專利名稱：固相-數(shù)字pcr芯片及其制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物芯片研究領(lǐng)域，特別涉及一種固相-數(shù)字PCR芯片及其制作方法。
背景技術(shù)：
在進行生物研究和實際檢測時，有時待測DNA樣品的量較少或者從樣品中提取的待測DNA分子濃度較低時，為了得到較好的結(jié)果，通常需要先對樣品分子的量進行聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction，PCR)。雖然常規(guī)的PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究及相關(guān)領(lǐng)域，并且在應(yīng)用過程中不斷得到改進，但目前仍然存在著耗時太長，操作繁瑣，試劑消耗量大，擴增結(jié)果不穩(wěn)定等缺點。因此人們一直在尋求更快速更簡便的PCR方法。固相PCR是將特定的引物寡核苷酸通過不同的方法固定在固相支持物上來擴增目的DNA。固相支持物有瓊脂糖小珠，聚丙烯酰胺小珠，乳膠小珠，磁珠，普通玻片以及硅片 等。固相PCR可以將核酸擴增、核酸分離和核酸檢測三個相互獨立的步驟整合在一起，避免常規(guī)PCR擴增的一些干擾因素，PCR反應(yīng)產(chǎn)物易于分離純化，同時可實現(xiàn)多個不同擴增反應(yīng)的同步進行。固相PCR在快速基因分型、藥學(xué)基因組學(xué)以及基于基因組學(xué)的藥物發(fā)展中有廣泛的用途。數(shù)字PCR是最新的DNA定量技術(shù)，其基于單分子PCR并采用計數(shù)的方法對DNA進行定量，因此是一種絕對定量的工具。將大量的稀釋后的DNA溶液分散至芯片的微量反應(yīng)體系中，每個反應(yīng)體系的DNA模板數(shù)少于I個。在PCR循環(huán)反應(yīng)之后，可根據(jù)發(fā)出熒光信號的微量反應(yīng)體系所占有的比例來判定原始DNA濃度。固相-數(shù)字PCR兩者的結(jié)合，利用了數(shù)字PCR的特點實現(xiàn)了在微量體系中低濃度待測DNA的定量檢測，同時亦可通過固相PCR將待測DNA片段多重拷貝固定在蓋片表面，可用于后續(xù)全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、多重基因表達分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種固相-數(shù)字PCR芯片及其制作方法，其制作簡單，易操作，成本低廉。并且綜合了固相PCR高通量、低干擾的優(yōu)勢同時兼具數(shù)字PCR低濃度定量檢測的特點，為低濃度、稀有樣品DNA定量檢測及其后續(xù)全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、多重基因表達分析等提供良好的操作平臺。本發(fā)明提供一種固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟步驟I :取一基片，去除表面有機及無機雜質(zhì)，并進行真空干燥；步驟2 :在基片正面生長犧牲層；步驟3 :通過光刻工藝和刻蝕工藝將掩模圖形轉(zhuǎn)移到犧牲層上；步驟4 :以犧牲層為掩膜，通過刻蝕工藝，在基片上形成微孔陣列；步驟5 :取一蓋片，去除表面有機及無機雜質(zhì)，并進行真空干燥；步驟6 :在蓋片正面旋涂PDMS膜，并加熱使PDMS膜固化；
步驟7 :對PDMS膜進行表面處理，并將DNA探針結(jié)合在PDMS膜的表面；步驟8 :將基片與蓋片鍵合，使基片上微孔陣列中的每個微孔形成獨立反應(yīng)池，形成固相-數(shù)字PCR芯片。本發(fā)明還提供一種固相-數(shù)字PCR芯片，包括一基片；一微孔陣列，該微孔陣列通過光刻工藝和兩步刻蝕工藝制作在基片上；一蓋片；一 PDMS膜，該PDMS膜通過旋涂、加熱固化在蓋片表面；
