專利名稱：一種單克隆雜交瘤的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種單克隆雜交瘤的制備方法。
背景技術(shù)：
自從Kohler和Milstein發(fā)明單克隆抗體技術(shù)以來(lái),該技術(shù)不斷發(fā)展完善,在生物醫(yī)藥領(lǐng)域疾病的診斷、治療以及科學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)需求越來(lái)越大。但制備單克隆抗體一個(gè)必不可少的環(huán)節(jié)而且也是最重要環(huán)節(jié)就是陽(yáng)性雜交瘤的克隆建系。融合后篩選出的雜交瘤細(xì)胞群系不完全是純系，仍屬于異質(zhì)性的細(xì)胞群。因此，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)雜交細(xì)胞群體進(jìn)一步純化，以便獲得同質(zhì)性的細(xì)胞群體。最常用的純化方法就是雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。克隆化培養(yǎng)是指單個(gè)雜交細(xì)胞在一個(gè)獨(dú)立的空間增值，最終擴(kuò)增為一群相對(duì)較純 的，且能夠穩(wěn)定表達(dá)某些特定性狀的細(xì)胞群體的培養(yǎng)方式。用于這種方法的細(xì)胞群體由于均來(lái)源于同一個(gè)祖先細(xì)胞，故可認(rèn)為其遺傳特性較為一致。常見的克隆化培養(yǎng)方法有以下五種I :有限稀釋法這是一種比較傳統(tǒng)的方法，即將ELISA檢測(cè)出的陽(yáng)性孔，稀釋到4-8細(xì)胞/mL。取20mL放入96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。這樣約有36%的孔含有I個(gè)細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到2(Γ80%孔底時(shí)，用ELISA檢測(cè)，將檢測(cè)出的陽(yáng)性孔按照上述方法再克隆，直到所有具有雜交瘤的孔中都呈陽(yáng)性，即陽(yáng)性率需達(dá)到100%。此亞克隆方法的缺點(diǎn)有1、對(duì)細(xì)胞的計(jì)數(shù)要求非常高；2、由于陽(yáng)性的克隆容易被陰性的克隆所排擠，導(dǎo)致陽(yáng)性克隆容易丟失；3、由于需要反復(fù)克隆再克隆，細(xì)胞培養(yǎng)的工作量大、操作繁瑣、克隆效率低。因此，它不能適應(yīng)需要建立幾十株以上雜交瘤的功能性抗體篩選的研究。但用甲基纖維素制成半固體培養(yǎng)基可以克服以上方法的局限性，直接進(jìn)行克隆化的培養(yǎng)，提高了工作效率。2 甲基纖維素半固體培養(yǎng)基一步法國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道選用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法篩選雜交瘤細(xì)胞，此法是將細(xì)胞接種于半固體培養(yǎng)基里使細(xì)胞以分散的方式單個(gè)生長(zhǎng)，增值后的細(xì)胞后代不能遷移，只是在祖先細(xì)胞鄰近形成細(xì)胞集落，然后挑出這些細(xì)胞集落再進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得較純的雜交瘤細(xì)胞群體的方法。半固體培養(yǎng)基最常見的有軟瓊脂培養(yǎng)基和甲基纖維素培養(yǎng)基。但這個(gè)方法應(yīng)用并不廣泛，主要原因是在甲基纖維素半固體培養(yǎng)環(huán)境下，雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到限制，其生長(zhǎng)狀態(tài)不如液體培養(yǎng)基好，原因可能是因?yàn)榧谆w維素限制雜交瘤細(xì)胞葡萄糖的利用，增加了氨基酸的消耗。由于融合后的細(xì)胞膜較脆弱，其最適的培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基，因而不容易在半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。因而用甲基纖維素半固體培養(yǎng)基一步法需要加入昂貴的細(xì)胞因子等來(lái)促進(jìn)雜交瘤的存活，才有利于簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，但是很多細(xì)胞因子的成份都是商業(yè)化的，因此其缺點(diǎn)就是增加了成本。軟瓊脂半固體培養(yǎng)基法，此方法由于瓊脂粉中存在有對(duì)細(xì)胞有毒性的物質(zhì)，容易導(dǎo)致細(xì)胞長(zhǎng)出來(lái)的較少，同時(shí)由于瓊脂在室溫下操作容易凝固，故需要在較高的溫度下加入細(xì)胞，由于溫度控制不好，可能直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。
