專利名稱：一種用于檢測小黃魚群體結(jié)構(gòu)的選擇性分子標(biāo)記及其引物與檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及選擇性分子標(biāo)記和小黃魚，具體涉及一種能檢測小黃魚種群結(jié)構(gòu)的選擇性遺傳標(biāo)記、引物及其檢測方法。
背景技術(shù)：
漁業(yè)資源的保護和管理需要清晰了解魚類的群體結(jié)構(gòu)，但洄游性海水魚類相比較于淡水魚類群體結(jié)構(gòu)通常并不明顯，有的甚至可視為一個自由交配群體。這是由于開放的海洋環(huán)境中缺少遺傳障礙并且不同洄游群體之間往往在產(chǎn)卵場或索餌場存在混合的現(xiàn)象，因而存在著很顯著的基因流，不同地理群體之間的遺傳分化很弱(Waples，The Journalof heredity 1998,89 438 - 450 ；Ruzzante 等，Proceedings of the Royal SocietyB-Biological Sciences 2006,273:1459 - 1464)。目前分析魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)的技術(shù)主要是使用中性的分子標(biāo)記，但即使是靈敏度高的SSR和SNP標(biāo)記，在分析這類洄游性魚類的群體結(jié)構(gòu)時往往也束手無策。值得指出的是，廣闊而且多變的海洋環(huán)境為自然選擇提供了更多的機會，適應(yīng)性進(jìn)化因而可能普遍存在于海洋魚類中，因此用選擇性標(biāo)記去分析可能會檢測到洄游性魚類的群體結(jié)構(gòu)，這對魚類群體的保護和管理來說是至關(guān)重要的(Nielsen等，Molecular Ecology 2009,18:3128-3150)。/\、黃魚XLarimichthys隸屬于S盧形目、石首魚科、黃花魚屬，為廣泛分布于渤海、黃海和東海北部的暖溫性底層魚類，是我國重要的海洋漁業(yè)經(jīng)濟種類，曾被譽為我國“四大漁業(yè)”之一。近些年來，高強度的捕撈壓力已經(jīng)使得小黃魚資源處于過度捕撈狀態(tài)。為了保護和管理小黃魚漁業(yè)資源，研究其種群遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳變異水平是非常必要的。然而，由于小黃魚是一種洄游性海水魚類，中性線粒體分子標(biāo)記分析了小黃魚的群體結(jié)構(gòu)后認(rèn)為整個小黃魚是一個自由交配的群體(Xiao等,Environmental Biology of Fishes2009,85 :303-314)。顯然，開發(fā)和應(yīng)用小黃魚選擇性分子標(biāo)記是解決問題的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有中性分子標(biāo)記難以檢測出小黃魚群體結(jié)構(gòu)的不足，提供一種能夠檢測小黃魚群體間遺傳差異的選擇性分子標(biāo)記序列及其引物。本發(fā)明的另一個目的在于提供用上述選擇性分子標(biāo)記檢測小黃魚群體結(jié)構(gòu)的方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種用于檢測小黃魚群體結(jié)構(gòu)的選擇性分子標(biāo)記H16，其序列如SEQ ID NO. I所示。其引物序列為:
H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCAH16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA
一種用于檢測小黃魚群體結(jié)構(gòu)的選擇性分子標(biāo)記H16，其檢測方法步驟如下
(1)基因組DNA的提取
采用酚氯仿法提取小黃魚分布范圍內(nèi)采集到的32個產(chǎn)卵群體共1104尾小黃魚個體的基因組DNA，步驟如下剪取20mg尾鰭于I. 5ml離心管中，加入570yL STE buffer(10mmol/L Tris-Cl, pH=8. 0; lOOmmol/L EDTA, pH=8. 0; lOOmmol/L NaCl)并將組織剪碎；加入IOyL 20mg/ml的蛋白酶K和20 μ L 20% SDS，55_56°C消化；加入600 μ L酚氯仿異戍醇(25:24:1)抽提兩次，13000r/min離心5min,取上清；加入等體積_20°C預(yù)冷的無水乙醇，混勻，13000r/min離心5min，棄上清，用70%乙醇洗滌沉淀2次，室溫下晾干，然后加入 50-100yL TE buffer (lmmol/L EDTA, I Ommo I/L Tris-HCl, ρΗ=8· 0)溶解 DNA ;紫外分光光度計檢測DNA濃度，用TE buffer將其稀釋至100 μ g/mL,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性；DNA樣品存于_80°C冰箱中備用；
(2)PCR擴增反應(yīng)及測序
