控制溫度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧飽和度10％以上，培養(yǎng)25～30h，開始補(bǔ)加糖，控制發(fā)酵液中糖濃度在15g/L-35g/L，發(fā)酵培養(yǎng)到48-56h，收集發(fā)酵液。
本發(fā)明微生物多糖經(jīng)過動物免疫學(xué)試驗(yàn)證明其具有免疫活性，可用來制備提高免疫功能的藥品。
此外，本發(fā)明微生物多糖還有望作為食品或化工領(lǐng)域的增稠劑、懸浮劑等。
本發(fā)明采用的檢測方法①細(xì)胞干重基于培養(yǎng)液中無顆粒性的營養(yǎng)物質(zhì)，在發(fā)酵過程中我們采用分光光度法在600nm波長處測定細(xì)胞懸液的吸光值，然后再根據(jù)吸光值與細(xì)胞干重曲線折算成細(xì)胞濃度。
②還原糖(葡萄糖或淀粉水解糖)測定3，5-二硝基水楊酸法。
③蔗糖測定蒽酮法④多糖的測定苯酚硫酸法。
⑤銨離子測定改良靛酚藍(lán)比色法。
⑥無機(jī)磷的測定鉬酸銨比色法。
⑦分子量的測定凝膠過濾層析法。
與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果本發(fā)明采用錦雞兒根瘤菌為生產(chǎn)菌株，以工業(yè)葡萄糖、蔗糖和淀粉水解液作為碳源，硫酸銨作為氮源，酵母水解粉作為生長因子，通過液態(tài)發(fā)酵的方式生產(chǎn)一種微生物多糖(REPS)，REPS產(chǎn)量可達(dá)10g/L～17g/L。該方法的主要特點(diǎn)在于菌株生長快、多糖產(chǎn)量高、原料來源廣、培養(yǎng)條件適中，生產(chǎn)成本低。此外，生產(chǎn)菌種是自然界的固氮菌，即使在生產(chǎn)過程中不慎流入環(huán)境中也不存在生物安全性的問題。
本發(fā)明以沉淀工藝路線為基礎(chǔ)，優(yōu)化了REPS的分離純化技術(shù)與工藝參數(shù)，建立了一套下游加工方法。此方法具有工藝簡單，易于操作等優(yōu)點(diǎn)。通過此法獲得的REPS產(chǎn)品，收率達(dá)到90％以上，純度達(dá)到95％以上，而且此法不會降低REPS的分子量和影響該多糖的理、化及生物學(xué)性質(zhì)。
由本發(fā)明獲得的REPS是一種新型活性多糖，經(jīng)過動物免疫學(xué)試驗(yàn)證明具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用，可以進(jìn)一步開發(fā)為一種新型的免疫增強(qiáng)藥物。此外，根據(jù)該多糖的理化性質(zhì)，還可作為食品與化工方面的增稠劑與懸浮劑等。


圖1、錦雞兒根瘤菌[Rhizobium sp.N613(Caragana)]菌株的細(xì)胞形態(tài)圖具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例中所采用的發(fā)酵設(shè)備為鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)公司生產(chǎn)的10L、100L自控發(fā)酵罐配套設(shè)備。
實(shí)施例1 以葡萄糖為碳源，用10L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)斜面種子培養(yǎng)將保藏的錦雞兒根瘤菌菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h，其中培養(yǎng)基的組成為(按g/L計)葡萄糖5，(NH4)2SO40.3，KH2PO4·12H2O 0.3，K2HPO40.2，酵母水解粉0.5，H3BO30.002，Na2MoO40.002，瓊脂20，余量為水；培養(yǎng)基pH7.0。
搖瓶種子培養(yǎng)將斜面種子接入液體培養(yǎng)基中，28℃條件下，在150r/min搖床培養(yǎng)16h，作為種子液備用，其中培養(yǎng)基的組成為(按g/L計)葡萄糖10，(NH4)2SO40.8，KH2PO4·12H2O0.61，K2HPO40.39，酵母水解粉1，H3BO30.002，Na2MoO40.002，余量為水；培養(yǎng)基pH7.0。
10L發(fā)酵罐分批發(fā)酵將種子液按7.5％的接種量接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在10L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件裝料系數(shù)0.7，控制溫度28℃、pH7.0，保持溶氧飽和度10％以上。經(jīng)過30小時的培養(yǎng)，細(xì)胞濃度為14.2g干細(xì)胞/L(即OD600為29)，多糖產(chǎn)量達(dá)8.2g/L。其中培養(yǎng)基的組成為(按g/L計)葡萄糖30，(NH4)2SO43.0，KH2PO4·12H2O1.22，K2HPO40.78，NaCl0.1，酵母水解粉2，H3BO30.002，Na2MoO40.002，余量為水；培養(yǎng)基pH7.0。
