專利名稱：抗西尼羅河病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白1的抗體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及引入外來遺傳物質(zhì)而修飾的細(xì)胞，具體涉及雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株可分泌抗西尼羅河病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白I的抗體。
背景技術(shù)：
西尼羅河熱和西尼羅河性腦炎是由西尼羅河病毒(West Nile virus, WNV)感染引起的，該病于1937年首次暴發(fā)于烏干達(dá)，隨后迅速傳播到非洲各地、歐亞和中東等地區(qū)，1999年，WNV首次登陸西半球，并迅速肆虐美國，是繼炭疽事件之后，又一種導(dǎo)致全美恐慌的致病性微生物。目前，該病毒在全球范圍內(nèi)仍呈現(xiàn)繼續(xù)擴(kuò)散的趨勢，加拿大和歐洲一些國家相繼出現(xiàn)了人感染而死于西尼羅河腦炎的報道。雖然，迄今為止，中國尚未有發(fā)現(xiàn)WNV感染的臨床病例，但中國南部的氣候、地里環(huán)境復(fù)雜，含有多種傳播WNV的蚊蟲種類，具備有 WNV傳播的條件，再者，隨著國際交流的日益頻繁，WNV傳人中國境內(nèi)的可能性越來越大。西尼羅河病毒屬于黃病毒屬，日本腦炎病毒(Japanese encephalitisvirus, JEV)群的成員之一，與日本腦炎病毒具有相近的免疫原性，其主要的傳播媒介是蚊子。研究認(rèn)為，WNV是目前發(fā)現(xiàn)宿主最多的蟲媒病毒，至少能寄居于36種蚊子，而我國能傳播WNV的蚊種就有11種。對我國而言，西尼羅病毒是一種全新的致病病毒，全民普遍易感，人群中又沒有免疫屏障，其危險性之大。因此，提前做好防范及相應(yīng)的技術(shù)儲備為我國應(yīng)對WNV的傳人至關(guān)重要。至今，具有保護(hù)性的疫苗尚未研制成功，臨床上對于西尼羅河性腦炎尚未有特異性的治療藥物。但實(shí)踐表明早期采取對癥治療可以大大減少西尼羅河腦炎的發(fā)病率和死亡率，因此西尼羅河熱的治療很大程度上取決于早期感染的診斷。由于多數(shù)西尼羅河病毒感染者早期缺乏特異的臨床表現(xiàn)，僅有發(fā)熱、頭痛、全身肌肉酸痛等呼吸道癥狀，難以和其它發(fā)熱性疾病和腦炎相鑒別。因此，靈敏、特異的早期診斷技術(shù)，對早期發(fā)現(xiàn)傳染源，及時阻斷西尼羅河病毒的傳播途徑至關(guān)重要。目前，西尼羅河病毒的實(shí)驗室診斷方法主要包括病毒分離、血清學(xué)檢測和核酸檢測。其中病毒分離是西尼羅河病毒感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法費(fèi)時而且對于實(shí)驗室的條件要求很高，必須具備III級生物安全實(shí)驗室才能進(jìn)行WNV的培養(yǎng)。雖然病毒核酸的檢測方法比傳統(tǒng)的病毒分離法更靈敏、快速，但分子診斷操作相對繁瑣，對技術(shù)水平要求較高，較易發(fā)生污染導(dǎo)致假陽性結(jié)果，同時由于毒株變異、潛在突變等序列改變也可能引起假陰性結(jié)果，再者，西尼羅河病毒感染患者出現(xiàn)病毒血癥的時間特別短，血清中病毒核酸存在時間短暫，不利于病毒感染的早期診斷?？贵w檢測試劑目前已成為美國等國家主要診斷方法，但由于西尼羅河病毒與其它黃病毒特別是與日本腦炎病毒存在血清學(xué)交叉反應(yīng)，特別是接種乙型腦炎病毒、黃熱病毒疫苗的人群易發(fā)生抗體假陽性的反應(yīng)結(jié)果，不能特異的診斷WNV的感染。因此，選擇一個適合的靶抗原建立抗原診斷試劑盒，不僅能夠達(dá)到早期特異診斷疾病的目的，同時也能避免核酸檢測中檢測時限短的問題。西尼羅河病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白I (nonstructural protein I, NSl)是一種相對保守的糖蛋白，分子量為48kDa,其抗原性很強(qiáng)，且研究發(fā)現(xiàn)在西尼羅河熱患者的早期血中存在高濃度的NSl循環(huán)抗原，因此，檢測急性期病人血清中的循環(huán)NSl抗原可用于早期診斷西尼羅河病毒感染。