3 :凝血素半固體培養(yǎng)基法此種方法需要使用凝血因子使得培養(yǎng)基凝固，使得雜交瘤長(zhǎng)出來(lái)的較少，因此不太常用。4:單細(xì)胞顯微技術(shù)這一方法是通過(guò)顯微操作分離單個(gè)雜交細(xì)胞，然后將其植入單個(gè)培養(yǎng)空間，最終獲得單個(gè)雜交細(xì)胞的后代。但用于顯微操作的雜交細(xì)胞應(yīng)具備可辨認(rèn)的獨(dú)特形態(tài)學(xué)特征，并且需借助倒置顯微鏡。5:熒光激活分選此方法是采用激活分選儀進(jìn)行的。方法是用熒光物質(zhì)標(biāo)記特選的雜交細(xì)胞，然后將細(xì)胞懸液通過(guò)分選以上的細(xì)胞噴嘴，可形成單個(gè)細(xì)胞液滴。此法的基本原理是被熒光標(biāo) 記的待選細(xì)胞在激光照射下能夠發(fā)射熒光，再通過(guò)調(diào)整儀器參數(shù)使發(fā)射不同熒光的單個(gè)細(xì)胞液滴帶不同電荷，這些具有不同電荷的細(xì)胞液滴在電場(chǎng)中的偏轉(zhuǎn)角度不同，因此利用這一原理通過(guò)電腦處理，可分離不同雜交瘤。加入特定的熒光物質(zhì)，這些熒光物質(zhì)能夠特異性的在陽(yáng)性雜交瘤的周圍形成激光激發(fā)下的明亮的熒光光環(huán)，從而使得陽(yáng)性雜交瘤的篩選和亞克隆一步到位，大大節(jié)約了時(shí)間和勞力，但是由于其專利的技術(shù)和高昂的設(shè)備及試劑費(fèi)用阻礙著其成為一種常規(guī)的單抗生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種成本低、效率高的單克隆雜交瘤的制備方法。技術(shù)方案本發(fā)明提供的一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟(I)融合使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤細(xì)胞與抗原免疫后的淋巴細(xì)胞，得融合細(xì)胞；(2)培養(yǎng)將融合細(xì)胞接入次黃嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶(HAT)液體培養(yǎng)基中于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得雜交瘤細(xì)胞；(3)篩選將步驟(2)中含雜交瘤細(xì)胞的HAT液體培養(yǎng)基的上清液采用間接ELISA篩選，得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞；(4)亞克隆將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞接入亞克隆半固體培養(yǎng)基中于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，得單個(gè)雜交瘤細(xì)胞集落；(5)擴(kuò)大培養(yǎng)取單個(gè)雜交瘤細(xì)胞集落的細(xì)胞接入胎牛血清培養(yǎng)液中于二氧化碳培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)，即得單克隆雜交瘤細(xì)胞。作為本發(fā)明單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法的一種優(yōu)選，步驟(I)中，所述淋巴細(xì)胞為小鼠脾細(xì)胞，所述骨髓瘤細(xì)胞包括sp2/0細(xì)胞或NS-I細(xì)胞。作為本發(fā)明單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法的另一種優(yōu)選，步驟(I)中，所述淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量比為(10-2):1，所述聚乙二醇的分子量為1000-6000，所述聚乙二醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為40-60%。作為本發(fā)明單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法的另一種優(yōu)選，步驟(I)中，將融合細(xì)胞接入含胎牛血清培養(yǎng)液中于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；從而使融合細(xì)胞生長(zhǎng)更好，獲得更多的融合細(xì)胞，有利于步驟(2)的進(jìn)一步培養(yǎng)。