專利名稱：分枝桿菌屬檢測試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及ー種分枝桿菌屬檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
分枝桿菌屬(Mycobacterium)是ー類細(xì)長略帶彎曲的桿菌,有分枝生長的趨勢，因而得名。本菌屬種類較多，可分為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌和麻風(fēng)分枝桿菌三類。結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis),俗稱結(jié)核桿菌或結(jié)核菌,是引起結(jié)核病的病原菌。結(jié)核病是威脅人類及動物健康的重大傳染病。世界衛(wèi)生組織(WHO)專門發(fā)布了全球結(jié)核控制戰(zhàn)略，并把每年的3月24號定為世界防治結(jié)核病日。與結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對應(yīng)的是各種非結(jié)核分枝桿菌，目前已發(fā)現(xiàn)上百種，廣泛 存在于土壤、環(huán)境、動物中。2000年第四次全國結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報(bào)告顯示，我國現(xiàn)有活動性肺結(jié)核患者451萬，菌陽肺結(jié)核患者196萬。分枝桿菌培養(yǎng)陽性者中，結(jié)核分枝桿菌占86. 4%，牛結(jié)核分枝桿菌占2. 5%，非結(jié)核分枝桿菌占11. 1%。而1990年第三次全國結(jié)核病流調(diào)時(shí)非結(jié)核分枝桿菌僅占4. 9%，由此可見，非結(jié)核分枝桿菌的比率較前明顯增加。非結(jié)核分枝桿菌患者對大多數(shù)一線抗結(jié)核藥物耐藥，采用目前標(biāo)準(zhǔn)的化療方案治療無效。傳統(tǒng)的分枝桿菌菌種鑒定和藥敏實(shí)驗(yàn)方法建立在培養(yǎng)基礎(chǔ)上，煩瑣、費(fèi)吋，需I 2月時(shí)間，不能滿足臨床開展早期有效化療的需要，使非結(jié)核分枝桿菌患者經(jīng)長期規(guī)則化療而療效不佳，療程延長，成為難治、復(fù)治患者，細(xì)菌可能在局部播散。因此，分枝桿菌屬的快速鑒定對結(jié)核病及非結(jié)核分枝桿菌病的早期診斷、鑒別診斷、有效化療和控制傳播都有極其重要的意義。傳統(tǒng)分枝桿菌檢測方法，由于其檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測要求。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在ー些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點(diǎn)。而熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time PCR)技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜的定量測定儀器，因此不適用于現(xiàn)場快速檢測。而且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測技術(shù)快速簡便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中恒溫?cái)U(kuò)增(Isothermal Amplification)核酸快速檢測技術(shù)是病原核酸檢測技術(shù)上的長足進(jìn)步,現(xiàn)已建立起來的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)具有很多的優(yōu)越性。因此，需要一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的分枝桿菌屬檢測試劑盒及其使用方法以解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的分枝桿菌屬檢測試劑盒。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)ー種分枝桿菌屬檢測試劑盒，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒包括以分枝桿菌屬的hsp65基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物內(nèi)引物FIP/BIP和外弓丨物F3/B3，所述的兩對弓I物為外引物F3:(SEQ ID NO I)TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3:(SEQ ID NO 2)CGGCTCCGATGACCTTCTC內(nèi)引物FIP: (SEQ ID NO 3)
GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC內(nèi)引物BIP: (SEQ ID NO 4)AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG ；或外引物F3’ (SEQ ID NO 5)AGTCCATCGGTGACCTGATC外引物B3’ (SEQ ID NO 6)AGGACCGCCTCCTGAC內(nèi)引物FIP’ (SEQ ID NO 7)GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA內(nèi)引物BIP’ (SEQ ID NO 8)GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT ；或外引物F3” (SEQ ID NO I)TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3，，(SEQ ID NO 9)AGCGGCAGCAGRTCCT內(nèi)引物FIP”(SEQ ID NO 10)CGGTCACGAAGTACCCCGAGATCTGCAGCTCGAGCTCACC內(nèi)引物BIP” (SEQ ID NO 4)AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG ；其中，V代表 A/C/G，R 代表 A/G。本發(fā)明針對分枝桿菌屬的hsp65基因設(shè)計(jì)引物，所述hsp65基因?yàn)?5kDa熱休克蛋白(heat shock protein)基因，由于該基因高度保守并廣泛存在于各分枝桿菌屬菌種中，因此其引物能夠擴(kuò)增并檢測出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群及非結(jié)核分枝桿菌所有菌種，包括結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、田鼠分枝桿菌(M. microti)、非洲分枝桿菌(M. africanum)、牛分枝桿菌(M. bovis)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)、龜分枝桿菌(M. chelonae)、偶發(fā)分枝桿菌(M. fortuitum)、戈登分枝桿菌(M. gordonae)、海分枝桿菌(M. marinum)、恥垢分枝桿菌(M. smegmatis)、土分枝桿菌(M. terrae)、鳥分枝桿菌(M. avium)、草分枝桿菌(M. phlei )、瘰病分枝桿菌(M. scrofulaceum)、胺腫分枝桿菌(Μ· abscessus)、潰瘍分枝桿菌(Μ· ulcerans)、施氏分枝桿菌(M. shimoidei)、亞洲分枝桿菌(M. asiaticum)、蟾蜍分枝桿菌(M. xenopi)、胃分枝桿菌(M. gastri)。