專利名稱：水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的its2分子標(biāo)記鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及魚類雜種的分子標(biāo)記鑒定方法，具體涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的ITS2分子標(biāo)記鑒定方法。
背景技術(shù)：
鲇形目魚類屬肉食性底層魚類，是魚類進(jìn)化中最發(fā)達(dá)的真骨魚類之一。南方鲇(又叫大口鲇)iSilurus meridionalis Chen)和鲇asotus Linnaeus)均屬于鲇形目、鲇科、鲇屬，兩者味道鮮美、營養(yǎng)價(jià)值高，是我國各地主要養(yǎng)殖的高附加值經(jīng)濟(jì)魚類。南方鲇分布于我國珠江、閩江、湘江、長江等水系，是一種大型兇猛的肉食性魚類，具有生長快、個(gè)體大、抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，喜棲息于開敞水體，以及灣花、河底礫石河段，懷卵量大，產(chǎn)卵期長。鲇分布于除青藏高原及新疆外的全國各水系，體色隨棲息環(huán)境不同而有所變化，主要棲息于江河干流或較大的支流、大型湖泊和水庫等水體的中下層，其適應(yīng)性強(qiáng)，棲息于靜水或緩流水域，個(gè)體較小，生長快。南方鲇和鲇形體輪廓相似，小個(gè)體的南方鲇與鲇成體混同雜居，大個(gè)體與鲇隔離生活。據(jù)報(bào)道，人工繁殖的南方鲇群體中雄性比例非常低。調(diào)查顯示，當(dāng)雄性南方鲇缺乏時(shí)，可能進(jìn)行了雌性南方鲇與其他雄性鲇屬種類的雜交，從而在鲇魚生產(chǎn)中出現(xiàn)了物種間的雜交育種。為了滿足社會(huì)生產(chǎn)的需要，獲得兼有以上2種魚優(yōu)良性狀的苗種，王朝明等(大口鲇與鲇魚的雜交試驗(yàn)，淡水漁業(yè)，2004，34 (6): 4廣43 ;三種鲇遺傳多樣性的RAPD分析，淡水漁業(yè)，2005，35 (4) : 14 17)開展了南方鲇與鲇的雜交育種試驗(yàn)，并做了一定的雜種鑒定工作，篩選出22個(gè)隨機(jī)引物用于南方鲇、鲇及其雜交F1代三個(gè)群體多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜交F1代繼承了大口鲇的52條特征帶和鲇的32條特征帶。然而，其鑒定工作所采用的RAH)標(biāo)記，受方法本身的限制，檢測(cè)效率低且重復(fù)性不高，嚴(yán)重影響了這一方法的推廣使用。此外，僅有龍華等(鲇、大口鲇及其雜交鲇血液生理生化指標(biāo)比較及轉(zhuǎn)鐵蛋白等位基因分析，長江大學(xué)學(xué)報(bào)(自科版)，2006，3 (2): 161^164 ；鲇、大口鲇及其雜交鲇的血型分析，水利漁業(yè)，2007，27 (3) : 19 20)對(duì)南方鲇、鲇及其雜交鲇的血液生理、血型分析及同工酶等方面的研究?？梢姡斜匾_展南方鲇、鲇及其雜交子代的分子標(biāo)記及鑒定技術(shù)研究，為南方鲇養(yǎng)殖和育種實(shí)踐中的雜種鑒定提供可靠方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為鑒定南方鲇與鲇的雜種，從分子生物學(xué)層面上將形態(tài)上不易區(qū)分的雜種和純種進(jìn)行分辨。本發(fā)明以南方鲇、鲇及其雜交子代作為研究對(duì)象，在鲇屬魚類中篩選設(shè)計(jì)了 ITS2基因片段作為分子標(biāo)記，應(yīng)用所擴(kuò)ITS2基因片段在南方鲇和鲇中的長度差異，成功鑒定了南方鲇、鲇及其雜交子代。ITS基因片段是核糖體RNA轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的一部分，具有物種內(nèi)保守，物種間變異大的特點(diǎn)。采用該方法用于南方鲇、鲇及其雜交子代的鑒定，具有實(shí)驗(yàn)快捷，操作簡(jiǎn)便，鑒定直觀，無需測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)。、
