專利名稱：一種2-酮基-l-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌及其在維生素c發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型菌種一氧化葡糖酸桿菌TL-1045及其在維生素C發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，具體為其在發(fā)酵制備維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸及維生素C中的應(yīng)用，屬于微生物發(fā)酵生產(chǎn)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
維生素C又稱L-抗壞血酸，它能參與體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)及羥化反應(yīng)，是一類重要的細(xì)胞代謝氧化還原化合物，在人體內(nèi)起到必不可少的重要生理作用，如治療人類壞血病，增強(qiáng)人體抵抗力。綠色植物能夠自己合成維生素C，然而人和許多動(dòng)物由于身體肝臟中缺少古洛內(nèi)酯氧化酶，因此不能自己合成，必須從外界攝取。目前維生素C已廣泛應(yīng)用于 醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品等領(lǐng)域。并且隨著其用途的開(kāi)發(fā)和人們物質(zhì)文化生活水平的提高,對(duì)維生素C的需求量也不斷增加。1933年，德國(guó)化學(xué)家Reichstein等發(fā)明了以化學(xué)合成法為主的萊氏法，是最早工業(yè)化生產(chǎn)維生素C的方法，但此法合成路線過(guò)長(zhǎng)，有毒有害的中間產(chǎn)物以及有機(jī)原料消耗量多，需要生產(chǎn)商在環(huán)境污染防治方面進(jìn)行較大的投入，導(dǎo)致維生素C生產(chǎn)成本較高。七十年代初，我國(guó)首創(chuàng)了維生素C 二步發(fā)酵法并將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。該法在萊氏法一步發(fā)酵的基礎(chǔ)上，采用混菌發(fā)酵，使山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸，工藝簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)污染，是目前維生素C工業(yè)生產(chǎn)的主要方法。維生素C 二步發(fā)酵法，第一步是在醋酸桿菌作用下將D-山梨醇氧化為L(zhǎng)-山梨糖，此步發(fā)酵工藝成熟，發(fā)酵周期約為20-30 h，且轉(zhuǎn)化率很高，現(xiàn)已能達(dá)98%以上；第二步是將L-山梨糖進(jìn)一步氧化生成2-酮基-L-古龍酸，此步發(fā)酵由兩種微生物混菌發(fā)酵進(jìn)行，一種為氧化葡糖酸桿菌，俗稱小菌，另一種常采用巨大芽孢桿菌，俗稱大菌。小菌能夠轉(zhuǎn)化山梨糖生成2-酮基-L-古龍酸，但其單獨(dú)培養(yǎng)生長(zhǎng)較弱；大菌不能產(chǎn)酸，但和小菌混合培養(yǎng)，能夠顯著促進(jìn)小菌產(chǎn)酸。目前維生素C生產(chǎn)第二步發(fā)酵，發(fā)酵周期約為40-50 h，產(chǎn)物濃度約為80-95 g/L，轉(zhuǎn)化率約為80-95%。第二步發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)物濃度和轉(zhuǎn)化率相對(duì)較低，因此是限制維生素C發(fā)酵生產(chǎn)效率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了進(jìn)一步提高維生素C發(fā)酵的生產(chǎn)效率，近年來(lái)許多研究機(jī)構(gòu)對(duì)維生素C第二步發(fā)酵進(jìn)行了研究。專利200910148114. X公開(kāi)了一種維生素C第二步發(fā)酵菌種制備方法，菌種茄瓶制備過(guò)程中，先將小菌接種茄瓶，培養(yǎng)16-48 h，然后再接種大菌，繼續(xù)培養(yǎng)24-72h，這種條件下，可以提高小菌在混菌中的比例，提高菌種活力，發(fā)酵45 h，2-酮基-L-古龍酸可達(dá)到100 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到90%左右，該方法效率有所提高，但是發(fā)酵時(shí)間較長(zhǎng)。專利200910069697. 7公開(kāi)了一種在發(fā)酵過(guò)程中添加巰基化合物來(lái)取代大菌促進(jìn)小菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸，但其實(shí)際生產(chǎn)效率仍低于大、小菌混菌發(fā)酵的效率。