作為進(jìn)一步優(yōu)選，所述胎牛血清培養(yǎng)液的胎牛血清體積百分比為10% -20%,所述培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5-7%，培養(yǎng)溫度為25-37°C，培養(yǎng)時(shí)間為16-24h。作為本發(fā)明單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法的另一種優(yōu)選，步驟(2)中，HAT液體培養(yǎng)基為HAT水溶液，其中HAT的體積百分比為2-5%，培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5_7%，培養(yǎng)溫度為25-37°C，培養(yǎng)時(shí)間8-12d。作為本發(fā)明單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法的另一種優(yōu)選，步驟(4)中所述亞克隆半固體培養(yǎng)基的配方為谷氨酰胺I水溶液O. 1-1. OmL,體積分?jǐn)?shù)O. 25 % -2. 5% ；非必需氨基酸水溶液(MEM)O. 1-1. OmL,體積分?jǐn)?shù)O. 25% -2. 5% ；
β —巰基乙醇O. 1-1. OmL,體積分?jǐn)?shù) O. 25% -2. 5% ；次黃嘌呤-胸腺嘧啶(HT)水溶液 O. 1-1. OmL,體積分?jǐn)?shù)O. 25% -2. 5% ；
青霉素及鏈霉素水溶液O. 1-1. OmL,體積分?jǐn)?shù)O. 25%—2. 5% ；胎牛血清水溶液5-10mL，體積分?jǐn)?shù)12. 5% — 25% ;甲基纖維素O. l_lg, 2. 5mg/ml—25mg/ml ；DMEM 高糖水溶液25_35mL，體積分?jǐn)?shù) 62. 5%—87. 5%。作為本發(fā)明單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法的另一種優(yōu)選，步驟(4)中，所述培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5-7%，培養(yǎng)溫度為25-37°C，培養(yǎng)時(shí)間為7-14天。作為本發(fā)明單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法的另一種優(yōu)選，步驟(5)中，所述培養(yǎng)液為體積百分比的10%-20%胎牛血清培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為1_5%，培養(yǎng)溫度為25-37 °C，培養(yǎng)時(shí)間為3-5天。有益效果本發(fā)明提供的單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法培養(yǎng)周期短、成本低、篩得的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株全。該方法首先采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)融合細(xì)胞，并通過(guò)HAT液體培養(yǎng)基篩選得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，最后用未添加細(xì)胞因子的亞克隆半固體培養(yǎng)基對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)制備得到單克隆雜交瘤細(xì)胞。該方法通過(guò)控制亞克隆半固體培養(yǎng)基中甲基纖維素的含量，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得到大量肉眼可見的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞集落，該方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是—是,米用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)融合細(xì)胞可以使剛?cè)诤系募?xì)胞處于好的生長(zhǎng)狀態(tài)，從而保證篩到所有的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株，有效避免了融合細(xì)胞在半固體培養(yǎng)基中成活率低的問(wèn)題；二是，亞克隆半固體培養(yǎng)基采用甲基纖維素培養(yǎng)基，一方面該培養(yǎng)基制備方法簡(jiǎn)單，粘度易控制，細(xì)胞在其中可呈現(xiàn)單克隆集落生長(zhǎng)，另一方面基纖維素對(duì)細(xì)胞的毒性小，甲基纖維素半固體培養(yǎng)基適合于雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；因此只需一次亞克隆即可得到單克隆，大大縮短了亞克隆過(guò)程中的時(shí)間和減輕了亞克隆的工作量。三是，亞克隆在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)之后進(jìn)行，此時(shí)雜交瘤細(xì)胞達(dá)到較好狀態(tài)，因此半固體培養(yǎng)基中不添加細(xì)胞因子也能使得單個(gè)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)出來(lái)，大大的降低了生產(chǎn)成本。