為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案
水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的ITS2分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于應(yīng)用PCR擴(kuò)增后的南方鲇的ITS2基因片段和鲇的ITS2基因片段存在長度差異，采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定南方鲇、鲇及其雜交子代。所述的南方鲇的ITS2基因片段的核苷酸序列(SEQID NO: I)為
CTCGTGCGTC GATGAAGAAC GCAGCCAGCT GCGAGAACTA ATGTGAATTG CAGGACACAT
TGATCATCGA CACTTCGAAC GCACATTGCG GCCCCGGGTC CCTCCCGGGG CTACGCCTGT CTGAGGGTCGCTATTTCCAT CGATCGGGAA AAAAACGAAC CATACGCACG CGACTGGAAG CTCGCAGGCC GTCATCGGCCTTCGTCCTCC TAAAAGCAGA CGCTCTCTTT TTTCGTGTCG ；
所述的鲇的ITS2基因片段的核苷酸序列(SEQID N0:2)為
CTCGTGCGTC GATGAAGAAC GCAGCCAGCT GCGAGAACTA ATGTGAATTG CAGGACACATTGATCATCGA CACTTCGAAC GCACATTGCG GCCCCGGGTC CCTCCCGGGG CTACGCCTGT CTGAGGGTCGCTATTTCCAT CGATCGGGAA AAAAACGAAC GCGACTGGAA GCTCGCAGGC CGTCATCGGC CTTCGTCCTCCTAAAAGCAG ACGCTCTCTT TTTTCGTGTC G。所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的ITS2分子標(biāo)記鑒定方法，包括以下步驟
A分別取南方鲇、鲇及其雜交樣本，提取基因組DNA;
B分別以南方鲇、鲇及其雜交樣本的總DNA為模板，在ITS2基因片段特定引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
C瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測(cè)，在一個(gè)泳道上同時(shí)出現(xiàn)南方鲇和鲇的兩條基因條帶，則是南方鲇和鲇的雜交種。所述的ITS2基因片段特定引物的堿基序列為
正向引物(SEQID NO:3) 5’ 一AACTCTTAGCGGTGGATCACTCGG—3’ ；
反向引物(SEQID NO:4) 5’ 一CGTGGAAAGGCGGCGGAGAT—3’。本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明由于采用DNA序列作為分子標(biāo)記，因此可以準(zhǔn)確快速地將形態(tài)上不易區(qū)分的鲇魚雜種和鲇魚純種進(jìn)行分辨，并鑒定出南方鲇和鲇的雜交種。采用ITS2基因片段在南方鲇和鲇中的長度差異來鑒定鲇魚雜種，具有實(shí)驗(yàn)快捷，操作簡(jiǎn)便，鑒定直觀，無需測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)。


圖I為ITS2基因的長度差異性檢測(cè)電泳圖。圖中標(biāo)記為右側(cè)數(shù)字表不DNA片段的分子量，Dl D4為南方鲇樣本，Al A4為鲇樣本；Z1 TA為正交子代，F(xiàn)l F4為反交子代，M為Marker，本發(fā)明所用為DL2000DNA Marker (Tiangen 公司)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的ITS2分子標(biāo)記鑒定方法，以南方鲇、鲇及其雜交F1代作為研究對(duì)象，包括以下步驟
第一步，分別取南方鲇、鲇及其雜交樣本，提取基因組DNA。
因?yàn)殡s交魚苗個(gè)體很小，所以用海洋組織DNA提取試劑盒(Tiangen公司)提取魚苗樣本基因組DNA。用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法提取親本南方鲇和鲇鰭條樣本的基因組DNA
