小麥條銹病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種小麥條銹病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的與植物銅離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白，1）由序列表中序列4、5或6所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；2）將1）中的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列2所示植物銅離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)。小麥植株顯現(xiàn)明顯的條銹病抗性喪失表型。將小麥中的上述編碼基因突變，破壞，敲除或者基因沉默等抑制上述編碼基因在植物中的表達，可以降低小麥對條銹病的抗性，對于研究小麥條銹病，提供敏感型株系，為小麥抗病基因的研究作出貢獻。
【專利說明】小麥條銹病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種小麥條銹病抗性相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在漫長的進化過程中，植物產(chǎn)生了復(fù)雜的機制來識別病原菌的侵染并觸發(fā)自身有效的免疫反應(yīng)。植物先天免疫體系包括兩大分支，一個是PAMP (pathogen-associatedmolecular pattern)觸發(fā)的免疫系統(tǒng)(PAMP-triggered immunity, PTI)，它是通過跨膜的受體蛋白PRRs (pattern recognition receptors)與PAMP相互應(yīng)答而產(chǎn)生的早期對病原菌的抗性反應(yīng)；另一個是效應(yīng)子觸發(fā)的免疫系統(tǒng)(effector-triggered immunity,ETI)，它是通過植物抗性基因(R基因)編碼的R蛋白對由病原菌無毒基因(Avr基因)編碼的效應(yīng)子進行直接或間接的識別而產(chǎn)生的免疫反應(yīng)(Chisholm ST, Coaker G，DayB,Staskawicz BJ.(2006).Host-microbe interactions: shaping the evolution of theplant immune response.Cel1124:803-814;Nimchuk Z，Eulgem Tj Holt III BF，DanglJL.(2003).Recognition and response in the plant immune system.Annu.Rev.Genet.37:579-609)。植物的免疫反應(yīng)是受抗性蛋白調(diào)控的，抗性蛋白通過識別特定的病原菌分子一Avr蛋白來起作用。植物受到病原菌侵染后，在抗性蛋白的作用下產(chǎn)生一些抗性反應(yīng)，包括離子流動加快，活性氧的產(chǎn)生等。這些反應(yīng)常常誘發(fā)超敏反應(yīng)(HR)，從而引起侵染點的程序性細胞死亡(PCD)等。TaSGTl在植物受到病原菌侵染的情況下，通過與熱激蛋白90及RARl基因組成復(fù)合體，或是直接與植物抗性基因NBS-LRR類蛋白的LRR域互作(LiuY，Burch-Smith T，Schiff Mj Feng S，Dinesh-Kumar SP.(2004).Molecular chaperoneHsp90associates with resistance protein N and its signaling proteins SGTl andRarl to modulate an innate immune response in plants.J Biol Chem279:2101—2108 ;Bieri S，Mauch S，Shen QH，Peart Jj Devoto A，Casais C，Ceron Fj Schulze S，SteinbissHH，Shirasu Kj Schulze-Lefert P.(2004).RARlpositively controls steady statelevels of barley MLA resistance proteins and enables sufficient MLA6accumulation for effective resistance.Plant Ce 1116:3480—3495;LeisterRT，Dahlbeck Dj Day B，Li Y，Chesnokova 0, Staskawicz BJ.(2005).Molecular geneticevidence for the role of SGTl in the intramolecular complementation of Bs2protein activity in Nicotiana benthamiana.Plant Celll7:1268-1278)參與病原菌的抗性反應(yīng)，而提高植物的抗病性。[0003]大麥條紋花葉病毒(BarleyStripe Mosaic Virus，BSMV)為 α、β、3 條鏈組成3鏈RNA病毒(結(jié)構(gòu)如圖1所示，外源基因片段(如TaPDS)反向插入Y鏈Yb基因突變的終止子處)。