圖Ia為在甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞群。圖Ib為在顯微鏡下甲基纖維素半固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞群(放大10 倍)。圖2為單克隆抗體亞型鑒定結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式根據(jù)下述實(shí)施例，大家可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。所用試劑I、甲基纖維素(Methyl cellulose) (Sigma, CAT:9004-67-5)2、DMEM 高糖水溶液(Hyclone, CAT:SH3OO22. 01B) 3、β —巰基乙醇(2-ME)(Sigma, CAT: M3148)4、0·22μπι 濾膜(Millipore, CAT: SL⑶33RB)5、次黃嘌呤-胸腺嘧啶(HT)水溶液 (Gibco，CAT: 21060-017)6、胎牛血清水溶液(Hyclone, CAT;SV30087. 02)7、谷氨酸胺 I 水溶液(Invitrogen, CAT:35050061)8、非必需氨基酸(MEM)水溶液(Gibco, CAT: 11140-050)9、青霉素及鏈霉素水溶液(Hyclone, CAT:SV30010)所用溶液及培養(yǎng)基配制方法(I)甲基纖維素母液稱取甲基纖維素固體于三角燒瓶中，加入干凈的轉(zhuǎn)子。使用鋁箔紙密封后，高溫高壓滅菌。在無(wú)菌的條件下加入冰冷的DMEM高糖溶液后，4°C快速攪拌12-24小時(shí)，直至甲基纖維素全部溶解。(2) β —巰基乙醇母液取β —巰基乙醇加入DMEM高糖溶液中，使用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾除菌。(3)亞克隆半固體培養(yǎng)基在在滅好菌的50mL離心管中依次加入以下配方并上下顛倒劇烈混勻6_10次。谷氨酰胺I水溶液市售0. 1-1. OmL,在培養(yǎng)基中體積分?jǐn)?shù)0. 25% -2. 5% ；非必需氨基酸水溶液市售0. 1-1. OmL,在培養(yǎng)基中體積分?jǐn)?shù)0. 25% -2. 5% ；β —巰基乙醇市售0. 1-1. OmL，在培養(yǎng)基中體積分?jǐn)?shù)0. 25% -2. 5% ；次黃嘌呤-胸腺嘧啶水溶液市售0. 1-1. OmL,在培養(yǎng)基中體積分?jǐn)?shù)0. 25%—2. 5% ；青霉素及鏈霉素水溶液市售0. 1-1. OmL，在培養(yǎng)基中體積分?jǐn)?shù)0.25%—
2.5% ；胎牛血清水溶液市售 5-10mL，在培養(yǎng)基中體積分?jǐn)?shù)12. 5%—25% ；甲基纖維素市售0. Ι-lg,在培養(yǎng)基中濃度為2. 5mg/ml—25mg/ml ；DMEM高糖水溶液市售 25-35mL，在培養(yǎng)基中體積分?jǐn)?shù)62. 5%—87. 5%。
實(shí)施例I克隆雜交瘤細(xì)胞的制備。I.融合取常規(guī)免疫后的小鼠的脾細(xì)胞與狀態(tài)好的sp2/0細(xì)胞，控制脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞數(shù)量比在5 :1，使用體積分?jǐn)?shù)為50%的PEG 4000融合；可選地，也可以控制脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞數(shù)量比在(10-2) :1之間，也可以選擇分子量范圍在1000-6000的PEG。將融合后的細(xì)胞使用20%的胎牛血清培養(yǎng)液在37度5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16小時(shí)。2.培養(yǎng)輕輕吹下雜交瘤細(xì)胞并離心沉淀后使用5-10mL常規(guī)的HAT的體積百分比為2%的HAT液體培養(yǎng)基重懸后再用上述培養(yǎng)基定容至120mL，分裝到6塊96孔板中，200 μ L/孔；37°C 5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后使用HAT培養(yǎng)基全量換液。 3.篩選繼續(xù)培養(yǎng)3天后開始吸上清液整板進(jìn)行ELISA檢測(cè)。其中，ELISA檢測(cè)方法如下3. I抗原包被用包被緩沖液將完全抗原進(jìn)行稀釋，以100 μ I/孔加入酶標(biāo)板，4°C過(guò)夜，一般稀釋濃度為2 μ g/ml ；3.2 封閉取出酶標(biāo)板，不用棄去孔內(nèi)液體，配制75%的脫脂奶粉，每孔200ul，37°C溫育