目前已報道的幾種檢測西尼羅河病毒NSl的抗原捕獲ELISA法，如VecTest的抗原檢測方法，能在15min內(nèi)快速檢測出WNV的感染，但該方法的敏感性不好；MacDonald等利用黃病毒的交叉抗體4G4作為包被和檢測抗體建立雙抗體夾心，該方法能靈敏的檢測到病毒培養(yǎng)上清中NSl蛋白，其最大檢測限為lng/ml,但該方法特異性不好,不能區(qū)分不同黃病毒的感染；Kyung Min Chung.等，用西尼羅河病毒NSl特異性單克隆抗體建立的雙抗體夾心抗原檢測方法，其敏感度、特異性和穩(wěn)定性都有很多的提高。而我國目前尚未有任何WNV的抗原檢測試劑的報道，因此，建立一種快速、可靠、標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗室診斷西尼羅河病毒的早期抗原檢測試劑已成我國預(yù)防和控制該疾病的重要手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供抗WNV-NSU S卩，西尼羅河病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白 I)的抗體，該抗體可作為西尼羅河病毒NSl抗原的免疫診斷試劑，且靈敏度高和特異性好。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案如下所述本發(fā)明所述的抗WNV-NSl的抗體分別是單克隆抗體1C16A24和單克隆抗體1E85A4，其中，單克隆抗體1C16A24是由保藏號為CCTCC-C201276的雜交瘤細(xì)胞株分泌的；單克隆抗體1E85A4是由保藏號為CCTCC-C201275的雜交瘤細(xì)胞株分泌的。分泌上述單克隆抗體1C16A24和單克隆抗體1E85A4的雜交瘤細(xì)胞株已于2012年06月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其中，分泌單克隆抗體1C16A24的雜交瘤細(xì)胞株的保藏號為CCTCC-C201276 ;分泌單克隆抗體1E85A4的雜交瘤細(xì)胞株的保藏號為CCTCC-C201275。上述單克隆抗體1C16A24和單克隆抗體1E85A4可作為西尼羅河病毒NSl抗原的免疫診斷試劑，所述試劑可組成采用雙抗體夾心ELISA方法的檢測WNV-NSl抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括捕獲抗體和檢測抗體，其中，所述的捕獲抗體為上述單克隆抗體1C16A24，所述的檢測抗體為上述單克隆抗體1E85A4。上述免疫診斷試劑盒為常規(guī)的采用雙抗體夾心ELISA方法的免疫診斷試劑盒，該試劑盒由用于包被上述捕獲抗體的微孔反應(yīng)板、樣品處理液、標(biāo)記有標(biāo)記物的上述檢測抗體、陽性對照、陰性對照、濃縮洗液、顯色液和終止液組成。上述試劑盒中，所述的標(biāo)記物可以是生物素、辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、膠體金、熒光素等，優(yōu)選生物素。當(dāng)所述的檢測抗體上結(jié)合的標(biāo)記物為生物素時，所述試劑盒還含有標(biāo)記有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的親和素。所述的親和素能與生物素以I : 4的比例結(jié)合，起到放大檢測信號的作用，進(jìn)一步提聞檢測的靈敏度。本發(fā)明所述的單克隆抗體1C16A24和單克隆抗體1E85A4分別是由兩株能分泌抗西尼羅河病毒NSl蛋白的雜交瘤細(xì)胞株分泌的，因此能特異性結(jié)合西尼羅河病毒的NSl蛋白的不同位點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速地檢測出西尼羅河病毒，而與其它黃病毒屬成員，如登革病毒、乙型腦炎病毒、森林腦炎病毒和黃熱病毒無交叉反應(yīng)。更進(jìn)一步地，由本發(fā)明所述的單克隆抗體1C16A24和單克隆抗體1E85A4所組成的免疫診斷試劑盒檢測西尼羅河病毒NSl蛋白的靈敏度可達(dá)30pg/ml，檢測西尼羅河病毒培養(yǎng)上清的最低滴度為61PFU/ml，而且快速、準(zhǔn)確。