利用BSMV-based介導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)被成功用于大麥和小麥功能基因的研究上(Hein I, Barciszewska-Pacak Mj Hrubikova K, Williamson S，Dinesen Mj SoenderbyIE,Sundar S，Jarmolowski A，Shirasu K，Lacomme C.(2005).Virus-1nduced GeneSilencing-Based Functional Characterization of Genes Associated with PowderyMildew Resistance in Barley.Plant Physiologyl38:2155-2164 ；Zhou HB, Li SF, DengZY, Wang XP, Chen T,Zhang JS, Chen SY, Ling HQ, Zhang AM, Wang Dff, Zhang XQ.(2007).Molecular analysis ofthree new receptor-like kinase genes from hexaploid wheatand evidence for their participation in the wheat hypersensitive responseto stripe rust fungus infection.The Plant Journal52,420 - 434.；ffang G, WeiX, Fan R, Zhou H, Wang X.Yu C, Dong L, Wang X, Kang Z, Ling H, Shen Q, Wang D, ZhangX.(201I)Molecular analysis of common wheat genes encoding three types ofcytosolic heat shock protein90(hsp90): functional involvment of ctosolichsp90s in the control of wheat seedling growth and disease resistance.NewPhytol., 191:418-431)。本研究所用的BSMV病毒載體是由 Andy Jackson教授(Universityof California, Berkeley)饋贈。當BSMV侵染植物時，植物通過DCL4和DCL2產(chǎn)生相應(yīng)的siRNA對病毒RNA進行剪接，由此抵御病毒的傷害。但病毒RNA中攜帶有外源基因片段時，其siRNA也會導(dǎo)致植物內(nèi)源基因的沉默，由此產(chǎn)生植物基因沉默的表型(DekerisA.,Gallego-Bartolome J.,Bao J.,Kasschau K., Carrington J., Voinnet 0.(2006).Hierarchical Action and Inhibition of Plant Dicer-Like Proteins inAntiviralDefense.Science.313 (5783) ,68-71)。分子病毒學研究表明，在Yb基因后插入外源片段時不影響其對植物的侵染活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的一個目的是提供一種小麥條銹病抗性相關(guān)基因及其編碼蛋白。
[0005]本發(fā)明所提供的小麥條銹病抗性相關(guān)的一類蛋白，名稱為TaSGTl,來源于小麥(Triticum aestivum L.)，分別編號為 TaSGTl_3A, TaSGTl_3B 和 TaSGTl_3D，是如下 1)-6)中任意一項所述的蛋白質(zhì):
[0006]I)由序列表中序列4所示的氨基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；
[0007]2)將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列4所示植物與條銹病抗性相關(guān)的相同活性的蛋白質(zhì)分子伴侶蛋白；
[0008]3)由序列表中序列5所不的氣基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；
[0009]4)將序列表中序列5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列5所示植物銅離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)；
[0010]5)由序列表中序列6所不的氣基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)；
[0011]6)將序列表中序列6的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列6所示植物銅離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)。
`[0012]序列表中序列4由378個氨基酸殘基組成；序列表中序列5由377個氨基酸殘基組成；