REPS的提取將發(fā)酵液稀釋3倍，然后采用管式離心機(jī)，在離心因素為15700×g的條件下，控制流速，進(jìn)行連續(xù)液固分離，棄菌體，收集離心液。離心液在60℃下減壓濃縮至離心液體積的1/6，得濃縮液。然后在濃縮液中加入3倍體積的食用酒精(酒精濃度≥95％)沉淀多糖，取出絮狀多糖，用水溶解，再經(jīng)酒精沉淀，將絮狀沉淀物在60℃條件下真空干燥，得多糖產(chǎn)品。經(jīng)檢測，收率達(dá)90％，純度達(dá)95％，分子量為27000Da。
實(shí)施例2 以蔗糖為碳源，用10L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)斜面種子培養(yǎng)將保藏的錦雞兒根瘤菌菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，于30℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20h，其中培養(yǎng)基的組成為(按g/L計)葡萄糖7，(NH4)2SO40.5，KH2PO4·12H2O0.5，K2HPO40.3，NaCl0.1，酵母水解粉0.75，瓊脂22，培養(yǎng)基pH7.1，其余成分同實(shí)施例1。
搖瓶種子培養(yǎng)將斜面種子接入液體培養(yǎng)基中，30℃條件下，在190r/min搖床培養(yǎng)17h，作為種子液備用，其中培養(yǎng)基的成分同實(shí)施例1。
10L發(fā)酵罐分批發(fā)酵將種子液按7.5％的接種量接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在10L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件裝料系數(shù)0.7，控制溫度30℃、pH7.1，保持溶氧飽和度10％以上。經(jīng)過30小時的培養(yǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)到14.9g干細(xì)胞/L(即OD600為24)，多糖產(chǎn)量達(dá)10.6g/L。培養(yǎng)基中除葡萄糖被蔗糖替代外，其余成分同實(shí)施例1。
REPS提取將發(fā)酵液稀釋4倍，然后采用管式離心機(jī)，在離心因素為15700×g的條件下，控制流速，進(jìn)行連續(xù)液固分離，棄菌體，收集離心液。離心液在60℃下減壓濃縮至離心液體積的1/9，得濃縮液。其余操作同實(shí)施例1。經(jīng)檢測，收率達(dá)92％，純度達(dá)96％，分子量為28000Da。
實(shí)施例3 以淀粉水解液為碳源，用100L發(fā)酵罐分批發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)斜面種子培養(yǎng)將保藏的錦雞兒根瘤菌菌種接種在斜面培養(yǎng)基上，于31℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，其中培養(yǎng)基的組成為(按g/L計)葡萄糖10，(NH4)2SO40.8，KH2PO4·12H2O0.61，K2HPO40.39，NaCl0.1，酵母水解粉1，瓊脂23，培養(yǎng)基pH7.2，其余成分同實(shí)施例1。
搖瓶種子培養(yǎng)將斜面種子接入液體培養(yǎng)基中，31℃條件下，在220r/min搖床培養(yǎng)18h，作為種子液備用，其中培養(yǎng)基的成分同實(shí)施例1。
種子罐種子培養(yǎng)將種子液按10％的接種量接入種子罐液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件裝料系數(shù)0.7，控制溫度31℃、pH7.2，保持溶氧飽和度10％以上。經(jīng)過24小時的培養(yǎng)，可作為100L發(fā)酵罐的種子液。其中培養(yǎng)基的成分同實(shí)施例1中分批發(fā)酵所用的培養(yǎng)基。
100L發(fā)酵罐分批發(fā)酵將種子罐種子液按10％的接種量接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在100L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件裝料系數(shù)0.7，控制溫度31℃、pH7.2，保持溶氧飽和度10％以上。經(jīng)過32小時的培養(yǎng)，細(xì)胞濃度可達(dá)到15.2g干細(xì)胞/L(即OD600為31)，多糖產(chǎn)量可達(dá)10.9g/L。其中培養(yǎng)基的糖為淀粉水解液，其余成分同實(shí)施例1中分批發(fā)酵所用的培養(yǎng)基。