圖I是單抗1C16A24和單抗1E85A4免疫印跡圖，是重組WNV NSl蛋白與單克隆抗體的反應(yīng)，條帶I為無關(guān)單抗，條帶2為單抗1C16A24，條帶3為單抗1E85A4，條帶4為抗GST單抗。
圖2是所述檢測試劑盒檢測西尼羅河病毒NSl蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其中為檢測西尼羅河病毒NSl蛋白的曲線，■^為BSA對照。圖3是所述檢測試劑盒的特異性分析結(jié)果圖。圖4是所述檢測試劑盒檢測模擬WNV感染病人血清標(biāo)本的結(jié)果圖。圖5是所述檢測試劑盒檢測病毒感染的動物血清標(biāo)本的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式例IA、抗WNV-NSl蛋白的單克隆抗體1C16A24和1E85A4的制備a.免疫抗原的制備本發(fā)明用于制備單克隆抗體的免疫原為基因重組WNV NSl蛋白?；蛑亟MWNV NSl蛋白是用攜帶WNV NSl蛋白基因的一種大腸桿菌的工程菌株制備的，其制備按常規(guī)方法進(jìn)行，詳細(xì)的制備方法可參照使用手冊。將NSl蛋白純化后，以考馬斯亮藍(lán)(Coomassie)蛋白分析試劑(PIERCE，Cat, No. ED62976)定量，免疫原鑒定結(jié)果見圖2。b.免疫小鼠取4-6周齡雌性BALB/c小鼠，第一次采用弗氏完全佐劑與等體積WNV NSl抗原混勻乳化，每只小鼠皮下多點(diǎn)注射30yg，以后每10天以弗氏不完全佐劑與等體積WNV NSl抗原混勻乳化后免疫，共4次后,于融合前3天每只小鼠腹腔注射WNV NSl抗原100 μ g進(jìn)行加強(qiáng)免疫。c.免疫血清抗體效價測定建立間接ELISA法測定免疫血清抗體效價。配制I μ g/ml重組NSl蛋白的50mMpH9. 6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ I/孔，4°C過夜。次日，用含O. 25%酪蛋白(Sigma)的封閉液300μ I/孔4°C過夜，棄液并拍干后真空干燥2 12小時，用鋁膜袋真空包裝4°C保存，用于鼠免疫血清抗體效價測定。于第四次免疫后10天眼眶采血，鼠免疫血清用含O. I % BSA IOmM PBS以IO3 IO6倍稀釋，加入96孔板，100 μ I/孔37°C 30分鐘，IOmM PBS含O. l%Tween-20洗滌液洗板五次后，加入I :1000倍稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG(Sigma, INC.)，100 μ I/孔37°C 30分鐘，同上洗板后，加入TMB顯色液，100 μ I/孔，室溫避光顯色10分鐘，加100 μ I/孔IM H2SO4終止反應(yīng)，測450nm吸光值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值之比> 2. I為陽性來判斷免疫血清的抗體效價。d.雜交瘤制備和篩選選擇血清抗體效價達(dá)I X IO6的小鼠，于融合前3天腹腔注射WNV NSl抗原100 μ g。無菌取小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液與對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株NS-I按10 :1的比例混合，45%聚乙二醇(PEG，MW4000, Sigma)作用下進(jìn)行融合。按下述步驟將聚乙二醇溶液加入細(xì)胞。在37°C水浴中，在Imin內(nèi)緩慢加入I. Oml PEG，邊加邊輕輕搖勻，分別于lmin、2min、3min、4min、5min 內(nèi)加 lml、2ml、3ml、4ml、5ml 無血清 RPMI-1640 培養(yǎng)基終止融合，最后加入IOml含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，室溫800rpm離心5min，棄上清，用60ml含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基輕輕懸起細(xì)胞。