專利名稱：一種以固態(tài)基質(zhì)為載體紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)莫納可林k的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及涉及一種利用固態(tài)基質(zhì)為載體固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)生理活性物質(zhì)的方法，特別是一種發(fā)酵生產(chǎn)(莫納可林K) Monacolin K的方法。
背景技術(shù)：
Monaconlin K是人體膽固醇生物合成的關(guān)鍵酶羥甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMG — CoA還原酶)的競爭性抑制劑，可有效降低人體內(nèi)低密度膽固醇(LDL)的水平。目前國內(nèi)外利用紅曲菌發(fā)酵法生產(chǎn)Monacolin K的方法主要有固態(tài)發(fā)酵法和液態(tài)發(fā)酵法。液態(tài)發(fā)酵法是在通風(fēng)機(jī)械罐中進(jìn)行，可人為地優(yōu)化培養(yǎng)基。本實(shí)驗(yàn)室已在利用紅·曲菌9901液態(tài)發(fā)酵甘油生產(chǎn)Monacolin K方面達(dá)到較高水平。但液態(tài)發(fā)酵設(shè)備投入大，動(dòng)力消耗大，無菌要求比較嚴(yán)格，后處理工藝比較繁瑣。固態(tài)發(fā)酵法以谷物為原料，原料經(jīng)蒸煮滅菌、冷卻、接種、固態(tài)發(fā)酵，烘干粉碎得到最終產(chǎn)品。該法得到的紅曲產(chǎn)品稱為降脂(膽固醇)紅曲，可作為保健食品或醫(yī)藥品用于高血脂癥人群。目前各廠商以谷物為原料配制成紅曲發(fā)酵的固態(tài)培養(yǎng)基，未見人為調(diào)節(jié)該固態(tài)培養(yǎng)基成分的報(bào)道。這也使谷物為唯一原料固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)的Monacolin K含量較低，且含量不穩(wěn)定。本發(fā)明在谷物原料的基礎(chǔ)上，有針對性地添加部分營養(yǎng)物質(zhì)，則可有效提高紅曲發(fā)酵生產(chǎn)關(guān)鍵性的生理活性物質(zhì)Monacolin K的含量。另外一方面，考慮到富含Monacolin K的產(chǎn)品也可以用于喂食各種其它的動(dòng)物，用于生產(chǎn)膽固醇含量較低的畜牧業(yè)肉類制品或蛋品，則富含Monacolin K的產(chǎn)品也可采用更為廉價(jià)的非谷物類原料進(jìn)行生產(chǎn)。而纖維類原料無疑是合適的原料，但纖維類原料中紅曲菌生長的主要營養(yǎng)成分含量不足，必須提供營養(yǎng)物質(zhì)以彌補(bǔ)之。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種以固態(tài)基質(zhì)為載體紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)(莫納可林 K) Monacolin K 的方法。針對上述問題，本發(fā)明使用固態(tài)基質(zhì)為載體紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)M0NAC0LIN K，以實(shí)現(xiàn)低值副產(chǎn)品的高附加值轉(zhuǎn)換。本發(fā)明最主要的技術(shù)特征之一是可以惰性基質(zhì)為載體培養(yǎng)紅曲菌，另外，通過在載體中添加由不同成分組成的營養(yǎng)液，以提高M(jìn)onacolin K的含量。為實(shí)現(xiàn)上述目的采用以下技術(shù)方案，包括以下步驟(I)固態(tài)基質(zhì)載體的選用及合適的預(yù)處理；(2)紅曲菌種子培養(yǎng)，菌種來源于菌種保藏機(jī)構(gòu)CGMCC，保藏編號為0517 ；(3)固態(tài)基質(zhì)載體與營養(yǎng)液按一定質(zhì)量比混合,滅菌,接入紅曲菌種子液,混合均勻后變溫發(fā)酵；(4)將發(fā)酵結(jié)束后的樣品烘干、粉碎。本發(fā)明所述(I)難溶于水的固態(tài)載體，包括惰性基質(zhì)載體甘蔗渣、木屑、玉米芯、煙梗、茶梗、麩皮、瓊脂等惰性載體；谷物類載體包括顆粒狀的農(nóng)產(chǎn)品原料，如大米、小米、大麥、玉米、高粱、青稞、咖啡豆等。根據(jù)載體的種類，本發(fā)明(I)載體預(yù)處理步驟，采用不同的方法I)將惰性基質(zhì)載體水煮10_60min，冷卻后用水洗f 3次，烘干粉碎過篩，載體的粒度為O. 5 20mm ；2)谷物類載體則粉碎至O. 5^20mm,再經(jīng)過膨化或加適量水蒸煮10_60min，以不破