該基片，微孔陣列，蓋片與PDMS膜形成了固相-數(shù)字PCR芯片。


為了進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容和特點，以下結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明做一詳細(xì)描述，其中圖I為本發(fā)明流程圖；圖2為固相-數(shù)字PCR芯片制作的步驟示意圖。
具體實施例方式請參閱圖I結(jié)合參閱圖2所示，本發(fā)明為一種固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟步驟I :取一基片10，去除表面有機及無機雜質(zhì)，并進行真空干燥，所述基片10材料為硅片、石英片、光纖面板或有機薄片，清洗是依次使用超聲波在分析純?nèi)纫蚁?、丙酮、無水乙醇、去離子水中清洗，去除基片10表面的有機雜質(zhì)，隨后使用氨水和雙氧水的混合液，鹽酸和雙氧水的混合液，硫酸和雙氧水的混合液加熱煮沸基片10,并使用去離子水沖洗，去除基片10表面的無機雜質(zhì)，此種清洗方式可除去基片10表面的有機附著物和無機顆粒物，將清洗后的基片10用氮氣吹干后裝入培養(yǎng)皿中，之后放入真空干燥箱內(nèi)前烘，前烘的溫度一般高于100攝氏度，前烘操作目的是去除基片10本身附帶的水蒸氣；步驟2 :在基片10正面生長犧牲層，所述犧牲層材料和生長厚度依據(jù)后續(xù)刻蝕工藝以及刻蝕的深度而定；步驟3 :通過光刻工藝和刻蝕工藝將掩模板上的圖形轉(zhuǎn)移到犧牲層上；所述光刻工藝包括勻膠、前烘、曝光、顯影等步驟，刻蝕工藝包括干法刻蝕和濕法刻蝕兩種；步驟4 :以犧牲層為掩膜，通過刻蝕工藝，在基片10上形成微孔陣列11 ;根據(jù)需要選擇物理干法刻蝕或化學(xué)濕法腐蝕的方式來制作微孔陣列11，其作用機理是利用氣體等離子或化學(xué)試劑對基片10的腐蝕作用，在基片10無犧牲層覆蓋區(qū)域形成微孔陣列11。微孔陣列11中的每個微孔形成一個皮升到納升量級的獨立反應(yīng)池，用于數(shù)字化PCR反應(yīng)，微孔陣列11以矩形、環(huán)形、鏡像或密排等形式陣列排布，微孔陣列11數(shù)目大于5000，其深度大于5微米，微孔陣列11中的微孔形狀為正多邊形或圓形，正多邊形或圓形大小取決于后續(xù)生物反應(yīng)所需要的體量，正多邊形的外接圓的直徑或圓形的直徑大于5微米，微孔陣列11中的各個微孔之間通過孔壁的隔離形成的獨立反應(yīng)池?？妆诘暮穸热Q于后續(xù)生物反應(yīng)的檢測方式，孔壁厚度大于2微米。
步驟5 :另取一蓋片12，去除表面有機及無機雜質(zhì)，并進行真空干燥；所述蓋片材料為為石英片或硅片，清洗是依次使用超聲波在分析純?nèi)纫蚁?、丙酮、無水乙醇、去離子水中清洗，去除蓋片12表面的有機雜質(zhì)，隨后使用氨水和雙氧水的混合液，鹽酸和雙氧水的混合液，硫酸和雙氧水的混合液加熱煮沸蓋片12，并使用去離子水沖洗，去除蓋片12表面的無機雜質(zhì)，此種清洗方式可除去蓋片12表面的有機附著物和無機顆粒物，將清洗后的蓋片12用氮氣吹干后裝入培養(yǎng)皿中，之后放入真空干燥箱內(nèi)前烘，前烘的溫度一般高于100攝氏度，前烘操作目的是去除蓋片12本身附帶的水蒸氣；步驟6 :在蓋片12正面旋涂PDMS膜13，并加熱使PDMS膜13固化；蓋片12上旋涂的PDMS膜13的厚度為5微米到500微米，可通過調(diào)整勻膠機的轉(zhuǎn)速和勻膠時間來對PDMS膜13的厚度進行調(diào)整，旋涂結(jié)束后將覆蓋有PDMS膜13的蓋片12放入真空烘箱中烘烤，力口速PDMS膜13的固化；步驟7 :對PDMS膜13進行表面處理，并將探針結(jié)合在PDMS膜13表面；用氧等離子體或是表面活性劑處理活化PDMS膜13的表面，使之可高密度結(jié)合DNA探針；