作為本發(fā)明分枝桿菌屬檢測試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒還包括BstDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液。作為本發(fā)明分枝桿菌屬檢測試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述的BstDNA聚合酶酶濃度4-10U/ μ L ；所述的反應(yīng)液含I.6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L(NH4)2S04、8 10mmol/L MgS04、0. I 0· 125 體積％ TritonX-100、0. 8 lmol/L甜菜堿；所述的樣品預(yù)處理液含10 20mmol/L pH 8· O 的 Tris-HCl、I 2mmol/LEDTA和 I I. 2 體積 %Triton X-100 ;所述的顯色液為SYBR Green I 或 Eva Green ；所述穩(wěn)定液為石蠟油；所述的陽性對照為BCG基因組DNA ；所述的內(nèi)引物FIP/BIP各為0. 2 0. 25 μ mol/L，外引物F3/B3的濃度各為I. 2
2.O μ mol/し作為本發(fā)明分枝桿菌屬檢測試劑盒的最優(yōu)選實(shí)施方式，所述的BstDNA聚合酶酶濃度8U/ μ L ;所述的反應(yīng)液含2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-HCl ,12. 5mmol/L KCl,12. 5mmol/L (NH4) 2S04、lOmmol/L MgS04、0. 125 體積％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿；所述的樣品預(yù)處理液含20mmol/LpH 8. O 的 Tris-HCl、2mmol/L EDTA 和 I. 2 體積 %Triton X-I00 ;所述的顯色液為SYBR Green I ；所述的內(nèi)引物FIP/BIP的濃度為0. 2 μ mol/L ；所述的外引物F3/B3的濃度為I. 6 μ mol/L。作為本發(fā)明分枝桿菌屬檢測試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B兩個(gè)空腔的縱向延伸的隔板。作為本發(fā)明分枝桿菌屬檢測試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述的A、B兩個(gè)空腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個(gè)空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應(yīng)液和BstDNA聚合酶的混合而成。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)是ー種快速、靈敏、準(zhǔn)確的核酸檢測方式，其擴(kuò)增效率超強(qiáng)，表現(xiàn)在兩個(gè)方面(I)靈敏度比PCR高出的是數(shù)量級的差異；(2)擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA數(shù)量，也比PCR產(chǎn)物高出太多，能夠達(dá)到幾個(gè)μ g，但過于靈敏和產(chǎn)物量的巨大，使得LAMP極其容易污染，尤其是在LAMP擴(kuò)增反應(yīng)后需要反應(yīng)管開蓋加入顯色劑，容易出現(xiàn)氣溶膠污染。而氣溶膠污染會使得檢測結(jié)果假陽性率高，并且污染其他樣品，污染檢測區(qū)域，同時(shí)還難以去除。本發(fā)明的反應(yīng)管通過隔板和穩(wěn)定液的設(shè)計(jì)，有效地將顯色液和工作液分隔開來，不僅能保證在儲運(yùn)過程中相對保持完整封閉性，而且無需打開管蓋，就可以實(shí)現(xiàn)顯色反應(yīng)，大大降低氣溶膠的污染。本發(fā)明還提供一種分枝桿菌屬檢測試劑盒的使用方法，該方法包括如下步驟(I)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；( 2)將步驟(I)的沉淀加入樣品預(yù)處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA;(3)在反應(yīng)容器中加入Bst DNA聚合酶O. 9 I. 8體積份數(shù)、反應(yīng)液38 40體積份數(shù)、穩(wěn)定液52 54. 5體積份數(shù)、樣品模板DNA 4. 5、體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應(yīng)；(4)在上述反應(yīng)容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；
所述步驟(3)中的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以分枝桿菌屬的hsp65基因?yàn)榘谢颉⒒诃h(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物。作為本發(fā)明使用分枝桿菌屬檢測試劑盒的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(3)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65°C，反應(yīng)時(shí)間45 90min。本發(fā)明所說的基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermalamplication of DNA,簡稱LAMP)快速檢測分枝桿菌屬的方法，是利用BstDNA聚合酶和根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)的兩對特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動互補(bǔ)鏈合成，結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP反應(yīng)過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(63 65°C )條件下45 90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時(shí)間長、容易污染及檢測成本高等缺點(diǎn)。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是ー種簡便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技木)進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技木，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技木。