擴增反應(yīng)體系為20yL :0. 5μΜ引物(正向引物5’端用熒光染料HEX標(biāo)記)，0. 2mMdNTP, I. 5mM MgCl2, IXPCR buffer, IU Taq DNA聚合酶以及 50ng模板DNA ;反應(yīng)程序94°C5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，最后延伸 5min ;PCR 產(chǎn)物用 ABI PRISM 3730 DNA 自動測序儀分離，片段長度用軟件GeneMapper根據(jù)內(nèi)標(biāo)R0X-500確定；
(3)中性檢測
采用如下方法一或方法二檢測位點是否中性方法一是利用軟件BAYESCAN中的貝葉斯模擬檢測，界定群體-位點特異性效應(yīng)對Fst的影響并用Markov chain Monte Carlo方法來評估其后驗概率分布；方法二是利用軟件Arlequin 3. 5進(jìn)行結(jié)構(gòu)性的島模型分析；
(4)群體結(jié)構(gòu)分析
小黃魚的群體結(jié)構(gòu)利用軟件ARLEQUIN 3. 5通過計算Wright’s F統(tǒng)計用pairwise Fst矩陣來評估；為了比較不同類型標(biāo)記及其遺傳結(jié)構(gòu)，采用SPSS vl6. O對pairwise Fst矩陣進(jìn)行了多維尺度分析；以isolation by distance形式用Mantel tests檢測地理隔離對小黃魚遺傳結(jié)構(gòu)的影響。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
本發(fā)明是國內(nèi)外首次基于選擇性分子標(biāo)記建立的一種小黃魚群體結(jié)構(gòu)分析新方法，它利用來自小黃魚的BAHCCl基因設(shè)計合成的一對特異性引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)和測序片段分析就可以檢測出小黃魚的群體結(jié)構(gòu)，而中性的分子標(biāo)記很難檢測到洄游性小黃魚群體間的微弱遺傳差異。


圖I :基于選擇性分子標(biāo)記H16的小黃魚群體結(jié)構(gòu)多維尺度(MDS)分析圖。BS :渤海群體；NYS :黃海北部群體；CYS :黃海中部群體；SYS :黃海南部群體；NECS :東海北部群體；CECS :東海中部群體。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。檢測小黃魚群體結(jié)構(gòu)的選擇性分子標(biāo)記H16，其序列如SEQ ID NO. I所示。其引物序列為
H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCA H16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA檢測方法步驟如下
(I)基因組DNA的提取
采用酚氯仿法提取小黃魚分布范圍內(nèi)采集到的32個產(chǎn)卵群體共1104尾小黃魚個體的基因組DNA，具體步驟如下剪取20mg尾鰭于I. 5ml離心管中，加入570yL STE buffer(10mmol/L Tris-Cl, pH=8. 0; 10Ommol/T, EDTA, pH=8. 0; lOOmmol/L NaCl)并將組織剪碎。加入10 μ L 20mg/ml的蛋白酶K和20yL 20% SDS，55_56°C消化。加入600 μ L酚氯仿異戍醇(25:24:1)抽提兩次，13000r/min離心5min,取上清。加入等體積的無水乙醇，混勻，13000r/min離心5min,棄上清,用70%乙醇洗漆沉淀2次,室溫下晾干，然后加入 50-100 μ L TE buffer (lmmol/L EDTA, IOmmoI/L Tris-HCl, ρΗ=8· 0)溶解 DNA。紫外分光光度計檢測DNA濃度，用TE buffer將其稀釋至100 μ g/mL,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性。DNA樣品存于_80°C冰箱中備用。(2) PCR擴增反應(yīng)及測序
擴增反應(yīng)體系為20yL :0. 5μΜ引物(正向引物5’端用熒光染料HEX標(biāo)記)，0. 2mMdNTP, I. 5mM MgCl2, IXPCR buffer, IU Taq DNA聚合酶以及50ng模板DNA。反應(yīng)程序94°C5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，最后延伸 5min。PCR 產(chǎn)物用 ABI PRISM 3730 DNA 自動測序儀(Applied Biosystems)分離,片段長度用軟件GeneMapper根據(jù)內(nèi)標(biāo)R0X-500確定。結(jié)果表明選擇性分子標(biāo)記H16檢測到等位基因大小在216-256，雜合度為0.6332。(3)中性檢測
采用兩種方法檢測位點是否中性一是利用軟件BAYESCAN中的貝葉斯模擬檢測，界定群體-位點特異性效應(yīng)對Fst的影響并用Markov chain Monte Carlo(MCMC)方法來評估其后驗概率分布。二是利用軟件Arlequin 3. 5進(jìn)行結(jié)構(gòu)性的島模型(hierarchical islandmodel)分析。結(jié)果表明BAYESCAN分析得出位點特異性效應(yīng)α =3. 0859，后驗概率分布Pr=L 0000 !hierarchical island model 分析得出概率值P-value=0. 0000。兩種中性檢測方法都得出H16處在顯著的選擇壓力下，為選擇性位點。(4)群體結(jié)構(gòu)分析