步驟8 :將步驟1、2、3、4得到的基片與步驟5、6、7得到的蓋片緊密貼合，使基片10上微孔陣列11中的每個微孔形成獨立反應(yīng)池，形成固相-數(shù)字PCR芯片；所述步驟1、2、3、4、5、6、7、8制備的固相-數(shù)字PCR芯片可在微孔陣列11中實現(xiàn)體量為皮升到納升量級的高通量數(shù)字PCR，同時可通過蓋片表面的探針有效的回收數(shù)字PCR產(chǎn)物，在同一芯片上實現(xiàn)兩種功能。并為后續(xù)全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、多重基因表達分析提供了操作平臺。請在參閱圖2,并結(jié)合參閱圖I所示,本發(fā)明為一種固相-數(shù)字PCR芯片,包括—基片10 ;基片10材料為娃片、石英片、光纖面板或有機薄片；一微孔陣列11，該微孔陣列11通過光刻工藝和兩步刻蝕工藝制作在基片10上，微孔陣列11以矩形、環(huán)形、鏡像或密排等形式陣列排布，微孔陣列11數(shù)目大于5000，其深度大于5微米，微孔陣列11中的微孔形狀為正多邊形或圓形，正多邊形或圓形大小取決于后續(xù)生物反應(yīng)所需要的體量，正多邊形的外接圓的直徑或圓形的直徑大于5微米，微孔陣列11中的各個微孔之間通過孔壁的隔離形成的獨立反應(yīng)池。孔壁的厚度取決于后續(xù)生物反應(yīng)的檢測方式，孔壁厚度大于2微米；一蓋片12 ;蓋片12材料為石英片或硅片；一 PDMS膜13，該PDMS膜13通過旋涂、加熱固化在蓋片12表面；蓋片12上旋涂的PDMS膜13的厚度為5微米到500微米，該基片10，微孔陣列11，蓋片12與PDMS膜13形成了固相-數(shù)字PCR芯片。綜上所述，固相-數(shù)字PCR芯片及其制作方法至少有以下優(yōu)點I.本發(fā)明固相-數(shù)字PCR芯片提出了一種結(jié)合固相PCR及數(shù)字PCR的雙層芯片結(jié)構(gòu)。2.本發(fā)明固相-數(shù)字PCR芯片制作工藝簡單，操作簡便，同時兼具可靠性高、成本低廉等特點。3.本發(fā)明固相-數(shù)字PCR芯片微孔深度、孔徑大小、孔壁厚度均有很大的調(diào)節(jié)范圍，適合多種應(yīng)用需求。4.本發(fā)明固相-數(shù)字PCR芯片綜合了固相PCR高通量、低干擾、易純化的優(yōu)勢同時兼具數(shù)字PCR低濃度定量檢測的特點，適用于低濃度、稀有樣品DNA定量檢測。5.本發(fā)明固相-數(shù)字PCR芯片可逆鍵和為后續(xù)使用蓋片固相PCR產(chǎn)物做全基因組測序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析、多重基因表達分析等提供良好的操作平臺。
以上所述，僅是本發(fā)明的實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，凡是依據(jù)本發(fā)明技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所做的任何簡單修改、等同變化與修飾，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，因此本發(fā)明的保護范圍當(dāng)以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟 步驟I:取一基片，去除表面有機及無機雜質(zhì)，并進行真空干燥； 步驟2 :在基片正面生長犧牲層； 步驟3 :通過光刻工藝和刻蝕工藝將掩模圖形轉(zhuǎn)移到犧牲層上； 步驟4 :以犧牲層為掩膜，通過刻蝕工藝，在基片上形成微孔陣列； 步驟5 :取一蓋片，去除表面有機及無機雜質(zhì)，并進行真空干燥； 步驟6 :在蓋片正面旋涂PDMS膜，并加熱使PDMS膜固化； 步驟7 :對PDMS膜進行表面處理，并將DNA探針結(jié)合在PDMS膜的表面； 步驟8 :將基片與蓋片鍵合，使基片上微孔陣列中的每個微孔形成獨立反應(yīng)池，形成固相-數(shù)字PCR芯片。