a取材取無水乙醇浸泡的鰭條樣本少許，用酒精消毒的剪刀剪碎，放入I. 5 ml EP管中。b 消化加入 500 UL 裂解緩沖液(10 mmol/L Tris-Cl ；0. I mol/L EDTA ；0. 5 %SDS ；pH 8.0),5 ML蛋白酶K (20 mg/ml )，混合均勻，放入55 °C的搖床內(nèi)，60-70 rpm消化過
夜。·c抽提I :取出EP管，待溶液冷卻至室溫，加入等體積的Tris飽和酚(約500 ML)，緩慢混勻10 min，12000 rpm離心10 min，用I ml槍頭緩慢將上清液移至另一 EP管中。d抽提2 :重復(fù)抽提I的步驟，用飽和酚再抽提一次，將上清液轉(zhuǎn)入另一 EP管中。e抽提3 :加入400 ML的酹-氯仿(I :1),緩慢混勻5 min, 12000 rpm離心10 min,
輕輕將上清液轉(zhuǎn)入另一 EP管中。f抽提4 :加入300 ML的氯仿，緩慢混勻5 min, 12000 rpm離心10 min,上清液轉(zhuǎn)
移至另一 EP管中。g沉淀加入管內(nèi)體積兩倍體積的冰凍無水乙醇,于_20°C沉淀20 min。8000 rpm離心I min。h漂洗I :加入150 ML 75 %的冰凍酒精，漂洗后，8000 rpm離心I min。i漂洗2 同漂洗I步驟。j漂洗3:用150 ML冰凍無水乙醇再漂洗一次,8000 rpm離心I min后,棄掉上清，
自然風(fēng)干。k溶解加入50 ML MilliQ超純水，溶解沉淀的DNA。第二步，篩選出具有長度差異的ITS2基因片斷。(I)參考GenBank中鲇18S核糖體RNA基因序列GQ465245，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer5. 0 設(shè)計(jì)引物 ITS2_F(SEQID NO: 3): 5’-AACTCTTAGCGGTGGATCACTCGG-3’和 TR(SEQIDN0:5) :5’ -TAAAITCAGCGGGTCGTCTCGTC-3’，并由 Invitrogen 公司合成。ITS2-F和TR為擴(kuò)增ITS2目的片段的引物對(duì)，其中的F代表正向引物(或上游引物)，TR在篩選種間序列長度差異時(shí)，代表反向引物(或下游引物)。(2) PCR 擴(kuò)增
將各組分按以下順序在0. 2 mL的PCR管中混合(反應(yīng)體系為50 ML)
①超純水36.6 ML
②Taq 酶 IOX buffer5 ML
③MgCl2 (I. 5 mM)4 ML
④dNTPs (2. 5 mM)I ML
⑤引物ITS2-F (25 pM)I ML
⑥引物TR (25 pM)IML
⑦模板DNA (約 100 ng)I ML
⑧Taq DNA 聚合酶(2. 5 U U L-1) 0. 4 ML 擴(kuò)增步驟為①94° C預(yù)變性4 min
②94。C變性30 s
③59° C退火35 s
④72° C延伸40 s
⑤重復(fù)步驟②-④31次
⑥72° C充分延伸7 min
(3)PCR產(chǎn)物回收
用I %的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物片段，并在紫外燈下切割目的條帶后放入1.5mL的EP管中，回收采用DNA Agarose Extraction kit (Omega公司)回收試劑盒。將電泳檢測(cè)合格的回收產(chǎn)物送生物公司測(cè)序。(4)數(shù)據(jù)分析與優(yōu)化擴(kuò)增片段
將測(cè)序公司返回的序列信息，人工校對(duì)后進(jìn)行在線BLAST (http://www. ncbi. nlm.nih. gov/BLAST)驗(yàn)證,驗(yàn)證無誤后使用DNAMAN Version 6.0對(duì)南方鲇與鲇的ITS2序列信息進(jìn)行比對(duì)并輔以人工調(diào)整，選取具有穩(wěn)定長度差異的保守序列SEQID N0:1和SEQID NO :2，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5. 0設(shè)計(jì)中間反向引物ITS2-R (SEQID N0:4)(5’ -CGTGGAAAGGCGGCGGAGAT-3’)以凸顯長度差異的片斷，并在親本與雜交子代群體中擴(kuò)+