專利200910034773. 0公開(kāi)了一種強(qiáng)化2-酮基-L-古龍酸生產(chǎn)強(qiáng)度的方法，通過(guò)添加海藻糖，提高菌體對(duì)古龍酸的耐受性，發(fā)酵52 h，2-酮基-L-古龍酸可達(dá)到69. 38 g/L，該方法需要添加海藻糖，海藻糖價(jià)格較高，導(dǎo)致生產(chǎn)成本上升，不具有實(shí)用性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中氧化葡糖酸桿菌對(duì)2-酮基-L-古龍酸耐受性較差，導(dǎo)致維生素C生產(chǎn)中第二步發(fā)酵效率低下的問(wèn)題，提供了一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌TL-1045，該菌種2-酮基-L-古龍酸耐受性強(qiáng)，在二步發(fā)酵中轉(zhuǎn)化L-山梨糖的效率高，所得2-酮基-L-古龍酸產(chǎn)率顯著提高。本發(fā)明還提供了該菌種在維生素C發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用，具體為其在維生素C及其中間體2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵制備中的應(yīng)用。發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)對(duì)2-酮基-L-古龍酸耐受性越強(qiáng)的氧化葡糖酸桿 菌菌株，其和巨大芽孢桿菌混菌發(fā)酵轉(zhuǎn)化山梨糖生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的效率越高，推測(cè)可能是2-酮基-L-古龍酸耐受性強(qiáng)的菌株解除了產(chǎn)物反饋抑制效應(yīng)，使得在第二步發(fā)酵過(guò)程中后期，高2-酮基-L-古龍酸濃度下，菌體生長(zhǎng)和合成產(chǎn)物效率提高。針對(duì)這一發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人通過(guò)對(duì)現(xiàn)有生產(chǎn)菌株氧化葡糖酸桿菌TL-347進(jìn)行反復(fù)多次紫外誘變篩選，選育得到了本發(fā)明2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)TL-1045(即該菌種能耐高濃度2-酮基-L-古龍酸)。本發(fā)明氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans) TL-1045,已由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏,保藏編號(hào)為CGMCC NO. 6188，保藏日期為2012年6月6日。以篩選得到的氧化葡糖酸桿菌TL-347為出發(fā)菌株，TL-347對(duì)2_酮基-L-古龍酸的耐受濃度為85 g/L，發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的產(chǎn)量約為95 g/L。氧化葡糖酸桿菌TL-1045的誘變篩選過(guò)程為挑取出發(fā)菌株氧化葡糖酸桿菌TL-347的單菌落，接入裝有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，加30 ml無(wú)菌生理鹽水，150 rpm震蕩20 min，將菌落打散，制成菌懸液。取菌懸液5 ml加入培養(yǎng)皿中，于40瓦紫外燈下,20-40 cm處照射I min、5 min、10 min,然后將三個(gè)處理的菌懸液分別稀釋至10_3-10_5，涂布含有篩選培養(yǎng)基(2-酮基-L-古龍酸90-130 g/L，山梨糖15 g/L，胰蛋白胨3 g/L，尿素0.1 g/L，玉米漿4 8/1，牛肉膏1.2 g/L,酵母膏I. 2 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，硫酸鎂0.2 g/L，瓊脂粉17 g/L,pH 6. 7)的平板中，避光培養(yǎng)72 h，挑取平板上的菌落，分別和巨大芽孢桿菌搭配，然后混菌接發(fā)酵搖瓶，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸效率，將初步篩選的菌株反復(fù)多次誘變得到本發(fā)明中的2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌TL-1045，其在110 g/L或更高濃度的2-酮基-L-古龍酸中能夠正常生長(zhǎng)繁殖，其與巨大芽孢桿菌混菌發(fā)酵所得發(fā)酵液中2-酮基-L-古龍酸產(chǎn)量在125g/L以上，L-山梨糖對(duì)2-酮基-L-古龍酸的轉(zhuǎn)化率在90%以上。對(duì)氧化葡糖酸桿菌TL-1045的分類學(xué)特征進(jìn)行研究，如下