小黃魚的群體結(jié)構(gòu)利用軟件ARLEQUIN 3. 5通過計算Wright’s F統(tǒng)計用pairwise Fst矩陣來評估。為了比較不同類型標(biāo)記及其遺傳結(jié)構(gòu)，采用SPSS vl6. O對pairwise Fst矩陣進(jìn)行了多維尺度(MDS)分析。結(jié)果表明選擇性分子標(biāo)記H16檢測到整個小黃魚群體呈現(xiàn)出明顯的結(jié)構(gòu)(Fst=O. 092，P〈0. 001)，東海北部群體和東海中部群體之間存在顯著分化，在其它分布區(qū)域內(nèi)屬于這兩個類群的 混合存在(見附圖I)。
權(quán)利要求
1.一種用于檢測小黃魚群體結(jié)構(gòu)的選擇性分子標(biāo)記，其特征在于所述的標(biāo)記編號為H16，其核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.權(quán)利要求I所述選擇性分子標(biāo)記H16的引物序列，其特征在于如下所示H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCAH16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA。
3.權(quán)利要求I所述選擇性分子標(biāo)記H16的檢測方法，其特征在于包括如下步驟 (1)基因組DNA的提取 采用酚氯仿法提取小黃魚分布范圍內(nèi)采集到的32個產(chǎn)卵群體共1104尾小黃魚個體的基因組DNA，步驟如下剪取20mg尾鰭于I. 5ml離心管中，加入570 y L STE buffer(10mmol/T, Tris-Cl, pH=8. 0; 100mmol/L EDTA, pH=8. 0; lOOmmol/L NaCl)并將組織剪碎；加入IOiiL 20mg/ml的蛋白酶K和20 y L 20% SDS，55_56°C消化；加入600 y L酚氯仿異戊醇(體積比25:24:1)抽提兩次，13000r/min離心5min，取上清；加入等體積_20°C預(yù)冷的無水乙醇，混勻，13000r/min離心5min,棄上清,用70%乙醇洗漆沉淀2次,室溫下晾干，然后加入 50-100 ii L TE buffer (lmmol/L EDTA, IOmmoI/L Tris-HCl, pH=8.0)溶解DNA ;紫外分光光度計檢測DNA濃度，用TE buffer將其稀釋至100 u g/mL,并用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性；DNA樣品存于_80°C冰箱中備用； (2)PCR擴增反應(yīng)及測序 擴增反應(yīng)體系為20 ii L :0. 5 ii M引物(正向引物5’端用熒光染料HEX標(biāo)記)，0. 2mMdNTP, I. 5mM MgC12，IXPCR buffer, IU Taq DNA聚合酶以及50ng模板DNA ;反應(yīng)程序94°C5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s，最后延伸 5min ;PCR 產(chǎn)物用 ABI PRISM 3730 DNA 自動測序儀分離，片段長度用軟件GeneMapper根據(jù)內(nèi)標(biāo)R0X-500確定； (3)中性檢測 采用如下方法一或方法二檢測位點是否中性方法一是利用軟件BAYESCAN中的貝葉斯模擬檢測，界定群體-位點特異性效應(yīng)對Fst的影響并用Markov chain Monte Carlo方法來評估其后驗概率分布；方法二是利用軟件Arlequin 3. 5進(jìn)行結(jié)構(gòu)性的島模型分析； (4)群體結(jié)構(gòu)分析 小黃魚的群體結(jié)構(gòu)利用軟件ARLEQUIN 3. 5通過計算Wright’s F統(tǒng)計用pairwise Fst矩陣來評估；為了比較不同類型標(biāo)記及其遺傳結(jié)構(gòu)，采用SPSS vl6.0對pairwise Fst矩陣進(jìn)行了多維尺度分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于檢測小黃魚群體結(jié)構(gòu)的選擇性分子標(biāo)記及其引物與檢測方法，其序列如SEQIDNO.1所示。引物序列為H16-F:CCAACGGGGATCAAATATCA，H16-R:CTAGGAACCACAACCCCTCA。檢測方法包括如下步驟基因組DNA的提取、PCR擴增反應(yīng)及測序、中性檢測和群體結(jié)構(gòu)分析。本發(fā)明的選擇性分子標(biāo)記能檢測出小黃魚的群體結(jié)構(gòu)。
文檔編號C12Q1/68GK102758024SQ201210278859
公開日2012年10月31日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者林浩然, 王樂, 蒙子寧 申請人:中山大學(xué)