>曰oITS2-F和ITS2-R為擴(kuò)增ITS2目的片段的引物對(duì)，其中的F代表正向引物(或上游引物)，R代表反向引物(或下游引物)。第三步，分別以南方鲇、鲇及其雜交樣本的總DNA為模板，在ITS2分子標(biāo)記專用引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。使用弓丨物對(duì)ITS2-F( SEQID NO: 3)(5’ -AACTCTTAGCGGTGGATCACTCGG-3’)和 ITS2-R(SEQID N0:4)(5’- CGTGGAAAGGCGGCGGAGAT -3’)，在親本與雜交子代群體中 PCR 擴(kuò)增 ITS2基因穩(wěn)定片段。將各組分按以下順序在0.2 ml的PCR管中混合(反應(yīng)體系為50 ML):
①超純水35.6 ML
②Taq 酶 IOX buffer5 ML
③MgCl2 (I. 5 mM)5 ML
④dNTPs (2. 5 mM)I ML
⑤引物ITS2-F (25 pM)I ML
⑥引物ITS2-R (25 pM)I ML
⑦模板DNA (約 100 ng)I ML
⑧Taq DNA 聚合酶(2. 5 U U L-1) 0. 4 ML 擴(kuò)增步驟為
①94。C預(yù)變性5 min
②94。C變性30 s
③59° C退火35 s
④72° C延伸30 s
⑤重復(fù)步驟②-④34次
⑥72° C充分延伸7 min第四步，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。制備2 %的瓊脂糖凝膠，并將5 ML PCR產(chǎn)物加入點(diǎn)樣緩沖液并混勻后上樣電泳。恒壓100 V電泳40 min，電泳后使用UV凝膠成像系統(tǒng)顯現(xiàn)目的條帶，依據(jù)電泳膠圖進(jìn)行種間長度差異分析和雜種鑒定。本發(fā)明的瓊脂凝膠制備方法如下
I %的瓊脂糖凝膠的制備方法
用天平稱取0.3 g瓊脂糖，倒入30 ml的I XTAE緩沖液中，搖勻后置于微波爐中加熱至完全溶解，取出待稍涼后(防止高溫使EB揮發(fā))JPAEB 2 ML。將制膠板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入樣品梳子。將之前配制的瓊脂糖凝膠倒入制膠板內(nèi)槽。冷卻半 小時(shí)待凝膠凝固后取出梳子，將凝膠放入電泳槽(Bio-Rad公司)內(nèi)并加入IXTAE電泳緩沖液使其浸沒凝膠。在點(diǎn)樣板上點(diǎn)上1/6體積的點(diǎn)樣緩沖液(溴酚藍(lán))。2 %的瓊脂糖凝膠的制備方法
用天平稱取0.6 g瓊脂糖，倒入30 ml的I XTAE緩沖液中，搖勻后置于微波爐中加熱至完全溶解，取出待稍涼后(防止高溫使EB揮發(fā))JPAEB 2 ML。將制膠板(Bio-Rad公司)放置于水平位置，然后插入樣品梳子。將之前配制的瓊脂糖凝膠倒入制膠板內(nèi)槽。冷卻半小時(shí)待凝膠凝固后取出梳子，將凝膠放入電泳槽(Bio-Rad公司)內(nèi)并加入IXTAE電泳緩沖液使其浸沒凝膠。在點(diǎn)樣板上點(diǎn)上1/6體積的點(diǎn)樣緩沖液(溴酚藍(lán))。本發(fā)明使用的主要儀器如下
PCR 儀Bio-Rad iCycIer 和 MJ100離心機(jī)Eppendorf Centrifuge 5415D
穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀BI0-RAD power PAC 300
凝膠成像系統(tǒng)Alphalmage Multimage Light Cabinet
