專利名稱：一種cd14真核表達載體的構(gòu)建及其高表達細胞株的制備的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種真核表達載體的構(gòu)建及其利用該載體制備穩(wěn)定表達細胞株。具體而言，本發(fā)明將⑶14全長基因克隆至帶有熒光蛋白標簽的PCDNA3. I-EGFP真核表達載體中，并用構(gòu)建的真核表達載體轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞，建立CD14穩(wěn)定過表達的胃癌細胞系O
背景技術：
胃癌對人類的健康構(gòu)成了很大的威脅，胃癌在各類腫瘤引起的死亡中位居第二，又因其同時具有高發(fā)性和普遍性的特點所以受到國內(nèi)外的廣泛關注。胃癌的發(fā)生是一個復 雜的過程，包含著多個因素多個基因的相互作用，其中某些原癌基因的激活以及抑癌基因的失活突變是細胞增殖失控并癌變的主要原因。 隨著研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)致病菌感染是引起某些基因的異常表達并引發(fā)胃癌的根源。幽門螺桿菌OLpylori)是胃癌及胃黏膜相關淋巴瘤的第一類致癌原，也是危害人類健康的重要病原體之一。Bhasin DK等[Bhasin DK, Kakkar N, Sharma BC etal. Helicobacter pylori in gastric cancer in India. Trop Gactroenterol. 1999，20(2) :70-72]發(fā)現(xiàn)在接受組織學檢查的胃癌患者中有1/3存在著Hp感染。在癌前病變胃粘膜中，Hp感染者的c-met表達明顯高于未感染者,且c_met的表達隨著病變的進展而增強，表明Hp的感染增加了胃粘膜的損傷程度和敏感性。幽門螺桿菌為微需氧革蘭氏染色陰性菌，脂多糖(LPS)是其主要毒性物質(zhì)，LPS通過與體內(nèi)多種蛋白的結(jié)合而引發(fā)一系列的炎性反應。CD14是富含亮氨酸重復序列的一種糖蛋白，為細菌脂多糖(LPS)的高親和性受體，主要表達于外周血的單核細胞和組織中的巨噬細胞膜上，可識別革蘭氏陰性菌、真菌、結(jié)核菌、梅毒螺旋體菌體成分以及與葡萄球菌腸毒素等細菌產(chǎn)物結(jié)合，CD14介導機體對LPS的識別及結(jié)合，在TLR的配合下將信號傳遞到細胞內(nèi)，激活NF-kB進一步誘導一系列細胞因子的表達，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應。CD14的表達受LPS及其下游炎性細胞因子的調(diào)節(jié)，并且具有劑量依賴性。另外CD14還可通過細胞內(nèi)的傳導通路引起某些癌基因的活化，對細胞生長、分化、癌細胞產(chǎn)生具有推動作用。⑶14單克隆抗體處理過的單核-巨噬細胞受LPS刺激而被激活的能力明顯降低，表明了⑶14在宿主細胞中識別LPS及級聯(lián)反應中的重要作用。近年來，⑶14因在病菌感染及介導炎性反應中的重要作用而受到廣泛關注。CD14與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系在國內(nèi)外已有報道，Tshela等發(fā)現(xiàn)⑶14高表達的男性中患前列腺癌的風險較高。Martina Seiffert等發(fā)現(xiàn)CD14是一種新型的單核細胞衍生的慢性淋巴細胞性白血病細胞的生存因子，由白血病細胞誘導，在體內(nèi)異常高表達，⑶14的rs4914CG基因型多態(tài)性與罹患大腸癌高風險性密切相。Christoph L.等推測，⑶14的水平可能影響體內(nèi)TLR輔助調(diào)節(jié)效應,從而影響某些抗癌療法或抗病毒反應。胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，Zhao等發(fā)現(xiàn)⑶14基因-260CT和-260TT多態(tài)性會增加胃癌的風險，說明CD14與胃癌發(fā)生存在關聯(lián)。本發(fā)明將⑶14全長基因克隆至帶有熒光蛋白標簽的pcDNA3. I-EGFP真核表達載體中，經(jīng)雙酶切及測序鑒定所構(gòu)建的pcDNA3. I-EGFP-⑶14重組子含有完整及正確的⑶14基因。用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞，建立⑶14穩(wěn)定過表達的胃癌細胞系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)GenBank中⑶14的mRNA序列(NM_000591)，設計包括整個⑶14編碼區(qū)的上、下游引物，上游引物Fl的序列見序列表SEQ NO. 1，F(xiàn)l的5’端引入HindIII酶切位點，下游引物Rl的序列見SEQ NO. 2,Rl的5，引入BamHI酶切位點，擴增長度為1153bp。同時設計用于細胞轉(zhuǎn)染后RT-PCR鑒定的⑶14片段擴增引物F2其序列見序列表SEQ NO. 3，R2序列見序列表SEQ NO. 4，內(nèi)參引物β -actin上游引物F3其序列見序列表SEQ NO. 5，下游引物R3的序列見序列表SEQ NO. 6。本發(fā)明構(gòu)建了⑶14真核表達載體，通過以下步驟制備表達⑶14的細胞總RNA的 提取、CD14編碼區(qū)的克隆、真核表達載體的構(gòu)建。I)表達⑶14的細胞總RNA的提取a)收集所培養(yǎng)的SGC-7901細胞加入Iml Trizol裂解液，室溫下靜置5min。b)加入200μ I三氯甲烷，充分混勻，室溫放置3min，12000rpm離心lOmin，取上清。