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合生化分析和血清學(xué)分型鑒定的通行方法，初歩鑒定需2 3天，完成鑒定報(bào)告需10 15天；采用本發(fā)明的檢測試劑盒僅需2小吋。并且，本發(fā)明的反應(yīng)體系中加入了顯色液，鑒定結(jié)果更為直觀清晰。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的檢測試劑盒只需ー個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性；3.本發(fā)明的檢測試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到I小時(shí)即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率高；4.本發(fā)明的檢測試劑盒靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠；6.由于選擇了高保守性的hsp65基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物，使得本發(fā)明的檢測試劑盒檢測分枝桿菌屬的準(zhǔn)確率更高；7.在本發(fā)明檢測試劑盒中采用特制的反應(yīng)管，減少了氣溶膠污染的可能性，同時(shí)方便操作。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。下列縮略語適用于本發(fā)明LAMP loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增 dNTP deoxyribonucleoside triphosphate,脫氧核苷三憐酸Bst 酶Bst DNA polymerase (large fragment), Bst DNA 聚合酶(大片段)EDTA ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸
DNA deoxyribonucleic acid,脫氧核糖核酸Betaine :甜菜堿Triton X-100 :聚乙二醇辛基苯基醚hsp65 :65kDa 熱休克蛋白BCG :卡介苗實(shí)施例I試劑盒的制備(I)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物外引物F3:(SEQ ID NO I)TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3 (SEQ ID NO 2)CGGCTCCGATGACCTTCTC內(nèi)引物FIP: (SEQ ID NO 3)GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC內(nèi)引物BIP:(SEQ ID NO 4)AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG(V 代表 A/C/G)(2)購置DNA聚合酶BstDNA聚合酶置于容器；(3)配制反應(yīng)液和引物反應(yīng)液含有 2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris_Cl、12. 5mmol/L KCl、12. 5mmol/L (NH4)2S04、lOmmol/L MgS04、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各0. 2 ii mol/L和外引物F3/B3各0. 25 y mol/L,置于容器；(4)配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液含有20mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)、2mmol/L EDTA 和 I. 2 體積 %Triton X-100,置于容器；(5)購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；(6)購置顯色液SYBR Green I，置于容器；(7)提取陽性對照提取BCG基因組DNA，置于容器；(8)將上述7個(gè)容器裝成試劑盒，封裝。制備工藝簡述如下I、將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質(zhì)檢；
2、將上述(2) (4)步驟配制的液體無菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢；3、將穩(wěn)定液分裝，抽樣質(zhì)檢；4、將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；5、組裝試劑盒。實(shí)施例2試劑盒的制備(I)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物外引物F3:(SEQ ID NO I)TCATCACCGTCGAGGAGTC 外引物B3 (SEQ ID NO 2)CGGCTCCGATGACCTTCTC內(nèi)引物FIP: (SEQ ID NO 3)GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC內(nèi)引物BIP: (SEQ ID NO 4)AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG(V 代表 A/C/G)(2)購置DNA聚合酶BstDNA聚合酶置于容器；(3)配制反應(yīng)液和引物反應(yīng)液含有 I. 6mmol/LdNTP、20mmol/L Tris-ClUOmmol/L KClUOmmol/L (NH4) 2S04、8mmol/L MgS04、0. I 體積 ％ TritonX_100、0. 8mol/L 甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各0. 2 ii mol/L和外引物F3/B3各0. 25 y mol/L,置于容器；(4)配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液含有10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0)、lmmol/L EDTA 和 I. 0 體積 %Triton X-100,置于容器；(5)購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；(6)購置顯色液EVA Green I,置于容器；(7)提取陽性對照提取BCG基因組DNA，置于容器；(8)將上述7個(gè)容器裝成試劑盒，封裝。其他同實(shí)施例I。實(shí)施例3試劑盒的制備其他條件與實(shí)施例I相同，其不同僅在于步驟(I)中的引物為外引物F3’ (SEQ ID NO 5)AGTCCATCGGTGACCTGATC外引物B3’ (SEQ ID NO 6)AGGACCGCCTCCTGAC內(nèi)引物FIP’ (SEQ ID NO 7)GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA內(nèi)引物BIP’ (SEQ ID NO 8)GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT實(shí)施例4試劑盒的制備其他條件與實(shí)施例I相同，其不同僅在于步驟(I)中的引物為