[0013]序列表中序列7由377個氨基酸殘基組成。他們之間具有非常高的同源性，只有四個氨基酸殘基的差異，并且功能相同。
[0014]為了使1)、3)或5)中的TaSGTl便于純化，可在由序列表中序列4_6所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。[0015]表1.標簽的序列
[0016]
標簽殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個)RRRRR
Poly-His2-10(通常為 6 個)HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL
[0017]上述2)、4)或6)中的TaSGTl可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述2)、4)或6)中的TaSGTl的編碼基因可通過將序列表中序列1、序列2或序列3所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
[0018]上述小麥條銹病抗性相關(guān)蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，
[0019]所述序列表中序列4所述蛋白的編碼基因的序列是下列脫氧核苷酸序列之一:
[0020]I)序列表中序列I的DNA序列；
[0021]2)序列表中序列I的自5'末端第1—1134位脫氧核糖核苷酸；
[0022]3)編碼序列表中序列4所`示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；
[0023]4)在嚴格條件下與I)或2)或3)的基因雜交且編碼序列表中序列4所示蛋白的基因;
[0024]5)與I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼序列表中序列4所述蛋白的基因。
[0025]所述序列表中序列5所述蛋白的編碼基因的序列是下列脫氧核苷酸序列之一:
[0026]I)序列表中序列2的DNA序列；
[0027]2)序列表中序列2的自5'末端第1-1131位脫氧核糖核苷酸；
[0028]3)編碼序列表中序列5所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；
[0029]4)在嚴格條件下與I)或2)或3)的基因雜交且編碼序列表中序列4所示蛋白的基因;
[0030]5)與I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼序列表中序列4所示蛋白的基因；
[0031]所述序列表中序列6所述蛋白的編碼基因的序列是下列脫氧核苷酸序列之一:
[0032]I)序列表中序列3的DNA序列；
[0033]2)序列表中序列3的自5'末端第1-1131位脫氧核糖核苷酸；
[0034]3)編碼序列表中序列6所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；
[0035]4)在嚴格條件下與I)或2)或3)的基因雜交且編碼序列表中序列4所示蛋白的基因;[0036]5)與I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼序列表中序列4所示蛋白的基因。
[0037]序列表中的序列I由1337個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第1-1334位堿基，編碼具有序列表中序列4的氨基酸序列的蛋白。序列表中的序列2由1334個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第1-1131位堿基，編碼具有序列表中序列5的氨基酸序列的蛋白。序列表中的序列3由1334個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5'末端第1-1131位堿基，編碼具有序列表中序列6的氨基酸序列的蛋白。
[0038]含有上述基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組工程菌。以及權(quán)利要求7所述的蛋白或其編碼基因在培育條銹病抗性提高或降低的小麥中的應(yīng)用。
[0039]本發(fā)明所提供的培育條銹病抗性降低的小麥的方法，是抑制小麥中基因組中序列表中序列I所不基因、序列2所不基因和序列3所不基因中的一種或者兩種以上基因的表達，篩選得到條銹病抗性降低的小麥植株。
[0040]其中，所述抑制小麥中基因組中序列表中序列I所不基因、序列2所不基因和序列3所示基因中的一種或者兩種以上基因的表達的方法包括突變或敲除小麥中的所述基因的全部或者部分序列，或者使用干擾RNA干擾所述基因的表達，或者使用BSMV-basedVIGS介導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)使所述基因沉默。
[0041]所述使用BSMV-based VIGS介導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)使所述基因沉默的方法，是將序列表中序列I所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段插入到BSMV-based VIGS的RN A Y鏈Y b基因后與BSMV病毒載體α、β混合后獲得重組病毒，將該重組病毒侵染小麥，篩選得到序列表中序列I所示基因、序列2所示基因和序列3所示基因中的一種或者兩種以上基因沉默的轉(zhuǎn)基因小麥。