電子天平、培養(yǎng)箱、蒸汽滅菌器、搖床以及一些常用的實(shí)驗(yàn)設(shè)備。上述實(shí)施例結(jié)果顯示南方鲇的ITS2基因片段在GenBank中未見報(bào)道，如圖I的基因條帶圖所示，雜交子代鲇同時(shí)出現(xiàn)南方鲇和鲇的兩條基因條帶，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證分別與2種親本序列一致。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的ITS2分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于應(yīng)用PCR擴(kuò)增后的南方鲇的ITS2基因片段和鲇的ITS2基因片段的長度差異，鑒定南方鲇、鲇及其雜交子代。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的ITS2分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于所述的南方鲇的ITS2基因片段的核苷酸序列(SEQID NO: I)為 CTCGTGCGTC GATGAAGAAC GCAGCCAGCT GCGAGAACTA ATGTGAATTG CAGGACACATTGATCATCGA CACTTCGAAC GCACATTGCG GCCCCGGGTC CCTCCCGGGG CTACGCCTGT CTGAGGGTCGCTATTTCCAT CGATCGGGAA AAAAACGAAC CATACGCACG CGACTGGAAG CTCGCAGGCC GTCATCGGCCTTCGTCCTCC TAAAAGCAGA CGCTCTCTTT TTTCGTGTCG。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的ITS2分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于所述的鲇的ITS2基因片段的核苷酸序列(SEQID NO: 2)為 CTCGTGCGTC GATGAAGAAC GCAGCCAGCT GCGAGAACTA ATGTGAATTG CAGGACACATTGATCATCGA CACTTCGAAC GCACATTGCG GCCCCGGGTC CCTCCCGGGG CTACGCCTGT CTGAGGGTCGCTATTTCCAT CGATCGGGAA AAAAACGAAC GCGACTGGAA GCTCGCAGGC CGTCATCGGC CTTCGTCCTCCTAAAAGCAG ACGCTCTCTT TTTTCGTGTC G。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的ITS2分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于包括以下步驟 A分別取南方鲇、鲇及其雜交樣本，提取基因組DNA; B分別以南方鲇、鲇及其雜交樣本的總DNA為模板，在ITS2基因片段特定引物的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增； C電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢測(cè)，在一個(gè)泳道上同時(shí)出現(xiàn)南方鲇和鲇的兩條基因條帶，則是南方鲇和鲇的雜交種。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的ITS2分子標(biāo)記鑒定方法，其特征在于所述的ITS2基因片段特定引物的堿基序列為 正向引物(SEQID NO:3) 5’ 一AACTCTTAGCGGTGGATCACTCGG—3’ ； 反向引物(SEQID NO:4) 5’ -CGTGGAAAGGCGGCGGAGAT-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖鲇魚雜種的ITS2分子標(biāo)記鑒定方法。本發(fā)明以南方鲇、鲇及其雜交子代作為研究對(duì)象，在鲇屬魚類中篩選設(shè)計(jì)了ITS2基因片段作為分子標(biāo)記，應(yīng)用所擴(kuò)ITS2基因片段在南方鲇和鲇中的長度差異，成功鑒定了南方鲇、鲇及其雜交子代。具有實(shí)驗(yàn)快捷，操作簡(jiǎn)便，鑒定直觀，無需測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102758022SQ20121027837
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者劉匆, 孫家賢, 宋昭彬, 應(yīng)汝華, 盛曉灑, 郭睿, 陳齊勇, 龔麗 申請(qǐng)人:通威股份有限公司