2.如權(quán)利要求I所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述基片上微孔陣列以矩形、環(huán)形、鏡像或密排的形式排布，且微孔數(shù)目大于5000，其微孔深度大于5微米。
3.如權(quán)利要求2所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述基片上微孔陣列中的微孔形狀為正多邊形或圓形，正多邊形的外接圓的直徑或圓形的直徑大于5微米，微孔的孔壁厚度大于2微米。
4.如權(quán)利要求I所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述基片的材料為硅片、石英片、光纖面板或有機薄片。
5.如權(quán)利要求I所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述蓋片上旋涂的PDMS膜的厚度為5微米到500微米。
6.如權(quán)利要求5所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述蓋片上PDMS膜表面處理方式為氧等離子體處理或表面活性劑處理。
7.如權(quán)利要求6所述的固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，其中所述蓋片的材料為石英片或硅片。
8.一種固相-數(shù)字PCR芯片，包括 一基片; 一微孔陣列，該微孔陣列通過光刻工藝和兩步刻蝕工藝制作在基片上； 一蓋片; 一 PDMS膜，該PDMS膜通過旋涂、加熱固化在蓋片表面； 該基片，微孔陣列，蓋片與PDMS膜形成了固相-數(shù)字PCR芯片。
9.如權(quán)利要求8所述的固相-數(shù)字PCR芯片，其中所述基片的材料為硅片、石英片、光纖面板或有機薄片。
10.如權(quán)利要求8所述的固相-數(shù)字PCR芯片，其中所述蓋片的材料為石英片或硅片。
11.如權(quán)利要求10所述的固相-數(shù)字PCR芯片，其中所述蓋片上旋涂的PDMS膜的厚度為5微米到500微米。
12.如權(quán)利要求8所述的固相-數(shù)字PCR芯片，其中所述基片上微孔陣列以矩形、環(huán)形、鏡像或密排的形式排布，且微孔數(shù)目大于5000，其微孔深度大于5微米。
13.如權(quán)利要求12所述的固相-數(shù)字PCR芯片，其中所述基片上微孔陣列中的微孔形狀為正多邊形或圓形，正多邊形的外接圓的直徑或圓形的直徑大于5微米，微孔的孔壁厚度大于2微米。
全文摘要
一種固相-數(shù)字PCR芯片的制作方法，包括如下步驟步驟1取一基片，去除表面有機及無機雜質(zhì)，并進行真空干燥；步驟2在基片正面生長犧牲層；步驟3通過光刻工藝和刻蝕工藝將掩模圖形轉(zhuǎn)移到犧牲層上；步驟4以犧牲層為掩膜，通過刻蝕工藝，在基片上形成微孔陣列；步驟5取一蓋片，去除表面有機及無機雜質(zhì)，并進行真空干燥；步驟6在蓋片正面旋涂PDMS膜，并加熱使PDMS膜固化；步驟7對PDMS膜進行表面處理，并將DNA探針結(jié)合在PDMS膜的表面；步驟8將基片與蓋片鍵合，使基片上微孔陣列中的每個微孔形成獨立反應(yīng)池，形成固相-數(shù)字PCR芯片。本發(fā)明具有制作簡單，易操作，成本低廉的優(yōu)點。
文檔編號C12M1/34GK102899244SQ201210369310
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月27日
發(fā)明者韓偉靜, 魏清泉, 孫英男, 李運濤, 俞育德, 周曉光 申請人:中國科學(xué)院半導(dǎo)體研究所