[0042]所述序列表中序列I所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段為序列優(yōu)選為自序列表中序列I的5’端第534-968位核苷酸序列的DNA片段；所述DNA片段插入到BSMV-based VIGS的\質(zhì)粒的NheI位點。
[0043]本發(fā)明還提供一種用于培育條銹病抗性降低的小麥的重組病毒，是將序列表中序列I所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段插入到BSMV-basedVIGS的RNAy鏈Yb基因與BSMV病毒載體α、β混合后獲得的重組病毒。
[0044]本發(fā)明人從普通小麥(Triticum aestivum L.)品種小偃54中克隆到一類SGTl基因，命名為TaSGTl。構(gòu)建了用于沉默小麥中TaSGTl基因的病毒誘導(dǎo)性載體，侵染普通小麥品種水原11，降低TaSGTl基因的表達，接種條銹病CYR17，小麥葉片上出現(xiàn)許多條銹菌孢子堆，小麥植株顯現(xiàn)明顯的條銹病抗性喪失表型。將小麥中的上述編碼基因突變，破壞，敲除或者基因沉默等抑制上述編碼基因在植物中的表達，可以降低小麥對條銹病的抗性，反之推測，提聞小麥中該類基因的表達可能能夠提聞小麥對于條鎊病的抗性，對于研究小麥條銹病，提供敏感型株系，為小麥抗病基因的研究作出貢獻。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1為BSMV-based VIGS系統(tǒng)載體結(jié)構(gòu)示意圖，以TaPDS基因為例作為外源基因片段反向插入Y鏈Yb基因突變的終止子處。
[0046]圖2為基因沉默后TaSGTl的表達情況。[0047]圖3為病毒誘導(dǎo)TaSGTl基因沉默后水原11對條銹菌小種CYR17的抗性變化。【具體實施方式】
[0048]下面通過實施例詳細描述本發(fā)明。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，下述實施例不是用于限制的目的，本發(fā)明的實質(zhì)性的保護范圍由后附的權(quán)利要求所界定。
[0049]下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0050]下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量
[0051]實施例中所用試劑如下:
[0052]高保真Pyrobest Taq、Premix Ex Taq、RNA酶抑制劑、各種限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、pMD18-T Vector購自大連寶生物(TaKaRa)公司；DNA純化回收試劑盒購自天根生物技術(shù)公司；轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑盒購自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。
[0053]實施例1、條銹病抗性降低的小麥的獲得方法及其效果驗證
[0054]—、小麥條銹病抗性相關(guān)基因的獲得
[0055]取生長7天的普通小麥品種小偃54 (該品種是2000年8月通過陜西省農(nóng)作物品種審定委員會審定，吳會杰，魏學寧，周新力，曹雙河，李宏偉，王獻平，童一平，井金學，張相岐。小偃54和小偃81高溫抗條銹性及其與幾丁質(zhì)酶基因表達的關(guān)系。麥類作物學報，2007, 27 (6):1117-1122公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得)幼苗葉片為材料，洗凈后放入經(jīng)DEPC處理、滅菌后研缽中研磨粉碎,加入TRIzol (Invitrogen)研磨、勻漿，室溫放置5分鐘，加入氯仿抽提2次，取上清，用異丙醇沉淀總RNA，空氣干燥后，溶于適量DEPC水。以帶polyT的引物(TaKaRa)進行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。
[0056]RT PCR反應(yīng)條件如下:
[0057]DEPC水2 μ L，總RNAl μ g, Oligo dT_引物I μ L (初濃度IOmM),整個體系總體積6 μ L。70度保溫10分鐘，立刻置于冰上2分鐘，再在上述體系中加入dNTP0.5 μ L (dATP，dGTP，dTTP，dCTP分別IOmM), RNase抑制劑0.25 μ L(1個單位)，10倍反轉(zhuǎn)錄緩沖液I μ L，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0.25 μ L (I個單位)，DEPC水2 μ L，整個體系總體積10 μ L。42度保溫60分鐘，70度保溫15分鐘，反應(yīng)完成后置于4度。
[0058] 取上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以以下引物進行擴增。