一、氧化葡糖酸桿菌TL-1045的菌體和菌落形態(tài)見(jiàn)表I。
上述氧化葡糖酸桿菌TL-1045可用于維生素C發(fā)酵生產(chǎn)中，具體的為用其發(fā)酵生產(chǎn)維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸，步驟包括以巨大芽孢桿菌(簡(jiǎn)稱大菌，下同)為伴生菌，與氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans) TL-1045 (簡(jiǎn)稱小菌,下同)組成混合菌種進(jìn)行混菌有氧發(fā)酵，以L-山梨糖為原料進(jìn)行混菌有氧發(fā)酵，將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸?；炀l(fā)酵的培養(yǎng)基中除了 L-山梨糖外，還含有碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分。進(jìn)一步的，維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸的制備方法包括以下步驟
(1)菌種的活化將用茄瓶保存的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖酸桿菌用活化培養(yǎng)基洗下，然后在活化培養(yǎng)基中于27-32°C下培養(yǎng)18-24 h，得活化的菌種液；
(2)菌種的分離純化在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌生理鹽水將步驟(I)得到的活化菌種液進(jìn)行梯度稀釋，取10_5-10_7稀釋液0. I ml涂布在平板上，平板在27-32°C下培養(yǎng)4_6天；
(3)混菌的培養(yǎng)用接種環(huán)將步驟(2)中10-25個(gè)平板上培養(yǎng)得到的全部氧化葡糖酸桿菌菌落挑取到0. 2ml無(wú)菌生理鹽水中，制成氧化葡糖酸桿菌菌懸液；然后從步驟(2)中平板上選擇色白、飽滿且邊緣整齊的巨大芽孢桿菌菌落，用接種環(huán)在巨大芽孢桿菌菌落內(nèi)環(huán)和外環(huán)之間挑取針尖大小的巨大芽孢桿菌接到氧化葡糖酸桿菌菌懸液中，攪拌混勻制得混菌懸液；取混菌懸液0. 05-0. I ml接種到茄瓶培養(yǎng)基中，涂布均勻，27-32 °C培養(yǎng)3_5天；
(4)種子液的制備將步驟(3)中茄瓶培養(yǎng)得到的混菌用種子培養(yǎng)基洗下，接種到盛有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在27-32°C、80-250 rpm的條件下培養(yǎng)18-24 h，得種子液，每個(gè)茄瓶接種兩個(gè)搖瓶；
(5)種子液的擴(kuò)大培養(yǎng)將步驟(4)得到的種子液按5-20%的接種量接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在 80-250 rpm、通氣比 0. 3-0. 8 L/L*min、27_32°C條件下培養(yǎng) 20-30 h ；
(6)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(5)擴(kuò)大培養(yǎng)所得的種子液按5-20%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在80-250 rpm、通氣比0. 3-0. 8 L/L*min、27_32°C條件下培養(yǎng)25-40 h，發(fā)酵過(guò)程中流加堿性物質(zhì)溶液控制PH始終為6. 7-7. 3，L-山梨糖下降到5-15 g/L時(shí)，流加L-山梨糖保持L-山梨糖濃度為10-25 g/L。上述方法中，步驟(I)中活化培養(yǎng)基的組成為山梨糖5-15 g/L，葡萄糖2-5 g/L,酵母膏 3-8 g/L，玉米漿 3-10 g/L，尿素 0.05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步驟(2)中平板培養(yǎng)基組成為山梨糖5-20 g/L，胰蛋白胨1-5 g/L,尿素0.05-0. 2 g/L，玉米漿2-6 g/L，牛肉膏0.5-2 g/L，酵母膏0. 5-2. 0 g/L，磷酸二氫鉀