I.5h ；3. 3 洗滌棄去孔內(nèi)液體，用自來(lái)水洗12遍，然后拍干；3. 4 加樣吸取上清抗體檢測(cè)加入各個(gè)孔的上清，同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照(小鼠血清)，陰性對(duì)照(PBST), 100 μ I/ 孔，37。。Ih ；3. 5 洗板棄去孔內(nèi)液體，用自來(lái)水洗12遍，拍干；3. 6加入酶標(biāo)二抗每孔加入I :5000— I :10000倍稀釋的合適的酶標(biāo)二抗(IgG-HRP)現(xiàn)配，100 μ I/孔，37°C Ih ；3. 7 洗滌棄去孔內(nèi)液體，洗板12次，拍干；3. 8顯色反應(yīng)加入新配的底物液(TMB使用液)，100 μ I/孔，37°C避光反應(yīng)15_20min ；3. 9終止每孔加終止液50 μ 1，(2M H2SO4)振蕩混勻；3. 10 測(cè)定靜置10-15min后于酶標(biāo)儀上讀取450nm處的OD值；3. 11結(jié)果判定若OD450X). 5，則判斷為陽(yáng)性孔。
4.亞克隆選擇ELISA檢測(cè)陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克?。挥?00 μ L/孔的DMEM重懸細(xì)胞后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，取400-500個(gè)細(xì)胞放入40mL的亞克隆半固體培養(yǎng)基中，上下顛倒10-20次混勻后，靜置5min ；將其中20mL分裝到10個(gè)6孔培養(yǎng)皿中，使每個(gè)6孔培養(yǎng)皿中細(xì)胞數(shù)在40_50個(gè)，這樣做的目的是爭(zhēng)取在一次亞克隆即可達(dá)到單克??；再向剩下的20mL亞克隆半固體培養(yǎng)基中再次加入200個(gè)左右的細(xì)胞，重復(fù)上述操作，分裝于5個(gè)中型培養(yǎng)皿中，每個(gè)中型培養(yǎng)皿細(xì)胞數(shù)在80-100，這樣做目的是確保能夠得到雜交瘤；最后封好封口膜后置于37°C 5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后，使用封口膜可防止培養(yǎng)皿變干。 5.擴(kuò)大培養(yǎng)長(zhǎng)出肉眼可見的細(xì)胞集落后，使用微量移液器挑取培養(yǎng)皿中較分散的細(xì)胞集落到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中置于37°C 5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天后擴(kuò)大培養(yǎng)，即得單克隆雜交瘤細(xì)胞。采用有限稀釋法、甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法和本發(fā)明方法相比，各自所需時(shí)間見表I。表I不同方法制備方法所需時(shí)間
首次克隆二次克隆三次克隆擴(kuò)大培養(yǎng)
方法名稱融合時(shí)間
lit IR」 Ut 間時(shí) 間時(shí) 間 冇限稀釋法 1.5周2周2周2周14天
半固體培養(yǎng)基法 1.5周 0.5周不需要不需耍 14天
本發(fā)明方法 1.5周 1.5周不需要不需要 14天實(shí)施例2克隆雜交瘤細(xì)胞的制備。I.融合取常規(guī)免疫后的小鼠的脾細(xì)胞與狀態(tài)好的NS-I細(xì)胞，控制脾細(xì)胞和NS-I細(xì)胞數(shù)量比在10 :1，使用體積分?jǐn)?shù)為60%的PEG 1000融合；可選地，也可以控制脾細(xì)胞和NS-I細(xì)胞數(shù)量比在(10-2) 1之間，也可以選擇分子量范圍在1000-6000的PEG。將融合后的細(xì)胞使用15%的胎牛血清培養(yǎng)液在25度5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。2.培養(yǎng)輕輕吹下雜交瘤細(xì)胞并離心沉淀后使用5-10mL常規(guī)的HAT的體積百分比為5%的HAT液體培養(yǎng)基重懸后再用上述培養(yǎng)基定容至120mL，分裝到6塊96孔板中，200 μ L/孔；25°C 5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后使用HAT培養(yǎng)基全量換液。繼續(xù)培養(yǎng)5天后開始吸上清液整板進(jìn)行ELISA檢測(cè)，方法同實(shí)施例I。3.亞克隆選擇ELISA檢測(cè)陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克??；