c)加入500 μ I異丙醇混勻，室溫靜置IOmin, 12，OOOrpm離心lOmin。d)棄上清,加lml75%的乙醇漂洗，7500rpm離心5min。e)吸取75%的乙醇，于超凈臺晾干，直到EP管底部的RNA變透明，加入20μ1RNase-free ddH20，所得即為樣本總RNA。2)⑶14編碼區(qū)的克隆a)利用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒,將上一步得到的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應，在 200 μ I 反應管中加入總 RNAl μ g, oligo(dT)151y 1，random I μ 1，dNTP (2. 5mMeach) 2 μ I,加ddH20至14. 5 μ I,混勻后70°C加熱5min,冰上冷卻2min。瞬時離心后再加Λ 5XFirst-Strand Buffer4 μ l,RNasinO. 5μ I，TIANScript M-MLVl μ 1(200U)，總反應體積為20 μ 1，混勻后42°C溫浴50min，95°C加熱5min終止反應。b)取1μ I反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加入上述⑶14編碼區(qū)上下游引物各1μ l，2XTaqPCRMaster Mix210 μ 1，用 ddH20 補足 20 μ I。PCR 反應程序為95°C 5min ；95°C 20s,60°C20s, 72°C 30s，30個循環(huán)；72°C 5min結(jié)束反應。將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化，得到⑶14編碼區(qū)DNA。3)⑶14真核表達載體的構(gòu)建用HindIII和BamHI雙酶切pcDNA3. I-EGFP質(zhì)粒DNA及純化的CD14編碼區(qū)DNA，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化目的片段，加入T4 DNA ligase，16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到克隆菌中如大腸桿菌DH5a感受態(tài)。挑取單克隆置于LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并將切下目的條帶的質(zhì)粒送測序公司進行測序。本發(fā)明通過將上述得到的pcDNA3. 1-EGFP-CD14真核表達載體轉(zhuǎn)入SGC-7901細胞中，得到穩(wěn)定表達CD14的細胞株，轉(zhuǎn)染條件及穩(wěn)定細胞株的篩選和鑒定方法如下
I、細胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的篩選I)在轉(zhuǎn)染前撤除培養(yǎng)基中的抗生素，將處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種至6孔板中培養(yǎng)24h，待細胞長至80% -90%融合時進行轉(zhuǎn)染。2)采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，使用前輕輕混合LipofectamineTM2000，取8ul試劑用400ul無血清培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后在室溫下孵育5分鐘。3)孵育 5 分鐘后，取 pcDNA3. I-EGFP 空質(zhì)粒和 pcDNA3. 1-EGFP-CD14 各 20ug，分別與稀釋的LipOfectamineTM2000，輕輕混合，在室溫下孵育20分鐘，以便允許復合物的形成。
4)將質(zhì)粒-LipofectamineTM2000復合物加入到每一個包含SGC-7901細胞和培養(yǎng)基的孔中。通過輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合。5) 37 °C，CO2培養(yǎng)箱孵育4小時改換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白瞬時表達情況。6)用胰酶消化陽性細胞并傳代，在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中加入800 μ g/ml的G418進行培養(yǎng)，2周后將G418濃度降低為400 μ g/ml維持篩選。用含400 μ g/ml G418的選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)4周后，分離陽性克隆并擴大培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達CD14的SGC-7901 細胞株 LI。2、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中⑶14的表達鑒定收集細胞株LI、同時以未轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞、pcDNA3. I-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞為對照，提取上述細胞的總RNA及蛋白質(zhì)。從mRNA水平檢測⑶14的表達將上述得到的細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，通過弓I物F2和R2擴增⑶14mRNA，通過引物F3和R3擴增內(nèi)參β-actin，采用RT-PCR檢測上述細胞⑶14mRNA的表達，并將擴增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像后進行灰度分析。 從蛋白水平檢測⑶14的表達將上述提取的細胞蛋白質(zhì)，定量后做WesternBlot，凝膠成像后進行灰度分析。本發(fā)明所述的引物Fl和Rl在制備檢測人CD14基因試劑盒中的應用。本發(fā)明所述的pcDNA3. 1-EGFP-⑶14真核表達載體和穩(wěn)定表達⑶14的細胞株在制備人CD14蛋白中的應用。


