專利名稱：psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體及構(gòu)建方法
psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體及構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及ー種利用ロ蹄疫病毒2A序列構(gòu)建草莓psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體及構(gòu)建方法。
背景技木類胡蘿卜素(Carotenoids)是自然界中廣泛存在的色素，是植物、細菌、真菌光合反應必不可缺的成分，在高等植物中，類胡蘿卜素主要存在于葉片的葉綠體以及許多花和果實的有色體中，使花和果實呈亮黃色、橙色或紅色。越來越多的醫(yī)學研究表明，除了不少類胡蘿卜素是維生素A的前體外，許多類胡蘿卜素在猝滅自由基、增強人體免疫力、預防心血管疾病和防癌抗癌等保護人類健康方面起著重要的作用。因此類胡蘿卜素既是決定水果、蔬菜內(nèi)在營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標，也是影響果實外觀品質(zhì)和花卉觀賞價值的重要因素，了解植物類胡蘿卜素積累的特點與代謝的生理機制，對于進一步調(diào)控植物類胡蘿卜素 的生物合成途徑，改善園藝植物的食用品質(zhì)和觀賞品質(zhì)具有重要的意義。八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase, PSY)、八氧番爺紅素去飽和酶(phytoene desaturase, PDS)和^ -胡蘿卜素脫氫酶((-carotene desaturase, ZDS)是類胡蘿卜素生物合成過程中關(guān)鍵酶。PSY是類胡蘿卜素生物合成過程中關(guān)鍵酶之一，它催化兩個櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)縮合形成八氫番爺紅素，八氫番爺紅素是整個類胡蘿卜素合成途徑中第一個類胡蘿卜素分子。由于PSY是植物中類胡蘿卜素生物合成的一個限速酶，所以由GGPP生成八氫番茄紅素這ー步驟已成為類胡蘿卜素代謝途徑的“瓶頸”，而其編碼的基因也成為應用基因工程技術(shù)改善植物類胡蘿卜素含量的首選目的基因。PDS和ZDS是植物類胡蘿卜素合成中去飽和的非常重要的ー類酶，參與線狀類胡蘿卜素生物合成。PDS催化八氫番茄紅素連續(xù)兩次脫氫生成胡蘿卜素，然后在ZDS催化下，胡蘿
卜素脫氫生成鏈孢紅素繼而進一步脫氫生成番茄紅素，PDS和ZDS都是類胡蘿卜素合成途徑中的重要限速酶。將外源基因?qū)酥参锘蚪M是植物分子生物學和遺傳工程的ー項基本技術(shù)。基因轉(zhuǎn)化首先必須構(gòu)建含有目的基因的植物表達載體，植物表達載體的構(gòu)建是ー個十分復雜的過程，要綜合考慮了目的基因的編碼區(qū)和植物表達載體的酶切位點及翻譯蛋白移碼問題基礎(chǔ)上，涉及到多次大分子重組，毎次重組過程又包括質(zhì)粒提取、酶切、回收、連接、轉(zhuǎn)化和篩選鑒定等工作。由于生物體內(nèi)的代謝途徑常常涉及多步反應，除了需要單個酶催化，更需要兩個或多個酶共同催化。因此將多基因轉(zhuǎn)化到同一植物中，就顯得很有必要了。多基因表達載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)化技術(shù)的誕生使多個目的基因?qū)胫参锘蚪M中并在植物中表達得以實現(xiàn)。多基因融表達載體策略是多個目的基因的DNA序列融合在一起,使其處于同一表達框內(nèi)，多個基因在同一個啟動子下轉(zhuǎn)錄成一個轉(zhuǎn)錄本，翻譯后得到ー個由不同的功能蛋白拼合在一起而形成的新型多結(jié)構(gòu)域的人工蛋白。在構(gòu)建多基因融合表達載體時，需要在不同的基因之間加入連接肽，以避免不同蛋白之間產(chǎn)生空間位阻，抑制其它蛋白的折疊或活性。如果是相互作用的兩個基因，空間位阻也會阻礙二者的結(jié)合，而加入連接肽則可以解決這個問題。ロ蹄疫病毒FMDV(Foot-and-mouth disease virus) 2A序列是目前比較常用的連接肽。FMDV 2A序列為20個氨基酸的多肽，其氨基酸序列為QLLNFDLLKLAGDVESNPGP，由2A連接的多基因，不需要任何蛋白酶的參與，便可在在第19個氨基酸(G)和第20個氨基酸(P)之間發(fā)生剪切，從而將多聚蛋白“切割”成不同的功能蛋白。通過2A序列融合多基因在ー個開放閱讀框下，可在共表達時發(fā)揮其各自基因的功能作用，目前已經(jīng)廣泛應用各類生物當中。