將此細(xì)胞懸液加入6塊96孔培養(yǎng)板上，在二氧化碳培養(yǎng)箱中溫度為37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中。次日于每孔加入100 μ I含次黃嘌呤、氨基喋呤、胸腺嘧啶脫氧核苷(HAT，Sigma)篩選培養(yǎng)基。以后每3天用此篩選培養(yǎng)基給培養(yǎng)物換液一次，直到細(xì)胞克隆形成。為檢測產(chǎn)生抗體克隆的存在，用上述間接ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清。選擇強(qiáng)陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行了克隆化，用有限稀釋法連續(xù)克隆化2 3次，共獲得兩株穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別是保藏號為CCTCC-C201276 (命名為WNV-M6)的雜交瘤細(xì)胞株和保藏號為CCTCC-C201275 (命名為WNV-M4)的雜交瘤細(xì)胞株。所述的保藏號為CCTCC-C201276的雜交瘤細(xì)胞株和保藏號為CCTCC-C201275的雜交瘤細(xì)胞株已于2012年6月23日送交地址在中國.武漢.武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏。將克隆化后陽性率達(dá)100%的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后液氮凍存。
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e.抗WNV NSl蛋白單克隆抗體腹水的制備和抗體純化采用體內(nèi)誘生法制備本發(fā)明中單克隆抗體1C16A24和單克隆抗體1E85A4，即在小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞WNV-M6制備腹水獲得單克隆抗體1C16A24，或者在小鼠體內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞WNV-M4制備腹水獲得單克隆抗體1E85A4。具體制備方法簡述如下每只小鼠腹腔內(nèi)注射O. 5ml弗氏不完全佐劑(Sigma公司)，使瘤細(xì)胞能以腹水瘤形式在腹腔內(nèi)生長。大約I 2周后，將2X IO6個雜交瘤細(xì)胞懸浮于無血清RPMI 1640培養(yǎng)基中，注入小鼠腹腔。注射雜交瘤細(xì)胞大約I 2周后，用9號針頭放腹水，可反復(fù)收集數(shù)次。腹水經(jīng)離心澄清后4°C存放備用。腹水抗體的純化采用辛酸一硫酸銨沉淀法，腹水用60mM、pH5. O醋酸緩沖液稀釋2倍，用O. IN鹽酸調(diào)pH值至4. 8，液體由清亮變混濁，室溫下于30分鐘內(nèi)邊攪拌邊逐滴緩慢加入辛酸，為每毫升稀釋前腹水加33 μ I辛酸，出現(xiàn)大量沉淀，4°C靜置2小時，IOOOOg, 4°C離心30分鐘，取上清，加入1/10體積的pH7. 4100mM磷酸鹽緩沖液，并用O. IN氫氧化鈉調(diào)pH值至7. 4，冰浴攪拌下緩慢加入硫酸銨，為每毫升液體加入O. 277硫酸銨即為45%飽和度，4°C靜置過夜，10000g，4°C離心30分鐘，棄上清，沉淀溶于適量IOmM磷酸鹽緩沖液，用同樣的液體，4°C透析過夜，換液三次。以考馬斯亮藍(lán)(Coomassie)蛋白分析試劑(PIERCE，Cat，No. ED62976)定量。測定濃度后的抗體加入終濃度50%的甘油于_80°C保存。f.抗WNV NSl蛋白單克隆抗體亞類鑒定用上述的間接ELISA法檢測在本實(shí)施例中獲得的陽性克隆以確定其產(chǎn)生的抗體亞類。即WNV NSl抗原包被微孔板，封閉后與雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清孵育，再分別與為I :1000倍稀釋HRP標(biāo)記的兔抗小鼠不同亞類特異性免疫球蛋白，這些抗體包括兔抗小鼠IgGl (美國 ZYMEDLABORATORIES, INC,目錄號 61-0120)，兔抗小鼠 IgG2a(同上，目錄號 61-0220)，兔抗小鼠IgG2b(同上，目錄號61-0320)，兔抗小鼠IgG3(同上，目錄號61-0420)，兔抗小鼠IgM(同上，目錄號61-6820)。檢測結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞株WNV-M6分泌的單克隆抗體1C16A24和雜交瘤細(xì)胞株WNV-M4分泌的單克隆抗體1E85A4均為IgGl陽性。