形即可，烘干待用。較佳的，惰性載體蒸煮時(shí)間為10_60min,進(jìn)一步的，惰性載體蒸煮時(shí)間為30_60min。 較佳的，惰性載體的粒度為O. 5-20mm，進(jìn)一步的，惰性載體粒度為l-10mm。較佳的，谷物類載體蒸煮時(shí)間為10-60min，進(jìn)一步的，谷物類載體蒸煮時(shí)間為20_40min。較佳的，谷物類載體的粒度為O. 5-20mm，進(jìn)一步的，谷物類載體粒度為l-10mm。本發(fā)明所述(2)的種子培養(yǎng)步驟，具體包括如下步驟I)選擇紅曲菌為發(fā)酵微生物。所述微生物紅曲菌是食品工業(yè)常用菌種。2)將紅曲菌經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)成熟后，制備孢子懸浮液，其中孢子懸浮液中孢子的濃度不低于IO7個(gè)/ml。所述PDA斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)為采用PDA斜面培養(yǎng)基，劃線接種后在30°C _32°C培養(yǎng)7-10天，獲得成熟的紅曲菌孢子。所述孢子懸浮液采用包括如下步驟的方法制得在培養(yǎng)成熟的PDA斜面菌種中加入無菌水，用接種鏟或接種針將孢子刮下；將孢子懸浮液移到一個(gè)含玻璃珠的無菌三角瓶中；打散后獲得孢子懸浮液，其中孢子懸浮液中的孢子濃度不得低于IO7個(gè)/mL。3)將孢子懸浮液按10% (V/V)的比例接入種子培養(yǎng)基中，30°C 180r/min通風(fēng)培養(yǎng)2天獲得種子液。所述的種子培養(yǎng)基(IL):葡萄糖60g，蛋白胨25g，玉米漿10mL，NaN032g, K2HPO4 · 3H201g, MgSO4O. 5g本發(fā)明所述(3)的發(fā)酵步驟，具體包括如下步驟固態(tài)基質(zhì)載體與營養(yǎng)液按質(zhì)量比I: (O. 5-10)混合，121°C滅菌20_60min，冷卻后接入10-20% (V/W)的紅曲菌9901種子液，28-30°C，發(fā)酵2天，之后20_28°C培養(yǎng)18-28天，其間每3天翻拌一次。優(yōu)選的，滅菌時(shí)間為20_60min,進(jìn)一步的,20_30min。上述營養(yǎng)液成分為葡萄糖10-100g/L，大豆水解液10_200mL/L，甘油100_500g/L，NaN035-20g/L，K2HP04l-10g/L，MgSO4O. 5-5g/L，ZnSO4 · 7H20 l_20g/L，玉米漿 IO-IOOmL/L。進(jìn)一步的，葡萄糖 30-70g/L，大豆水解液 50-100mL/L，甘油 250_450g/L，NaN035-10g/L, K2HP043-7g/L, MgS04l-3g/L, ZnSO4 · 7H20 5-lOg/L，玉米漿 30_70mL/L。優(yōu)選的，固態(tài)基質(zhì)載體與營養(yǎng)液按質(zhì)量比I: (0.5-10)混合，進(jìn)一步的，惰性載體與營養(yǎng)液質(zhì)量比為I: (5-10)，膨化谷物與營養(yǎng)液的質(zhì)量比為I: (0.5-1)。本發(fā)明所述(4)的步驟，發(fā)酵結(jié)束后將樣品高溫滅菌，50°C烘干，粉碎。
本發(fā)明具有以下有益效果(I)可利用更為廉價(jià)的纖維類原料生產(chǎn)高附加值的降膽固醇的紅曲產(chǎn)品；(2)所生產(chǎn)的降膽固醇的紅曲產(chǎn)品的應(yīng)用范圍可包括人類所用的醫(yī)藥品、保健食品及其它動(dòng)物所用的降膽固醇產(chǎn)品；(3)與液態(tài)發(fā)酵相比，不需要復(fù)雜的產(chǎn)品后處理過程，最終M0NAC0LIN K含量為13. 21mg/g。