[0059]正向引物:SGTl-F:5' -CCGTCGATCTCTATTCACCTCTC-3'
[0060]反向引物:SGTl-R:5' -ACAACATGGATGATCTGGATTC-3'；
[0061]PCR 條件:94 0C Imin,然后 94 °C 15s, 58 °C 15s, 72 °C 2min30 個循環(huán)，最后72 °C 5min。
[0062]PCR產(chǎn)物為大小約1.1kb的片段，將PCR產(chǎn)物連接到pMD18_T載體(TaKaRaBiotech)上用于測序,采用本領(lǐng)域公知公用的DNAman軟件進行序列拼接后，在萬維網(wǎng)上NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析，確證通過上述PCR反應(yīng)克隆到的是SGTl類得基因片段。利用這對引物組合，從普通小麥品種小偃54中克隆到了 3條不同的cDNA序列，即3個SGTl基因.統(tǒng)稱為TaSGTI，分別編號為TaSGT1-3A, TaSGT1-3B和TaSGT1-3D，其中，TaSGTl-3A具有序列表中序列I的核苷酸序列，其編碼的氨基酸長度378個氨基酸殘基，序列為序列表中序列4所示的氨基酸殘疾序列，TaSGTl-3B具有序列表中序列2的核苷酸序列，其編碼的氨基酸長度377個氨基酸殘基，序列為序列表中序列5所示的氨基酸殘疾序列，TaSGTl-3D具有序列表中序列3的核苷酸序列，，其編碼的氨基酸長度377個氨基酸殘基，序列為序列表中序列6所示的氨基酸殘疾序列。三個基因間的序列相似性非常高，核苷酸和氨基酸序列相似性都在98%以上。將TaSGTl-3A連接到pMD18_T載體得到的重組載體命名為pMD18-TaSGTl-3A，將TaSGTl_3B連接到pMD18_T載體得到的重組載體命名為pMD18-TaSGTl-3B，將TaSGTl_3D連接到pMD18_T載體得到的重組載體命名為pMD18-TaSGTl-3D。
[0063]二、基因沉默建立條銹病抗性降低的小麥株系
[0064]1、病毒載體BSMV-based VIGS系統(tǒng)的構(gòu)建
[0065]小麥品種水原11 (Zhou HB, Li SF, Deng ZY，Wang XP，Chen T, Zhang JS, ChenSY, Ling HQ, Zhang AM, Wang Dff, Zhang XQ.(2007).Molecular analysis of threenew receptor-like kinase genes from hexaploid wheat and evidence for theirparticipation in the wheat hypersensitive response to stripe rust fungusinfection.The Plant Journal 52, 420-434.由韓國引進的品種，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得):抗旱的普通小麥(Triticum aestivum L.)品種，基因組為AABBDD (六倍體)，以步驟I中獲得的質(zhì)粒pMD18-TaSGTl-3D作為模板，選取三個SGTl基因保守區(qū)段，利用引物組合 SGT1-VF1:5 ’ -ATTGCTAGCTACAGGCATGACTACTACAA-3，; SGT1-VR1:5’ -TAAGCTAGCTCACTGTAAATTTCACGGA-3’，擴增得到 452bp 的片段(自序列 I 的 5 '端第534-986位核苷酸)。按照常規(guī)分子生物學手段進行載體構(gòu)建(參見“精編分子生物學實驗指南”2001，科學出版社，顏子穎，王海林譯)。將該擴增片段經(jīng)NheI酶切后，回收，將片段克隆到 BSMV-based VIGS 系統(tǒng)載體(Holzberg S.,Brosio P.,Gross C.，Pogue G.(2002)Barley stripe mosaic virus-1nduced gene silencing in a monocot plant.PlantJ.，30:315-327，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得)、質(zhì)粒的NheI位點(RNAy鏈Yb基因后)得到重組載體，將該重組載體用SGTl-VRl和引物Y-strain-p5,-CAACTGCCAATCGTGAGTAGG-3丨PCR擴增鑒定篩選反向插入的載體，擴增獲得520bp片段的載體即為反向插入上述SGTl-VFl和SGTl-VRl擴增的片段的載體，并對插入片段進行測序驗證，將該鑒定正確的載體命名為sgtl，又稱，sgtl與α和β質(zhì)粒共同構(gòu)成了可沉默TaSGTl基因的BSMV:SGT1病毒系統(tǒng)(圖1，以TaPDS為例說明外源基因片段插入位置及方向)。
[0066]2、條銹病抗性降低的小麥株系即病毒載體誘導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)的建立[0067]BSMV病毒載體 α、β 和GFP(BSMV:GFP)質(zhì)粒(Holzberg S.,Brosio P.,Gross C.，Pogue G.(2002) Barley stripe mosaic virus-1nduced gene silencing in a monocotplant.Plant J.，30:315-327)組成BSMV:GFP病毒載體，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得。