圖I⑶14全長擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2⑶14重組載體和空載體酶切瓊脂糖酶切電泳圖，A pcDNA3. I-EGFP質(zhì)粒DNA，B :重組質(zhì)粒的單酶切產(chǎn)物，C :重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物。圖3轉(zhuǎn)染細胞顯微鏡下觀察結(jié)果，A :轉(zhuǎn)染48h的倒置顯微鏡下觀察結(jié)果；B :轉(zhuǎn)染48h的熒光顯微鏡下觀察結(jié)果；C :穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的倒置顯微鏡下觀察結(jié)果；D :穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞的熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。圖4穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中⑶14mRNA的表達，M =Marker ；C :未轉(zhuǎn)染組；N :空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；T :重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。圖5穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中⑶14蛋白的表達，C :未轉(zhuǎn)染組；N :空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組；T :重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。實施例I 一種⑶14基因的特異性引物的設計
根據(jù)GenBank中⑶14的mRNA序列(NM_000591)，設計包括整個⑶14編碼區(qū)的上、下游引物，上游引物Fl的序列見序列表SEQ NO. 1,F1的5’端引入HindIII酶切位點，下游引物Rl的序列見SEQ NO. 2，Rl的5，引入BamHI酶切位點，擴增長度為1153bp。同時設計用于細胞轉(zhuǎn)染后RT-PCR鑒定的⑶14片段擴增引物F2其序列見序列表SEQ NO. 3，R2序列見序列表SEQ NO. 4，內(nèi)參引物β-actin上游引物F3其序列見序列表SEQ NO. 5，下游引物R3的序列見序列表SEQ NO. 6。擴增長度分別為170bp和200bp。實施例2⑶14真核表達載體的構(gòu)建I材料與方法I. I 材料
大腸桿菌DH5 α、胃癌細胞系SGC-7901、pcDNA3. I-EGFP真核表達載體；總RNA提取試劑盒；TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒；2XTaq PCR Master Mix購自天根生化科技有限公司；pMD19-T載體購自大連寶生物工程有限公司；HindIII和BamHI內(nèi)切酶購自NEB 公司；脂質(zhì)體 Lipofectamine2000、G418 和購自 Invitrogen 公司；RPMI1640、胎牛血清(FBs)購自GibcoBRL公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純。I. 2 方法I. 2. I胃癌細胞系SGC-7901總RNA的提取收集所培養(yǎng)的SGC-7901細胞加入Iml RZ裂解液，室溫下靜置5min。加入200 μ I氯仿，充分混勻，室溫放置3min, 12000rpm離心lOmin,取上清。加入O. 5倍體積無水乙醇，混勻并轉(zhuǎn)移至吸附柱CR3中，12，OOOrpm離心30s。加入500 μ I去蛋白液RD，12000rpm離心30s。加入500 μ I漂洗液RW，室溫靜置2min，12000rpm離心30s。將吸附柱轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，干燥后加入40 μ I RNase-free ddH20,室溫放置2min, 12，OOOrpm離心2min,所得即為樣本總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，紫外分光光度計測量其A260和A280值，計算RNA濃度及純度。I. 2. 2 反轉(zhuǎn)錄及 RT-PCR利用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄反應，在200 μ I反應管中加入總 RNAl μ g, oligo (dT) I μ I,randoml μ I, dNTP (2. 5mM each) 2 μ I,加 ddH20 至 14. 5 μ 1，混勻后70°C加熱5min,冰上冷卻2min。瞬時離心后再加入5XFirst-Strand Buffer4 μ I,RNasinO. 