具體實(shí)施例方式實(shí)例I以甘蔗渣作為固態(tài)基質(zhì)載體，水煮20min，顆粒度2mm，甘蔗渣與營養(yǎng)液按質(zhì)量比1:7混合，121°C滅菌20min，接入15% (V/W)的紅曲菌9901種子液，混合均勻后30°C培養(yǎng)2天，28°C培養(yǎng)20天，其間每3天翻拌一次。營養(yǎng)液成分為葡萄糖30g/L，大豆水解液50mL/L，甘油 400g/L，NaN0310g/L，K2HP044g/L，MgS042g/L，ZnSO4 · 7H20 8g/L，玉米漿 50mL/L。發(fā)酵結(jié)束后將樣品高溫濕熱滅菌后烘干粉碎，用70%的酒精55°C水浴浸提lh，微濾測定M0NAC0LIN K 含量。M0NAC0LIN K 含量為 11. 31mg/g。
實(shí)例2以玉米芯和甘蔗渣質(zhì)量比3:2混合作為固態(tài)基質(zhì)載體，載體水煮40min，顆粒度分別為2mm和5mm，載體與營養(yǎng)液按質(zhì)量比1:9混合，121°C滅菌30min，接入18%(V/W)的紅曲菌9901種子液，混合均勻后28°C培養(yǎng)2天，25°C培養(yǎng)18天，其間每3天翻拌一次。營養(yǎng)液成分為葡萄糖 40g/L，大豆水解液 90mL/L，甘油 350g/L，NaN038g/L, K2HP043g/L, MgSO4L 5g/L，ZnSO4 . 7H20 6g/L，玉米漿40mL/L。發(fā)酵結(jié)束后將樣品高溫濕熱滅菌烘干粉碎，用80%的酒精55°C水浴浸提I. 5h，微濾測定M0NAC0LIN K含量。M0NAC0LIN K含量為10. 42mg/g。實(shí)例3以茶梗粉末作為固態(tài)基質(zhì)載體，載體經(jīng)水煮30min，顆粒度為1mm，載體與營養(yǎng)液按質(zhì)量比1:5混合，121°C滅菌25min，接入13% (V/W)的紅曲菌9901種子液，混合均勻后28°C培養(yǎng)2天，22°C培養(yǎng)25天，其間每3天翻拌一次。營養(yǎng)液成分為葡萄糖50g/L，大豆水解液 70mL/L,甘油 400g/L, NaN035g/L, K2HP045g/L, MgS042. 5g/L, ZnSO4 · 7H20 lOg/L,玉米漿30mL/L。發(fā)酵結(jié)束后將樣品高溫濕熱滅菌烘干粉碎，用90%的酒精55°C水浴浸提I. 5h，微濾測定 M0NAC0LIN K 含量。M0NAC0LIN K 含量為 7. 76mg/g。實(shí)例4以膨化大麥作為固態(tài)基質(zhì)載體，取大麥與營養(yǎng)液按質(zhì)量比1:0. 5混合,121°C滅菌30min，接入10% (V/W)的紅曲菌9901種子液，混合均勻后28°C培養(yǎng)2天，20°C培養(yǎng)28天，其間每3天翻拌一次。營養(yǎng)液成分為葡萄糖70g/L，大豆水解液100mL/L，甘油450g/L，NaN035g/L, K2HP046g/L, MgS04lg/L, ZnSO4 · 7H20 5g/L，玉米漿 60mL/L。發(fā)酵結(jié)束后將樣品高溫濕熱滅菌烘干粉碎，用85%的酒精55°C水浴浸提2h，微濾測定M0NAC0LIN K含量。M0NAC0LIN K 含量為 9. 32mg/g。實(shí)例5以蒸煮后的小米作為固態(tài)基質(zhì)載體，取小米與營養(yǎng)液按質(zhì)量比為1:0. 8混合，121°C滅菌20min，接入20% (V/W)的紅曲菌9901種子液，混合均勻后29°C培養(yǎng)2天，23°C培養(yǎng)28天，其間每3天翻拌一次。營養(yǎng)液成分為葡萄糖50g/L，大豆水解液60mL/L，甘油300g/L, NaN036g/L, K2HP045g/L, MgS042. 5g/L, ZnSO4 · 7H20 6g/L，玉米漿 50mL/L。發(fā)酵結(jié)束后將樣品高溫濕熱滅菌烘干粉碎，用95%的酒精55°C水浴浸提2h，微濾測定MONACOLIN K含量。MONACOLIN K 含量為 13. 21mg/g。實(shí)例6以生咖啡豆作為固態(tài)基質(zhì)載體，取生咖啡豆與營養(yǎng)液按質(zhì)量比為1:0. 6混合，121°C滅菌20min，接入15% (V/W)的紅曲菌9901種子液，混合均勻后30°C培養(yǎng)2天，26°C培養(yǎng)28天，其間每3天翻拌一次。營養(yǎng)液成分為葡萄糖40g/L，大豆水解液60mL/L，甘油250g/L，NaN038g/L，K2HP047g/L，MgS043g/L，ZnSO4 · 7H20 7g/L，玉米漿 70mL/L。發(fā)酵結(jié)束后將樣品高溫濕熱滅菌烘干粉碎，用75%的酒精55°C水浴浸提2h，微濾測定MONACOLIN K含量。MONACOLIN K 含量為 4. 54mg/g。·