[0068]利用引物VPDS-Pl:5' -AGGGCTAGCCTGATCGAGTCAACGACGA-3'和VPDS-P25' -CAGGCTAGCGATGACACCCAAAGACTGAATGTGG-3'擴增小偃 54cDNA，擴增得到的片段為 TaPDS，將該擴增片段經(jīng)NheI酶切后，回收，將片段克隆到BSMV-based VIGS系統(tǒng)載體Y質(zhì)粒的NheI位點，將該鑒定正確的載體命名為H)S，PDS與α和β質(zhì)粒共同構(gòu)成了可沉默TaPDS基因的病毒系統(tǒng)BSMV = PDS病毒載體。
[0069]待水原11生長至二葉期時，將BSMV病毒涂抹接種于植株平展的第二葉上，BSMV:GFP病毒表達Yb-GFP融合蛋白后能使植株葉片上呈現(xiàn)可視的病毒斑。為了進一步確認病毒的侵染，利用特異引物對BSMV外殼蛋白基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行了檢測。具體方法如下所述:
[0070]按照GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit (Sigma)說明書分別抽提 BSMV 病毒載體α、β和GFP質(zhì)粒，PDS質(zhì)粒以及sgtl質(zhì)粒，其中a、GFP、PDS和sgtl用Mlul，β用SpeI分別進行線性化酶切。體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照AmpliCap-MaxTM Τ7 High Yield Message MakerKit (Epicentre)說明書進行操作:
[0071]RNase-free water X μ L,線性化質(zhì)粒 1.5 μ g, 10 X Transcription Buffer 2 μ L,Cap/NTPPreMix8 μ L, IOOmM DTT2 μ L, AmpIicap-Max? T7Enzyme Solution 2 μ L,反應(yīng)總體積20 μ L，42°C反應(yīng)2.5h，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置_70°C保存?zhèn)溆谩?br> [0072]BSMV = GFP病毒系統(tǒng)α和β以及GFP或BSMV: SGTl病毒系統(tǒng)的α和β以及
[0073]sgtl或者BSMV = PDS病毒系統(tǒng)α和β以及I3DS的三鏈轉(zhuǎn)錄物均用滅菌超純水稀釋3倍后等體積混合，加入等體積的2XGKP Buffer (GKP Buffer含有50mM甘氨酸(glycine) , 30mM K2HP04, pH9.2, 1% (質(zhì)量百分比)膨潤土(bentonite)，1% (質(zhì)量百分比)硅藻土((^1^6))，取8-2(^1分別接種二葉期水原11幼苗第二葉，10分鐘后用滅菌超純水噴施葉面，覆保鮮膜保濕24小時，之后轉(zhuǎn)為正常條件培養(yǎng)。以I XGKP接種(buffer模擬接種)為對照。分別獲得了 MOCK(對照)、轉(zhuǎn)BSMV = GFP株系、轉(zhuǎn)BSMV:H)S、轉(zhuǎn)BSMV:SGT1株系。轉(zhuǎn)BSMV:SGT1株系即為本發(fā)明條銹病抗性降低的小麥株系。
[0074]3、病毒誘導(dǎo)SGTl基因沉默的RT-`PCR驗證步驟2中PCR擴增的保守片段在普通小麥(Triticum aestivum L.)品種水原11中三個SGTl基因(SEQ ID NO: 1-3)及其保守，步驟2中的BSMV-basedVIGS系統(tǒng)可使3個基因同時被沉默。監(jiān)測BSMV_basedVIGS系統(tǒng)是否有效地使SGTl基因沉默。具體方法如下所述:
[0075]按照步驟2中病毒接種后獲得的MOCK(對照)、轉(zhuǎn)BSMV = GFP株系、轉(zhuǎn)BSMV = PDS株系、轉(zhuǎn)BSMV:SGT1株系，取第四葉按照實施例1中的方法，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后半定量RT-PCR檢測小麥SGTl基因的表達。設(shè)置感染BSMV = PDS (利用引物VPDS-Pl:5 ' -AGGGCTAGCCTGATCGAGTCA ACGACGA-3 '和 VPDS-P25 ' -CAGGCTAGCGATGACACCCAAAGACTGAATGTGG-3 '擴增小麥cDNA，將該鑒定正確的載體命名為H)S，PDS與α和β質(zhì)粒共同構(gòu)成了可沉默TaPDS基因的病毒系統(tǒng)BSMV: PDS)，BSMV: GFP病毒的植株和I X GKPBuffer模擬接種的植株為對照。同時檢測大麥花葉病毒外殼蛋白基因CP (CP-F:5' -TGACTGCTAAGGGTGGAGGA-3'和 CP-R:5' -CGGTTGAACATCACGAAGAGT-3')，檢測 TaPDS(TaPDS-F: 5' -CAGTCTTTGGGTGGTGAGGT-3'和 TaPDS-R: 5' -GGGACGGTCTTGTAAACGGA-3')基因的轉(zhuǎn)錄水平，設(shè)置 Tubulin (PTul:5 ' -TGAG GACTGGTGCTTACCGC-3 '和PTu2:5' -GCACCATCAAACCTCAGGGA-3')為內(nèi)參。檢測 TaSGTl 所用的引物為:SGT1-BF1:5'-ACTGCAAAGGCTGCTCTTGAA-3'和 SGTl-BRlj' -GACGAGGCTGA(G)AAATGGTATG-3;。