5μ I, TIANScript M-MLVl μ I (200 U)，總反應體積為 20 μ 1，混勻后 42 °C 溫浴50min，95°C加熱5min終止反應。取1μ I反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入上下游引物Fl和Rl各1μ 1，2XTaq PCR Master Mix 10 μ 1，用 ddH20 補足 20 μ I。PCR 反應程序為95°C 5min ；95°C20s, 60°C 20s, 72°C 30s，30個循環(huán)；72°C 5min結(jié)束反應。將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化。I. 2. 3真核表達載體的構(gòu)建用HindIII 和 BamHI 雙酶切 pcDNA3. I-EGFP 質(zhì)粒 DNA 及純化的 CD14 PCR 產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化目的片段，加入T4 DNA ligase，16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，挑取陽性克隆進行酶切鑒定并委托生工生物工程(上海)有限公司進行測序。2 結(jié)果2. I 總 RNA 的提取及 RT-PCR
瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果得到18s和28s兩條清晰明亮的普帶，表明RNA沒有發(fā)生降解。紫外分光光度計檢測A260與A280的比值均在I. 9-2. I之間，表明所提取RNA純度較高基本沒有DNA及蛋白質(zhì)污染。利用CD14全長擴增引物Fl和Rl擴增出的CD14片段大小約llOObp，普帶清晰明亮，電泳圖見圖I。2. 2 重組載體 pcDNA3. 1-EGFP-CD14 的鑒定將兩端帶有HindIII和BamHI酶切位點的⑶14 PCR產(chǎn)物進行雙酶切，并插入pcDNA3. I-EGFP空載體中，⑶14酶切產(chǎn)物與pcDNA3. I-EGFP空載酶切產(chǎn)物的摩爾比為5 1，通過T4DNAligase將兩片段連接，16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌后挑取陽性克隆提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，結(jié)果見圖2，切出約IlOObp的⑶14片段和6000bp左右的pcDNA3. I-EGFP載體片段，與預期結(jié)果一致。測序結(jié)果同樣表明該重組質(zhì)粒含有完整的⑶14基因序列。實施例3I材料與方法I. I 材料胃癌細胞系SGC-7901、pcDNA3. I-EGFP真核表達載體、重組載體pcDNA3. 1-EGFP-CD14 ;總 RNA 提取試劑盒 TIAN Script cDNA 第一鏈合成試劑盒；2XTaqPCR Master Mix購自天根生化科技有限公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000、G418購自Invitrogen公司；RPMI1640、胎牛血清(FBs)等購自GibcoBRL公司。其他試劑為國產(chǎn)分析純，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。I. 2 方法I. 2. I細胞轉(zhuǎn)染及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的篩選I)在轉(zhuǎn)染前撤除培養(yǎng)基中的抗生素，將處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種至6孔板中培養(yǎng)24h，待細胞長至80% -90%融合時進行轉(zhuǎn)染。2)采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，使用前輕輕混合LipofectamineTM2000，取8ul試劑用400ul無血清培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后在室溫下孵育5分鐘。3)孵育 5 分鐘后，取 pcDNA3. I-EGFP 空質(zhì)粒和 pcDNA3. 1-EGFP-CD14 各 20ug，分別與稀釋的LipOfectamineTM2000，輕輕混合，在室溫下孵育20分鐘，以便允許復合物的形成。4)將質(zhì)粒-LipofectamineTM2000復合物加入到每一個包含SGC-7901細胞和培養(yǎng)基的孔中。通過輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合。5) 37 °C，CO2培養(yǎng)箱孵育4小時改換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白瞬時表達情況。6)用胰酶消化陽性細胞并傳代，在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中加入800 μ g/ml的G418進行培養(yǎng)，2周后將G418濃度降低為400 μ g/ml維持篩選。用含400 μ g/ml G418的選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)4 周后,分離陽性克隆并擴大培養(yǎng)。I. 2. 2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中⑶14的表達鑒定收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞，同時以未轉(zhuǎn)染細胞，pcDNA3. I-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞為對照，提取總RNA及蛋白質(zhì)。以β-actin為內(nèi)參，采用RT-PCR檢測CDHmRNA的表達，WesternBlot檢測⑶14蛋白的表達，凝膠成像后進行灰度分析。2 結(jié)果