用200 μ L/孔的DMEM重懸細(xì)胞后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，取400-500個(gè)細(xì)胞放入40mL的亞克隆半固體培養(yǎng)基中，上下顛倒10-20次混勻后，靜置5min ；將其中20mL分裝到10個(gè)6孔培養(yǎng)皿中，使每個(gè)6孔培養(yǎng)皿中細(xì)胞數(shù)在40_50個(gè)，這樣做的目的是爭(zhēng)取在一次亞克隆即可達(dá)到單克??；再向剩下的20mL亞克隆半固體培養(yǎng)基中再次加入200個(gè)左右的細(xì)胞，重復(fù)上述操作，分裝于5個(gè)中型培養(yǎng)皿中，每個(gè)中型培養(yǎng)皿細(xì)胞數(shù)在80-100，這樣做目的是確保能夠得到雜交瘤；最后封好封口膜后置于25°C 5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14天后,使用封口膜可防止培養(yǎng)皿變干。4.擴(kuò)大培養(yǎng)
長(zhǎng)出肉眼可見的細(xì)胞集落后，使用微量移液器挑取培養(yǎng)皿中較分散的細(xì)胞集落到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中置于25°C 5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后擴(kuò)大培養(yǎng)，即得單克隆雜交瘤細(xì)胞。實(shí)施例3克隆雜交瘤細(xì)胞的制備。I.融合取常規(guī)免疫后的小鼠的脾細(xì)胞與狀態(tài)好的sp2/0細(xì)胞，控制脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞數(shù)量比在2 :1，使用體積分?jǐn)?shù)為40%的PEG 6000融合；可選地，也可以控制脾細(xì)胞和sp2/0細(xì)胞數(shù)量比在(10-2) 1之間，也可以選擇分子量范圍在1000-6000的PEG。將融合后的細(xì)胞使用10%的胎牛血清培養(yǎng)液在30度5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20小時(shí)。2.培養(yǎng)輕輕吹下雜交瘤細(xì)胞并離心沉淀后使用5-10mL常規(guī)的HAT的體積百分比為4%的HAT液體培養(yǎng)基重懸后再用上述培養(yǎng)基定容至120mL，分裝到6塊96孔板中，200 μ L/孔；30°C 5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天后使用HAT培養(yǎng)基全量換液。3.篩選繼續(xù)培養(yǎng)3天后開始吸上清液整板進(jìn)行ELISA檢測(cè)。4.亞克隆選擇ELISA檢測(cè)陽(yáng)性孔進(jìn)行亞克?。挥?00 μ L/孔的DMEM重懸細(xì)胞后，計(jì)數(shù)細(xì)胞，取400-500個(gè)細(xì)胞放入40mL的亞克隆半固體培養(yǎng)基中，上下顛倒10-20次混勻后，靜置5min ；將其中20mL分裝到10個(gè)6孔培養(yǎng)皿中，使每個(gè)6孔培養(yǎng)皿中細(xì)胞數(shù)在40_50個(gè)，這樣做的目的是爭(zhēng)取在一次亞克隆即可達(dá)到單克??；再向剩下的20mL亞克隆半固體培養(yǎng)基中再次加入200個(gè)左右的細(xì)胞，重復(fù)上述操作，分裝于5個(gè)中型培養(yǎng)皿中，每個(gè)中型培養(yǎng)皿細(xì)胞數(shù)在80-100，這樣做目的是確保能夠得到雜交瘤；最后封好封口膜后置于30°C 5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天后,使用封口膜可防止培養(yǎng)皿變干。5.擴(kuò)大培養(yǎng)長(zhǎng)出肉眼可見的細(xì)胞集落后，使用微量移液器挑取培養(yǎng)皿中較分散的細(xì)胞集落到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中置于30°C 5-7%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后擴(kuò)大培養(yǎng)，即得單克隆雜交瘤細(xì)胞。實(shí)施例4單克隆抗體制備及亞型鑒定。I.單克隆抗體的制備提前7-10天接種液體石蠟于8-12周齡Balb/c小鼠腹腔中，O. 5-0. 6mL/只；再用不完全培養(yǎng)基即DMEM培養(yǎng)基稀釋的實(shí)施例I的單克隆雜交瘤細(xì)胞接種于每只已注射液體石臘的Balb/c小鼠腹腔,計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),約I. OX 10~6個(gè)/mL,即大約O. 5mL/只；注射雜交瘤后大約5-7天后，每天觀察記錄Babl/c小鼠產(chǎn)生腹水狀況，如果小鼠腹腔明顯膨大即可用針頭抽取腹水(針頭標(biāo)準(zhǔn)為7號(hào)針頭)，一般可連續(xù)收集3-4次，通常每只小鼠收集5-1 OmL。