0.5-1. 5 g/L，硫酸鎂 0. 1-0. 3 g/L，瓊脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步驟(3)中茄瓶培養(yǎng)基組成為山梨糖3-8 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸鎂 1-3 g/L，瓊脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步驟(4)中種子培養(yǎng)基的組成為山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L,玉米漿 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步驟(5)中擴(kuò)大培養(yǎng)基組成為山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米漿 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2。上述方法中，步驟(6)中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為山梨糖20-30 g/L，玉米漿5-12 g/L,尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 3。上述方法中，步驟(6)中發(fā)酵時(shí)間優(yōu)選為32-35 h，此外，步驟(6)中流加的堿性物質(zhì)溶液可以是碳酸鈉溶液、碳酸鉀溶液、氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液等。上述2-酮基-L-古龍酸的發(fā)酵方法中，所用的伴生菌巨大芽孢桿菌無(wú)產(chǎn)酸作用，但能顯著促進(jìn)氧化葡糖酸桿菌TL-1045的產(chǎn)酸能力，本發(fā)明所用的巨大芽孢桿菌為現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)的普通巨大芽孢桿菌，可以在市場(chǎng)上買到。、
上述氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans) TL-1045還可以用于維生素C 二步發(fā)酵中，將L-山梨糖高效率轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸。本發(fā)明的上述技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)
I、本發(fā)明中氧化葡糖酸桿菌TL-1045經(jīng)過(guò)物理誘變所得，在含有110 g/L 2-酮基-L-古龍酸的培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)繁殖，解除了維生素C生產(chǎn)第二步發(fā)酵中產(chǎn)物對(duì)菌體的反饋抑制，發(fā)酵生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸的產(chǎn)量可達(dá)到125 g/L以上，較初始菌株的產(chǎn)量有顯著性提高，且傳代穩(wěn)定，高于目前文獻(xiàn)報(bào)道的2-酮基-L-古龍酸發(fā)酵生產(chǎn)效率。2、將本發(fā)明氧化葡糖酸桿菌TL-1045用于維生素C發(fā)酵生產(chǎn)中簡(jiǎn)單易行，能夠顯著提高維生素C第二步發(fā)酵的生產(chǎn)效率，提高2-酮基-L-古龍酸的產(chǎn)量，降低維生素C生產(chǎn)成本。保藏信息
本發(fā)明氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans) TL-1045 (即2_酮基_L_古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌)已由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 6188，保藏日期為2012年6月6日。


為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，其中
圖I為本發(fā)明所述的氧化葡糖酸桿菌TL-1045和巨大芽孢桿菌混菌發(fā)酵過(guò)程中的鏡檢圖片，圖中大型桿菌為巨大芽孢桿菌，小型球菌為氧化葡糖酸桿菌TL-1045。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體工藝條件、物料配比及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所描述的本發(fā)明。以下實(shí)施例中所用2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌TL-1045簡(jiǎn)稱為小菌，已由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為=CGMCCN0.6188，保藏日期為2012年6月6日；所用巨大芽孢桿菌為巨大芽孢桿菌ATCC 14581，簡(jiǎn)稱為大菌，購(gòu)于上海復(fù)祥生物科技有限公司。