2. I穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系的檢測⑶14轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞48h后，置于熒光顯微鏡下觀察即可見發(fā)出綠色熒光的細胞(圖3B)，表明所構(gòu)建的重組載體中的綠色熒光蛋白得到了表達，同時表明CD14基因也得到了瞬時表達。經(jīng)含G418培養(yǎng)基抗性篩選的SGC-7901-⑶14細胞系在熒光顯微鏡下可觀察到很強的熒光表達，在暗視野下呈現(xiàn)均勻的綠色(圖3D)，熒光表達率為100%，證明已經(jīng)得到了 CD14高表達的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。2. 2穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中⑶14的表達利用上述設計的檢測⑶14表達的引物F2和R2，采用RT-PCR的方法，檢測未轉(zhuǎn)染細胞、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞和重組pcDNA3. I-EGFP-⑶14質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞中β-actin內(nèi)參以及CD14 mRNA的表達，瓊脂糖凝膠電泳表明三個樣本的內(nèi)參表達差異不大，且都有CD14的表達(圖4)。對電泳圖片進行灰度分析，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞株⑶14的相對表達量是未轉(zhuǎn)染細胞的2. 61倍。Western Blot檢測結(jié)果三個樣本在55kDa左右處都有⑶14的表達 (圖5)，灰度分析表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞株⑶14蛋白的相對表達量是未轉(zhuǎn)染細胞的1.88倍。表明⑶14基因已成功轉(zhuǎn)染入SGC-7901細胞且得到了較高的表達。
權(quán)利要求
1.一種CD14基因的特異性引物對，其序列為SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2。
2.⑶14真核表達載體制備方法，其通過如下步驟制備，表達⑶14的細胞總RNA的提取、⑶14編碼區(qū)的克隆、真核表達載體的構(gòu)建。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的CD14真核表達載體制備方法，其特征在于，所述的表達CD14的細胞總RNA的提取、CD14編碼區(qū)的克隆、真核表達載體的構(gòu)建， 具體方法如下 1)表達⑶14的細胞總RNA的提取 a)收集所培養(yǎng)的SGC-7901細胞加入ImlTrizol裂解液，室溫下靜置5min。
b)加入200μ I三氯甲烷，充分混勻，室溫放置3min，12000rpm離心lOmin，取上清。
c)加入500μ I異丙醇混勻，室溫靜置IOmin, 12，OOOrpm離心IOmin0 d)棄上清，加1111175%的乙醇漂洗,7500rpm離心5min。
e)吸取75%的乙醇，于超凈臺晾干，直到EP管底部的RNA變透明，加入20 μ IRNase-free ddH20，所得即為細胞總RNA。
2)CD14編碼區(qū)的克隆 a)利用TIANScriptcDNA第一鏈合成試劑盒，將上一步得到的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應，在 200μ I 反應管中加入總 RNAl μ g, oligo(dT) I μ 1，randoml μ 1，dNTP(2. 5mMeach) 2 μ I,加ddH20至14. 5 μ I,混勻后70°C加熱5min,冰上冷卻2min。瞬時離心后再加Λ 5XFirst-Strand Buffer 4 μ 1，RNasinO. 5μ 1，TIANScript M-MLVl μ 1(200U)，總反應體積為20 μ 1，混勻后42°C溫浴50min，95°C加熱5min終止反應。
b)取Iμ I反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加入上述權(quán)利要求I所述的引物對各I μ I, 2XTaqPCR MasterMixlO μ 1，用 ddH20#M20y I。PCR 反應程序為95°C 5min ；95°C 20s, 60°C 20s, 72°C 30s,30個循環(huán)；72°C 5min結(jié)束反應。將產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化，得到CD14編碼區(qū)DNA。