權(quán)利要求
1.一種以固態(tài)基質(zhì)為載體紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)莫納可林K的方法，其特征為將經(jīng)預(yù)處理過的固態(tài)基質(zhì)載體與營養(yǎng)液按I: (O. 5-10)質(zhì)量比混合滅菌后，接種紅曲菌種子液后，混合均勻后在28-30°C培養(yǎng)2天，20-28°C培養(yǎng)18-28天，發(fā)酵期間，每隔3天翻拌一次，發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)高溫濕熱滅菌、烘干、粉碎即得富含Monacolin K的紅曲粉末產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的方法，其特征在于所述固態(tài)基質(zhì)載體為難溶于水的惰性載體甘蔗渣、木屑、玉米芯、煙梗、茶梗、麩皮或瓊脂；或顆粒狀的谷物類物質(zhì)大米、小米、大麥、玉米、高粱、青稞、或咖啡豆。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述固態(tài)基質(zhì)載體的預(yù)處理方法為將惰性載體加水煮10-60min，冷卻后用水洗廣3次，烘干粉碎過篩，載體的粒度為O.5 20mm ;谷物類物質(zhì)則粉碎至O. 5 20mm,再經(jīng)過膨化或加適量水蒸煮10_60min,以不破形即可，烘干待用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述固態(tài)基質(zhì)載體的預(yù)處理方法為將惰性載體加水煮30-60min，冷卻后用水洗f 3次，烘干粉碎過篩，載體的粒度為f IOmm ;谷物類物質(zhì)則粉碎至1-lOmm，再經(jīng)過膨化或加適量水蒸煮20-40min，以不破形即可，烘干待用。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述固態(tài)基質(zhì)載體為小米。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述固態(tài)基質(zhì)載體與營養(yǎng)液按I:0. 8質(zhì)量比混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于營養(yǎng)液配方為在I升水中加入葡萄糖30-70g,大豆水解液 50-100mL，甘油 250_450g，NaN035_10g, K2HP043_7g，MgS04l_3g，ZnSO4 ·7H20 5-10g，玉米漿 30-70mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的方法，其特征在于種子液體接種比例為10-20%(V/W)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I中所述的方法，其特征在于所述紅曲菌為CGMCC0517。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以固態(tài)基質(zhì)為載體紅曲菌發(fā)酵生產(chǎn)莫納可林的方法，涉及發(fā)酵工程領(lǐng)域。主要步驟是，將固態(tài)基質(zhì)載體與營養(yǎng)液按質(zhì)量比1:(0.5-10)的比例混合均勻，121℃滅菌20-60min，冷卻后接入10~20%(V/W)的紅曲菌CGMCC 0517種子液，混合均勻后28~30℃靜置培養(yǎng)2天，之后20-28℃培養(yǎng)18-28天，其間每3天翻拌一次，發(fā)酵結(jié)束后，將固態(tài)基質(zhì)物料烘干粉碎，即得到富含Monacolin K的紅曲粉末產(chǎn)品。本方法可以各種廉價(jià)的固態(tài)基質(zhì)為原料通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紅曲生理活性物質(zhì)，實(shí)現(xiàn)高附加值轉(zhuǎn)化。
文檔編號C12R1/645GK102911977SQ20121041006
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者許贛榮, 魯利平, 張薄博 申請人:江南大學(xué)