REPS提取將發(fā)酵液稀釋6倍，然后采用管式離心機(jī)，在離心因素為15700×g的條件下，控制流速，進(jìn)行連續(xù)液固分離，棄菌體，收集離心液。離心液在60℃下減壓濃縮至離心液體積的1/12，得濃縮液。其余操作同實(shí)施例1。經(jīng)檢測，收率為94％，純度為95％，分子量為29000Da。
實(shí)施例4 以葡萄糖作碳源，用100L發(fā)酵罐進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)斜面種子培養(yǎng)及搖瓶種子培養(yǎng)同實(shí)施例3。
種子發(fā)酵罐種子培養(yǎng)將種子液按10％的接種量接入種子罐液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過26小時的培養(yǎng)，可作為100L發(fā)酵罐的種子液。培養(yǎng)條件與培養(yǎng)基成分同實(shí)施例3。
100L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵將種子罐種子液按10％的接種量接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在100L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件裝料系數(shù)0.7，控制溫度31℃、pH7.2，保持溶氧飽和度10％以上。初始培養(yǎng)基的組成同實(shí)施例1中分批發(fā)酵所用的培養(yǎng)基。經(jīng)過25小時的培養(yǎng)，葡萄糖消耗到15g/L時，開始采用少量多次的方式進(jìn)行補(bǔ)加葡萄糖，糖量不超過30g/L，經(jīng)48小時的發(fā)酵培養(yǎng)，菌體濃度可達(dá)17.4干細(xì)胞g/L，多糖產(chǎn)量可達(dá)16.2g/L。
REPS提取同實(shí)施例3，經(jīng)檢測，收率達(dá)93％，純度達(dá)96％以上，分子量為30000Da。
實(shí)施例5 以蔗糖為碳源，用100L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)試驗(yàn)斜面種子培養(yǎng)及搖瓶種子培養(yǎng)同實(shí)施例3。
種子發(fā)酵罐種子培養(yǎng)將種子液按10％的接種量接入種子罐液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過28小時的培養(yǎng)，可作為100L發(fā)酵罐的種子液。培養(yǎng)條件與培養(yǎng)基成分同實(shí)施例3。
100L發(fā)酵罐補(bǔ)料分批發(fā)酵將種子罐種子液按10％的接種量接入液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在100L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件裝料系數(shù)0.7，控制溫度31℃、pH7.2，保持溶氧飽和度10％以上。初始培養(yǎng)基的糖為蔗糖，其余組成同實(shí)施例1中分批發(fā)酵所用的培養(yǎng)基。經(jīng)過30小時的培養(yǎng)，葡萄糖消耗到15g/L時，開始采用少量多次的方式進(jìn)行補(bǔ)加蔗糖，糖量不超過30g/L，經(jīng)52小時的發(fā)酵培養(yǎng)，菌體濃度可達(dá)17.9干細(xì)胞g/L，多糖產(chǎn)量可達(dá)17.3g/L。
REPS提取同實(shí)施例3，經(jīng)檢測，收率為94％，純度可達(dá)96.2％，分子量為29000Da。
實(shí)施例6 以純品REPS為樣品進(jìn)行動物免疫學(xué)試驗(yàn)經(jīng)提取后的多糖一般純度可達(dá)95％以上，將干燥后的該多糖溶于水，制成0.05-0.1％的多糖水溶液，用Savage法處理以除去多糖水溶液中的蛋白質(zhì)，處理過程如下Savage液由氯仿和正丁醇以4∶1的體積比配置而成，將多糖水溶液和Savage液以4∶1的體積比混合，并振蕩30min，然后6000r/min離心10min，棄沉淀。反復(fù)處理三次后，上清液經(jīng)紫外光掃描檢測和SephadexG-100凝膠過濾分析，以證明多糖的純度。上清液用3倍體積的食用酒精醇沉處理，沉淀物經(jīng)真空干燥，得REPS純品。
采用昆明種小鼠作為實(shí)驗(yàn)對象，分成高、中、低劑量組和對照組，分別給各劑量組的小鼠腹腔注射不同量(40，20，10mg·Kg-1·d-1)的REPS，給對照組注射生理鹽水，連續(xù)給藥10天，然后進(jìn)行非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫試驗(yàn)，檢驗(yàn)該多糖促進(jìn)機(jī)體巨噬細(xì)胞吞噬、增強(qiáng)淋巴細(xì)胞增殖和提高抗體效價的能力。結(jié)果見附表1和附表2。