將腹水純化后，即制得單克隆抗體。2.單克隆抗體制備及亞型鑒定將制得得單克隆抗體采用Sigma的亞型鑒定試劑盒(Mouse Monoclonal AntibodyIsotyping Reagents、Stock No. IS0-2)鑒定單克隆抗體亞型。細(xì)胞上清可采用抗原介導(dǎo)ELISA法和捕獲ELISA法兩種方法進(jìn)行亞型鑒定。用抗原介導(dǎo)ELISA法基本步驟如下(I)抗原包被用包被緩沖液將完全抗原進(jìn)行稀釋，以100 μ L每孔加入酶標(biāo)板，37度溫育lh，一般稀釋濃度為2 μ g/mL ；(2)封閉配制75%的脫脂奶粉，不需棄掉孔內(nèi)液體，直接加入酶標(biāo)板孔中，每孔200 μ L, 37 度溫育 Ih ；(3)洗板棄去孔內(nèi)液體，用自來(lái)水洗12遍，拍干；(4)加樣加入每個(gè)與包被原對(duì)應(yīng)的亞克隆上清，同時(shí)以每個(gè)亞克隆上清按六個(gè)亞型做對(duì)應(yīng)的六個(gè)孔，剩余兩個(gè)孔做陰性對(duì)照(PBST)，每孔100 μ L,室溫反應(yīng)2h ；(5)洗板棄去孔內(nèi)液體，用自來(lái)水洗12遍，拍干；(6)加入六個(gè)亞型按1:1000用PBST稀釋個(gè)個(gè)亞型，以每孔IOOul按順序加入對(duì)應(yīng)的亞型加入酶標(biāo)板，記清楚對(duì)應(yīng)加入的亞型順序，室溫反應(yīng)30min ；(7)洗板棄去孔內(nèi)液體，自來(lái)水洗12遍，拍干；(8)加入酶標(biāo)記二抗用PBST稀釋1:5000，加入酶標(biāo)板，每孔100 μ L，室溫反應(yīng)15min ；(9)洗板棄去孔內(nèi)液體，自來(lái)水12遍，拍干；(10)顯色以每孔100 μ L計(jì)算所需的量，配制顯色液(Na2HPO4. 12Η20+檸檬酸+雙蒸水 +ΤΜΒ+Η202)每孔 100 μ L，37 度溫育 15min ；(11)終止每孔加終止液2mol/L H2SO4IOO μ L震蕩混勻；(12)測(cè)OD值在酶標(biāo)儀450nm處檢測(cè)OD值，記錄數(shù)據(jù)(表2);(13)結(jié)果顯示在C行IgGl處，數(shù)值最高；可以判定該細(xì)胞亞型為IgGl亞型。圖2顯示了抗原介導(dǎo)ELISA法基本步驟后的最終顯色情況；其中，第三行有明顯顯色，說(shuō)明該檢測(cè)的雜交瘤細(xì)胞株的亞型為IgGl。表2單克隆亞型鑒定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)融合使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤細(xì)胞與抗原免疫后的淋巴細(xì)胞，得融合細(xì)胞； (2)培養(yǎng)將融合細(xì)胞接入HAT液體培養(yǎng)基中于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得雜交瘤細(xì)胞； (3)篩選將雜交瘤細(xì)胞上清液采用間接ELISA篩選，得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞； (4)亞克隆將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞接入亞克隆半固體培養(yǎng)基中于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，得單個(gè)雜交瘤細(xì)胞集落； (5)擴(kuò)大培養(yǎng)取單個(gè)雜交瘤細(xì)胞集落的細(xì)胞接入胎牛血清培養(yǎng)液中于二氧化碳培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)，即得單克隆雜交瘤細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于步驟(I)中，所述淋巴細(xì)胞為小鼠脾細(xì)胞，所述骨髓瘤細(xì)胞包括sp2/0細(xì)胞或NS-I細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于步驟(O中，所述淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)量比為(10-2) 所述聚乙二醇的分子量為1000-6000，所述聚乙二醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為40-60%。