外引物F3”(SEQ ID NO I)TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3”(SEQ ID NO 9)AGCGGCAGCAGRTCCT內(nèi)引物FIP”(SEQ ID NO 10)CGGTCACGAAGTACCCCGAGATCTGCAGCTCGAGCTCACC內(nèi)引物BIP”(SEQ ID NO 4)AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG (V 代表 A/C/G，R 代表 A/G)實(shí)施例5分枝桿菌屬檢測試劑盒的應(yīng)用一、方法和材料I、菌株本發(fā)明采用菌株有29株，主要來源于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心、中國藥品生物制品檢定所。詳見表I。表I菌株名稱及來源
權(quán)利要求
1.一種分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒包括以分枝桿菌屬的hsp65基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3，所述的兩對引物為 外引物F3 TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3 CGGCTCCGATGACCTTCTC內(nèi)引物FIP GTCGGTCACGAAGTACCCCGAGCTGCAGCTCGAGCTCACC內(nèi)引物BIP AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG ； 或 外引物F3’ AGTCCATCGGTGACCTGATC外引物B3’ AGGACCGCCTCCTGAC內(nèi)引物FIP’ GGTGTTGGACTCCTCGACGGGCCGAGGCGATGGACAA內(nèi)引物BIP’ GCAGCTCGAGCTCACCGAGCGGGTCGGTCACGAAGT ； 或 外引物F3”TCATCACCGTCGAGGAGTC外引物B3”:AGCGGCAGCAGRTCCT內(nèi)引物FIP”CGGTCACGAAGTACCCCGAGATCTGCAGCTCGAGCTCACC內(nèi)引物BIP”AGCGTCAGGAGGCVGTCCTTGACAGTGGACACCTTGGAG ； 其中，V代表A/C/G，R代表A/G。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒還包括BstDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于， 所述的BstDNA聚合酶酶濃度4-10U/ u L ； 所述的反應(yīng)液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/LKCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2S04、8 lOmmol/L MgS04、0. I 0. 125 體積％ TritonX-100、0.8 lmol/L甜菜堿； 所述的樣品預(yù)處理液含10 20mmol/L pH 8. 0的Tris_HCl、l 2mmol/LEDTA和I 1.2 體積 %Triton X-100 ;所述的顯色液為SYBR Green I或Eva Green ； 所述穩(wěn)定液為石蠟油； 所述的陽性對照為BCG基因組DNA ； 所述的內(nèi)引物FIP/BIP各為0. 2 0. 25 ii mol/L,外引物F3/B3的濃度各為I. 2 2.0 u mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于， 所述的BstDNA聚合酶酶濃度8U/ ii L ; 所述的反應(yīng)液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L(NH4) 2S04、10mmol/L MgS04、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿； 所述的樣品預(yù)處理液含20mmol/L pH 8. 0的Tris_HCl、2mmol/L EDTA和I. 2體積 %Triton X-I00 ; 所述的顯色液為SYBR Green I ； 所述的內(nèi)引物FIP/BIP的濃度各為0. 2 u mol/L ； 所述的外引物F3/B3的濃度各為I. 6 ii mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2、3或4所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B兩個(gè)空腔的縱向延伸的隔板。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒，其特征在于，所述的A、B兩個(gè)空腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個(gè)空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應(yīng)液和BstDNA聚合酶的混合而成。
7.一種使用如權(quán)利要求2所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 (1)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀； (2)將步驟(I)的沉淀加入樣品預(yù)處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA ； (3)在反應(yīng)容器中加入BstDNA聚合酶0. 9 I. 8體積份數(shù)、反應(yīng)液38 40體積份數(shù)、穩(wěn)定液52 54. 5體積份數(shù)、樣品模板DNA 4. 5、體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應(yīng)； (4)在上述反應(yīng)容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性； 所述步驟(3)中的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以分枝桿菌屬的hsp65基因?yàn)榘谢颉⒒诃h(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的使用分枝桿菌屬檢測試劑盒的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65°C，反應(yīng)時(shí)間45 90min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分枝桿菌屬檢測試劑盒，所述的分枝桿菌屬檢測試劑盒包括以分枝桿菌屬的hsp65基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本發(fā)明的分枝桿菌屬檢測試劑盒檢測效果更全面、漏檢率低。
文檔編號C12Q1/68GK102827944SQ201210352230
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月19日
發(fā)明者曹以誠, 茅莉娜, 陳振柳, 杜正平, 王靜, 呂冰凌 申請人:廣州華峰生物科技有限公司