附表1 REPS對小鼠非特異免疫功能的影響

*P＜0.05，**P＜0.01附表2 REPS對小鼠體液免疫和細(xì)胞免疫功能的影響

*P＜0.05，**P＜0.01。
權(quán)利要求
1.一種微生物多糖，其特征在于，采用保藏號為CCTCC M 205108的錦雞兒根瘤菌菌種，在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，發(fā)酵制得。
2.按照權(quán)利要求1所述的微生物多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于包括如下步驟(1)斜面種子培養(yǎng)將保藏號為CCTCC M 205108的錦雞兒根瘤菌接種到斜面固體培養(yǎng)基上，在30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h～24h，制得斜面種子；(2)搖瓶種子培養(yǎng)將斜面種子接入液體培養(yǎng)基中，在28℃～31℃條件下，搖床培養(yǎng)16h～18h，制得搖瓶種子液；(3)種子罐種子培養(yǎng)將搖瓶種子液按7％～10％的接種量接入種子罐液體培養(yǎng)基中，裝料系數(shù)0.7，控制溫度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧飽和度10％以上，培養(yǎng)24h～30h，制得種子罐種子液；(4)分批發(fā)酵將種子罐種子液按7％～10％的接種量接入液體培養(yǎng)基中，裝料系數(shù)0.7，控制溫度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧飽和度10％以上，培養(yǎng)30h～32h，收集發(fā)酵液；(5)多糖的提取將發(fā)酵液稀釋、離心分離，將離心液濃縮至1/6～1/12體積，用食用酒精沉淀，將沉淀物用水溶解，再經(jīng)酒精沉淀、真空干燥后，得多糖產(chǎn)品。
3.按照權(quán)利要求2所述的微生物多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的步驟(4)是補(bǔ)料分批發(fā)酵將種子罐種子液按7％～10％的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝料系數(shù)0.7，控制溫度28℃～31℃、pH7.0～7.2，保持溶氧飽和度10％以上，培養(yǎng)25～30h，開始補(bǔ)加糖，控制發(fā)酵液中糖濃度在15g/L-35g/L，發(fā)酵培養(yǎng)到48-56h，收集發(fā)酵液。
4.按照權(quán)利要求2所述的微生物多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的斜面固體培養(yǎng)基組分及其含量按g/L計葡萄糖5～10，(NH4)2SO40.3～0.8，KH2PO4.12H2O 0.3～0.61，K2HPO40.2～0.39，NaCl 0～0.1，酵母水解粉0.5～1，H3BO30.002，Na2MoO40.002，瓊脂20～23，余量為水。
5.按照權(quán)利要求2所述的微生物多糖的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基組分及其含量按g/L計糖10～30，(NH4)2SO40.8～3.0，KH2PO4.12H2O 0.61～1.22，K2HPO40.39～0.78，NaCl 0～0.1，酵母水解粉0.5～2，H3BO30.002，Na2MoO40.002，余量為水。
6.按照權(quán)利要求1所述微生物多糖的用途，用來制備提高免疫功能的藥品。
全文摘要
一種微生物多糖，是采用保藏號為CCTCC M205108的錦雞兒根瘤菌菌種，在以碳水化合物為碳源，以銨鹽為氮源的培養(yǎng)基和合適的培養(yǎng)條件下，發(fā)酵制得。其生產(chǎn)方法包括斜面種子培養(yǎng)，搖瓶種子培養(yǎng)，種子罐種子培養(yǎng)，分批發(fā)酵或補(bǔ)料分批發(fā)酵，多糖的提取。通過分批發(fā)酵生產(chǎn)的多糖產(chǎn)品，其產(chǎn)量可達(dá)到7.7g/L～10.2g/L；通過補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)的多糖產(chǎn)品，其產(chǎn)量可達(dá)15.1g/L～16.2g/L。該多糖的分子量在2.7×10
文檔編號C08B37/00GK1827771SQ200510048129
公開日2006年9月6日 申請日期2005年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月26日
發(fā)明者趙良啟, 黃曉波, 韓勇, 史清亮, 張建國 申請人:山西大學(xué)