3)⑶14真核表達載體的構(gòu)建 用HindIII和BamHI雙酶切pcDNA3. I-EGFP質(zhì)粒DNA及純化的CD14編碼區(qū)DNA，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收并純化目的片段，加入T4DNAligase，16°C連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞中。挑取單克隆置于培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進行酶切鑒定，并將切下目的條帶的質(zhì)粒送測序公司進行測序。
4.一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的方法,包括將權(quán)利要求2-3任意一項所述的CD14真核表達載體轉(zhuǎn)染、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的篩選、穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中CD14的表達鑒定。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的方法，具體包括以下步驟 I)將權(quán)利要求2-3任意一項所述的CD14真核表達載體轉(zhuǎn)染 a)在轉(zhuǎn)染前撤除培養(yǎng)基中的抗生素，將處于對數(shù)生長期的SGC-7901細胞接種至6孔板中培養(yǎng)24h，待細胞長至80% -90%融合時進行轉(zhuǎn)染。
b)采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染，使用前輕輕混合Lipofectamine 2000,取8ul試劑用400ul無血清培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后在室溫下孵育5分鐘。
c)孵育5分鐘后，取pcDNA3.I-EGFP空質(zhì)粒和權(quán)利要求2_3任意一項所述的⑶14真核表達載體轉(zhuǎn)染各20ug,分別與稀釋的Lipofectamine 2000,輕輕混合,在室溫下孵育20分鐘。d)將質(zhì)粒-Lipofectamine 2000復合物加入到包含SGC-7901細胞和培養(yǎng)基的孔中，通過輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合。
e)37°C,C02培養(yǎng)箱孵育4小時改換含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白瞬時表達情況。
2)穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的篩選 用胰酶消化陽性細胞并傳代，在10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中加入800 μ g/ml的G418進行培養(yǎng)，2周后將G418濃度降低為400 μ g/ml維持篩選。用含400 μ g/ml G418的選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)4周后，分離陽性克隆并擴大培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達CD14的SGC-7901細胞株。
3)穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中CD14的表達鑒定 a)從mRNA水平檢測⑶14的表達收集穩(wěn)定表達⑶14的SGC-7901細胞，同時以未轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞、pcDNA3. I-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞為對照，提取上述細胞的總RNA將上述得到的細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板，通過引物F2和R2擴增⑶14mRNA，通過引物F3和R3擴增內(nèi)參β -actin，采用RT-PCR檢測上述細胞⑶14mRNA的表達。
b)從蛋白水平檢測⑶14的表達收集穩(wěn)定表達⑶14的SGC-7901細胞，同時以未轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞、pcDNA3. I-EGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SGC-7901細胞為對照，提取上述細胞的蛋白質(zhì)，定量后做Western Blot，凝膠成像后進行灰度分析。
6.一種穩(wěn)定表達⑶14的SGC-7901細胞株，其由權(quán)利要求4或5制備得到。
7.權(quán)利要求I的引物在制備檢測人CD14基因試劑盒中的應用。
8.權(quán)利要求2-3任意一項所述的載體或權(quán)利要求6的細胞株在制備人CD14蛋白中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種真核表達載體的構(gòu)建及其利用該載體制備穩(wěn)定表達細胞株的方法。具體而言，本發(fā)明將CD14全長基因克隆至帶有熒光蛋白標簽的pcDNA3.1-EGFP真核表達載體中，并用構(gòu)建的真核表達載體轉(zhuǎn)染胃癌SGC-7901細胞，建立CD14穩(wěn)定過表達的胃癌細胞系。
文檔編號C12N15/66GK102757958SQ201210254929
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者旦增, 李康 申請人:西藏自治區(qū)人民醫(yī)院