以下實(shí)施例中所用氧化葡糖酸桿菌TL-1045是以現(xiàn)有生產(chǎn)菌株氧化葡糖酸桿菌TL-347 (保藏于本單位研發(fā)中心)為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外誘變處理獲得，其在110 g/L或更高濃度的2-酮基-L-古龍酸中能夠正常生長(zhǎng)繁殖。下述實(shí)施例中所用到的TL-1045菌種和巨大芽孢桿菌接種在同一茄瓶中在冰箱中進(jìn)行保存，溫度在4°C左右，在使用時(shí)將茄瓶上保存的大、小菌洗下進(jìn)行活化等處理進(jìn)行進(jìn)一步的應(yīng)用。保存所用的培養(yǎng)基為山梨糖3-8 g/L，酵母膏2-6 g/L，硫酸鎂1-3 g/L,瓊脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 2。實(shí)施例I
氧化葡糖酸桿菌TL-1045的誘變篩選
挑取出發(fā)菌株氧化葡糖酸桿菌TL-347的單菌落，接入裝有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶中，力口30 ml無(wú)菌生理鹽水，150 rpm震蕩20 min，將菌落打散，制成菌懸液。取5 ml菌懸液加入培養(yǎng)皿中，于40瓦紫外燈下，20-40 cm處照射I min、5 minUO min，然后將三個(gè)處理的菌懸液分別稀釋至10_3_10_5，涂布含有篩選培養(yǎng)基(2-酮基-L-古龍酸110 g/L，山梨糖15 g/L，胰蛋白胨3 g/L，尿素0. I g/L，玉米漿4 8/1，牛肉膏1.2 8/1，酵母膏1.2 g/L，磷酸二氫鉀I g/L，硫酸鎂0. 2 g/L，瓊脂粉17 g/L, pH 6. 7)的平板中，避光培養(yǎng)72 h，挑取平板上的菌落，分別和巨大芽孢桿菌搭配，然后混菌接發(fā)酵搖瓶，檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸效率，將初步篩選的菌株反復(fù)誘變多次，獲得多株古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌菌株(見(jiàn)表3)，其中氧化葡糖酸桿菌TL-1045對(duì)2-酮基-L-古龍酸高耐受性最好，發(fā)酵產(chǎn)酸最高。
表3不同葡■糖酸桿菌菌株對(duì)2" 基-L-古龍Klt受性及產(chǎn)簾水平
權(quán)利要求
1.一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型菌種，其特征是所述菌種為氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)TL_1045,該菌種已于2012年6月6日保藏至中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO. 6188。
2.—種維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸的發(fā)酵方法，其特征是，步驟包括以巨大芽孢桿菌為伴生菌，與權(quán)利要求I所述的氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacter oxydans)TL_1045組成混合菌種，以L-山梨糖為原料進(jìn)行混菌有氧發(fā)酵，將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的發(fā)酵方法，其特征是，具體包括以下步驟 (1)菌種的活化將用茄瓶保存的巨大芽孢桿菌和氧化葡糖酸桿菌用活化培養(yǎng)基洗下，然后在活化培養(yǎng)基中于27-32°C下培養(yǎng)18-24 h，得活化的菌種液； (2)菌種的分離純化用無(wú)菌生理鹽水將步驟(I)得到的活化菌種液進(jìn)行梯度稀釋，取10_5-10_7稀釋液0. I ml涂布在平板上，然后將平板在27-32 °C下培養(yǎng)4_6天； (3)混菌的培養(yǎng)用接種環(huán)將步驟(2)中10-25個(gè)平板上培養(yǎng)得到的全部氧化葡糖酸桿菌菌落挑取到0. 2 ml無(wú)菌生理鹽水中，制成氧化葡糖酸桿菌菌懸液；然后從步驟(2)中平板上選擇巨大芽孢桿菌菌落，用接種環(huán)在巨大芽孢桿菌菌落內(nèi)環(huán)和外環(huán)之間挑取針尖大小的巨大芽孢桿菌接到氧化葡糖酸桿菌菌懸液中，攪拌混勻制得混菌懸液；取混菌懸液0.05-0. I ml接種到茄瓶培養(yǎng)基中，涂布均勻，27-32 °C培養(yǎng)3_5天； (4)種子液的制備將步驟(3)中茄瓶培養(yǎng)得到的混菌用種子培養(yǎng)基洗下，接種到盛有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，在27-32°C、80-250 rpm的條件下培養(yǎng)18-24 h，得種子液，每個(gè)茄瓶接種兩個(gè)搖瓶； (5)種子液的擴(kuò)大培養(yǎng)將步驟(4)得到的種子液按5-20%的接種量接種到擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在 80-250 rpm、通氣比 0. 