[0076]結(jié)果表明，對病毒BSMV: SGT1，BSMV:PDS或BSMV = GFP成功侵染的植株，都可以檢測到病毒外殼基因CP的表達，而模擬接種的Mock則沒有CP的表達。模擬接種MOCK，BSMV: PDS(轉(zhuǎn)BSMV = PDS株系)或BSMV = GFP (轉(zhuǎn)BSMV = GFP株系)的植株中TaSGTl三個SGTl基因的表達沒有明顯變化，而接種病毒BSMV:SGT1的植株(轉(zhuǎn)BSMV = SGTI株系)TaSGTl的三個SGTl基因的表達得到了明顯的抑制，達到基因沉默的效果(圖2)。
[0077]4、條銹病菌CYR17接種侵染驗證轉(zhuǎn)BSMV: SGTl株系的條銹病抗性[0078] 條銹菌接種實驗在中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所進行，條銹菌小種CYR17(Zhou HBj Li SFj Deng ZY, Wang XP, Chen Tj Zhang JSj Chen SY, Ling HQj ZhangAM, Wang DW, Zhang XQ.(2007).Molecular analysis of three new receptor-likekinase genes from hexaploid wheat and evidence for their participation inthe wheat hypersensitive response to stripe rust fungus infection.The PlantJournal52, 420 - 434.該菌種可由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所購得)由普通小麥品種水原11對條銹菌小種CYR17表現(xiàn)高抗，因而用它作為條銹菌功能鑒定的品種。當水原11幼苗按照步驟2的方法接種BSMV病毒約20天后卿將步驟2獲得的MOCK (對照)、轉(zhuǎn)BSMV: GFP株系、轉(zhuǎn)BSMV:H)S、轉(zhuǎn)BSMV:SGT1株系培養(yǎng)20天后)開始接種條銹菌小種CYR17。將待接種的小麥苗放到接種桶內(nèi)，用0.1% (體積百分含量)的ToWeen20溶液將小麥苗及接種桶周圍均勻噴濕，然后進行CYR17小種的掃抹接種，之后再用0.1%的Toween20均勻噴濕，用塑料紙將桶口封嚴保濕。接種后，幼苗進行低溫(10°C)黑暗處理24h，以保證條銹菌的成功侵染。第二天再移至人工氣候室生長，白天溫度為15-18°C，晚上11_14°C，濕度為80%左右，光照強度為6000LUX，光照時間為16h/d。實驗同時接種小麥品種銘賢169 (曹張軍，王獻平，王美南，曹雙河，井金學，商鴻生，李振岐，張相岐。小麥背景中來自華山新麥草的抗條銹病基因的遺傳學分析和分子標記。植物遺傳學，2005.32 (7) 738-743。銘賢169是在我國的一個古老品種，公眾可從中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所獲得)作為感病對照。15天后觀察表型，發(fā)現(xiàn)當將小麥品種水原11中的TaSGTl沉默后，接種條銹菌CYR17，小麥葉片上出現(xiàn)許多條銹菌孢子堆，而模擬接種對照和接種GFP的植株上則出現(xiàn)了許多壞死斑，表明產(chǎn)生了超敏反應(yīng)(HR)( 圖3)。結(jié)果說明，TaSGTl參與了小麥對條銹病原菌CYR17的抗性過程。
【權(quán)利要求】
1.一種培育條銹病抗性降低的小麥的方法，是抑制小麥中基因組中序列表中序列I所示基因、序列2所示基因和序列3所示基因中的一種或者兩種以上基因的表達，篩選得到條銹病抗性降低的小麥植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述抑制小麥中基因組中序列表中序列I所示基因、序列2所示基因和序列3所示基因中的一種或者兩種以上基因的表達的方法包括突變或敲除小麥中的所述基因的全部或者部分序列，或者使用干擾RNA干擾所述基因的表達，或者使用BSMV-based VIGS介導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)使所述基因沉默。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述使用BSMV-basedVIGS介導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)使所述基因沉默的方法，是將序列表中序列I所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段插入到BSMV-based VIGS的RNA Y鏈Yb基因后獲得重組病毒，將該重組病毒侵染小麥，篩選得到序列表中序列I所示基因、序列2所示基因和序列3所示基因中的一種或者兩種以上基因沉默的轉(zhuǎn)基因小麥。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其特征在于:所述序列表中序列I所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段為序列為自序列表中序列I的5’端第1-1131位核苷酸序列的DNA片段；所述DNA片段插入到BSMV-based VIGS的、質(zhì)粒的NheI位點。