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于步驟(I)中，還可以將融合細(xì)胞接入含胎牛血清培養(yǎng)液中于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于所述胎牛血清培養(yǎng)液的胎牛血清體積百分比為10% _20%，所述培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5-7%，培養(yǎng)溫度為25-37°C，培養(yǎng)時(shí)間為16-24h。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于步驟(2)中，HAT液體培養(yǎng)基的HAT的體積分?jǐn)?shù)為2-5%，培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5_7%，培養(yǎng)溫度為25-37°C，培養(yǎng)時(shí)間8-12天。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于步驟(4)中，所述亞克隆半固體培養(yǎng)基的配方為 谷氨酰胺I水溶液O. 1-1. OmL,體積分?jǐn)?shù)O. 25 % -2. 5% ； 非必需氨基酸水溶液O. 1-1. OmL,體積分?jǐn)?shù)O. 25% -2. 5% ； β —巰基乙醇O. 1-1. OmL,體積分?jǐn)?shù)O. 25% -2. 5% ； 次黃嘌呤-胸腺嘧啶水溶液O. 1-1. OmL,體積分?jǐn)?shù)O. 25 % -2. 5% ； 青霉素及鏈霉素水溶液O. 1-1. OmL,體積分?jǐn)?shù)O. 25% -2. 5% ； 胎牛血清水溶液5-10mL，體積分?jǐn)?shù)12.5% -25% ； 甲基纖維素O. 1-lg, 2. 5mg/ml-25mg/ml ； DMEM高糖水溶液25-35mL，體積分?jǐn)?shù)62. 5%—87. 5%。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于步驟(4)中，所述培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5-7%，培養(yǎng)溫度為25-37°C，培養(yǎng)時(shí)間為7-14天。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，其特征在于步驟(5)中，所述培養(yǎng)液為體積百分比的10%_20%胎牛血清培養(yǎng)液，所述培養(yǎng)箱中二氧化碳濃度為5-7%，培養(yǎng)溫度為25-37°C，培養(yǎng)時(shí)間為3-5天。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種單克隆雜交瘤細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟步驟一，融合使用聚乙二醇水溶液融合骨髓瘤細(xì)胞與抗原免疫后的淋巴細(xì)胞，得融合細(xì)胞；步驟二，培養(yǎng)將融合細(xì)胞接入HAT液體培養(yǎng)基中于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，得雜交瘤細(xì)胞；步驟三，篩選將雜交瘤細(xì)胞上清液采用間接ELISA篩選，得陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞；步驟四，亞克隆將陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞接入亞克隆半固體培養(yǎng)基中于二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，得單個(gè)雜交瘤細(xì)胞集落；步驟五，擴(kuò)大培養(yǎng)取單個(gè)雜交瘤細(xì)胞集落的細(xì)胞接入胎牛血清培養(yǎng)液中于二氧化碳培養(yǎng)箱中擴(kuò)大培養(yǎng)，即得單克隆雜交瘤細(xì)胞。該制備方法培養(yǎng)周期短、成本低、篩得的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株全。
文檔編號(hào)C12N5/20GK102864125SQ20121028049
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者周軍, 王玉燕, 馮展波 申請(qǐng)人:南京巴傲得生物科技有限公司