3-0. 8 L/L min、27_32°C條件下培養(yǎng) 20-30 h ； (6)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(5)擴(kuò)大培養(yǎng)所得的種子液按5-20%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在80-250 rpm、通氣比為0. 3-0. 8 L/L.min、27-32°C條件下培養(yǎng)25-40 h，發(fā)酵過(guò)程中流加堿性物質(zhì)溶液控制PH始終為6. 7-7. 3，L-山梨糖下降到5-15 g/L時(shí)，流加L-山梨糖保持L-山梨糖濃度為10-25 g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵方法，其特征是步驟(I)中活化培養(yǎng)基的組成為山梨糖 5-15 g/L,葡萄糖 2-5 g/L,酵母膏 3-8 g/L,玉米衆(zhòng) 3-10 g/L,尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH6. 7-7. 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵方法，其特征是步驟(2)中平板培養(yǎng)基組成為山梨糖 5-20 g/L，胰蛋白胨 1-5 g/L，尿素 0.05-0. 2 g/L，玉米漿 2-6 g/L，牛肉膏 0.5-2 g/L,酵母膏 0.5-2. 0 g/L，磷酸二氫鉀 0.5-1. 5 g/L，硫酸鎂 0. 1-0. 3 g/L，瓊脂粉 17 g/L, pH6.7-7. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵方法，其特征是步驟(3)中茄瓶培養(yǎng)基組成為山梨糖3-8 g/L，酵母膏 2-6 g/L，硫酸鎂 1-3 g/L，瓊脂粉 17 g/L, pH 6. 7-7. 20
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵方法，其特征是步驟(4)中種子培養(yǎng)基的組成為山梨糖 8-20 g/L，葡萄糖 1-5 g/L，玉米漿 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 2 ;步驟(5)中擴(kuò)大培養(yǎng)基組成為山梨糖8-20 g/L，葡萄糖1-5 g/L，玉米漿5-12 g/L，尿素0. 05-0. 2g/L, pH 6. 7-7. 2。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵方法，其特征是步驟(6)中發(fā)酵培養(yǎng)基組成為山梨糖20-30 g/L，玉米漿 5-12 g/L，尿素 0. 05-0. 2 g/L, pH 6. 7-7. 3。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的發(fā)酵方法，其特征是步驟(6)中發(fā)酵時(shí)間為32-35h。
10.一種維生素C的制備方法，采用二步發(fā)酵法制備維生素C，其特征是采用權(quán)利要求2-9中任一項(xiàng)所述的維生素C中間體2-酮基-L-古龍酸的發(fā)酵方法將L-山梨糖轉(zhuǎn)化為2-酮基-L-古龍酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種2-酮基-L-古龍酸高耐受型氧化葡糖酸桿菌(Gluconobacteroxydans)TL-1045，還提供了該菌株在維生素C發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的氧化葡糖酸桿菌TL-1045能夠耐受高濃度的2-酮基-L-古龍酸，解除了維生素C發(fā)酵生產(chǎn)第二步中產(chǎn)物對(duì)菌體的反饋抑制，2-酮基-L-古龍酸的產(chǎn)量可達(dá)到125g/L以上，使得維生素C生產(chǎn)效率顯著提高，有效降低了維生素C的生產(chǎn)成本。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102757928SQ20121028143
公開(kāi)日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年8月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月9日
發(fā)明者付吉明, 劉敏, 莊祎, 張全景, 王喬隆, 鄭秀寧 申請(qǐng)人:山東天力藥業(yè)有限公司