g.鑒定WNV NSl蛋白單克隆抗體的特異性(I)間接ELISA法進(jìn)行單克隆抗體特異性分析分別用四個血清型重組WNV-NSl抗原、DV-NSl抗原、天然的DV抗原、JEV抗原和YFV抗原包被微孔板，按照常規(guī)的間接ELISA法進(jìn)行檢測。即在包被的微孔板中加入I μ g/ml的本專利發(fā)明的單克隆抗體1C16A24和1E85A4，37°C孵育lh，加入I :1000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG (Sigma，Inc)，100 μ I/孔37°C孵育30min，加TMB 顯色液室溫避光顯色I(xiàn)OminJP IM H2SO4終止反應(yīng)，測450nm吸光值(A45tl)。表I結(jié)果顯示本專利發(fā)明的單克隆抗體與重組的WNV NSl抗原產(chǎn)生很強(qiáng)的特異性反應(yīng)，與其他黃病毒屬成員，如乙型腦炎病毒、黃病毒和四個血清型登革病毒均無交叉反應(yīng)。表IWNV NSl單克隆抗體與重組的WNV NSl抗原間接ELISA反應(yīng)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種抗WNV-NSl的單克隆抗體1C16A24，該單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C201276的雜交瘤細(xì)胞株分泌的。
2.—種分泌權(quán)利要求I所述的單克隆抗體1C16A24的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株的保藏號為CCTCC-C201276。
3.一種抗WNV-NSl的單克隆抗體1E85A4，該單克隆抗體是由保藏號為CCTCC-C201275的雜交瘤細(xì)胞株分泌的。
4.一種分泌權(quán)利要求3所述的單克隆抗體1E85A4的雜交瘤細(xì)胞株，該雜交瘤細(xì)胞株的保藏號為 CCTCC-C201275。
5.一種采用雙抗體夾心ELISA方法檢測西尼羅河病毒NSl抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒包括捕獲抗體和檢測抗體，其特征在于，所述的捕獲抗體為權(quán)利要求I所述的單克隆抗體1C16A24，所述的檢測抗體為權(quán)利要求3所述的單克隆抗體1E85A4。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗西尼羅河病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白1的抗體，所述的抗體分別是單克隆抗體1C16A24和單克隆抗體1E85A4，其中，所述的單克隆抗體1C16A24由保藏號為CCTCC-C201276的雜交瘤細(xì)胞株分泌，所述的單克隆抗體1E85A4由保藏號為CCTCC-C201275的雜交瘤細(xì)胞株分泌。本發(fā)明所述的單克隆抗體1C16A24和單克隆抗體1E85A4可組成采用雙抗體夾心ELISA方法檢測西尼羅河病毒NS1抗原的免疫診斷試劑盒，該試劑盒具有靈敏度高和特異性好的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號C12N5/20GK102898517SQ20121029256
公開日2013年1月30日 申請日期2012年8月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月16日
發(fā)明者車小燕, 丁細(xì)霞, 秦成峰 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所