5.一種用于培育條銹病抗性降低的小麥的重組病毒，是將序列表中序列I所不基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段插入到BSMV-based VIGS的RNA Y鏈Yb基因后獲得的重組病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組病毒，其特征在于:所述序列表中序列I所示基因、序列2所示基因或序列3所示基因中的一段DNA片段的核苷酸序列為自序列表中序列I的5’端第534-968位核苷酸序列；所述DNA片段插入到BSMV-based VIGS的\質(zhì)粒的NheI位點。
7.一種蛋白，是如下I)-6)中任意一項所述的蛋白質(zhì): 1)由序列表中序列4所不的氣基酸`殘基序列組成的蛋白質(zhì)； 2)將序列表中序列4的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列2所示植物銅離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)。 3)由序列表中序列5所不的氣基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)； 4)將序列表中序列5的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列2所示植物銅離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)。 5)由序列表中序列6所不的氣基酸殘基序列組成的蛋白質(zhì)； 6)將序列表中序列6的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有與序列2所示植物銅離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白相同活性的蛋白質(zhì)。
8.權(quán)利要求7所述蛋白的編碼基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的編碼基因，其特征在于: 所述序列表中序列4所述蛋白的編碼基因的序列是下列脫氧核苷酸序列之一: 1)序列表中序列I的DNA序列； 2)序列表中序列I的自5'末端第1-1134位脫氧核糖核苷酸； 3)編碼序列表中序列4所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸； 4)在嚴格條件下與I)或2)或3)的基因雜交且編碼序列表中序列4所示蛋白的基因； 5)與I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼序列表中序列4所述蛋白的基因; 所述序列表中序列5所述蛋白的編碼基因的序列是下列脫氧核苷酸序列之一: 1)序列表中序列2的DNA序列； 2)序列表中序列2的自5'末端第1-1131位脫氧核糖核苷酸； 3)編碼序列表中序列5所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸； 4)在嚴格條件下與I)或2)或3)的基因雜交且編碼序列表中序列4所示蛋白的基因； 5)與I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼序列表中序列4所示蛋白的基因; 所述序列表中序列6所述蛋白的編碼基因的序列是下列脫氧核苷酸序列之一: 1)序列表中序列3的DNA序列； 2)序列表中序列3的自5'末端第1-1131位脫氧核糖核苷酸； 3)編碼序列表中序列6所示蛋白質(zhì)序列的多核苷酸； 4)在嚴格條件下與I)或2)或3)的基因雜交且編碼序列表中序列4所示蛋白的基因； 5)與I)或2)或3)的基因具有90%以上的同源性且編碼序列表中序列4所示蛋白的基因。
10.含有權(quán)利要求8或9所述基因的重組表達載體、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組工程菌或者權(quán)利要求7所述的蛋白或其編碼基因在培育條銹病抗性提高或降低的小麥中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/29GK103667250SQ201210332987
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月10日
【發(fā)明者】張相岐, 王官鋒, 范仁春, 王道文, 凌宏清, 王獻平 申請人:中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所