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一，在于提供ー種psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體，通過psy、pds和Zds基因協(xié)同表達能夠提高草莓果實類胡蘿卜素含量，并為研究草莓類胡蘿卜素生物合成途徑中各種代謝酶的調(diào)控功能以及類胡蘿卜素積累特點和代謝機制奠定技術(shù)平臺。本發(fā)明是這樣解決的技術(shù)問題之一的ー種psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體,所述psy、pds和zds基因三價 融合植物表達載體的基因序列如SEQ ID NO. I所示。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之ニ,在于提供ー種psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體的構(gòu)建方法，大大提高了載體構(gòu)建成功的概率，節(jié)約構(gòu)建載體的時間，縮小工作量；通過psy、Pds和zds基因協(xié)同表達能夠提高草莓果實類胡蘿卜素含量。本發(fā)明是這樣解決的技術(shù)問題之ニ的ー種psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟步驟10、分別根據(jù)已克隆的草莓psy、pds、zds基因的cDNA全長序列，結(jié)合植物雙元表達載體PBI121載體上的酶切位點，設(shè)計3對含有不同酶切位點的引物；并利用這3對引物，以草莓總RNA為模版，通過RT-PCR法分別克隆草莓psy、pds和zds的開放閱讀框，連接到 pMD18_T simple 載體上，得到重組質(zhì)粒 pMD18_psy、pMD18_pds 和 pMD18_zds ；步驟20、設(shè)計合成一含有酶切位點和2個ロ蹄疫病毒2A序列的一序列a，所述序列a如SEQ ID NO. 2所示；步驟30、將序列a插入到植物雙元表達載體PBI121的Xba I和Sac I酶切位點之間,得到改造后的重組質(zhì)粒pB11212A ;步驟40、將重組質(zhì)粒pMD18_psy上的psy基因插入到重組質(zhì)粒pBI1212A的Xba I和BamH I酶切位點之間,得到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy ；步驟50、將重組質(zhì)粒pMD18_zds上的zds基因插入到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy的Bspl407 I和Kpn I酶切位點之間，經(jīng)PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定后，構(gòu)建成psy和zds基因ニ價融合植物表達載體pBI2A2Apsy_zds ；步驟60、將重組質(zhì)粒pMD18_pds上的pds基因插入到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy_zds的Sal I和Xho I酶切位點之間，經(jīng)PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定后，構(gòu)建成psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體pBI2A2Apsy-pds_zds。進ー步地，所述步驟30具體為利用經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I對植物雙元表達載體PBI121和序列a分別進行雙酶切，分別回收長度為190bp的序列a目的片段以及植物表達載體PBI121的線性大片段，并使用T4DNA連接酶進行連接，最后得到含有酶切位點和2個2A序列的重組質(zhì)粒pBI1212A。進ー步地,所述步驟40具體如下所述重組質(zhì)粒pMD18_psy經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaI和BamH I消化后，從中回收的長度為1194bp的psy基因片段，與經(jīng)Xba I和BamH I消化的重組質(zhì)粒PBI2A2A中回收的大片段基因經(jīng)T4DNA連接酶連接，再進行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，最后得到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy ；所述步驟50具體如下所述重組質(zhì)粒pMD18_zds經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bspl407 I和Kpn I消化后，將從中回收的1710bp的zds基因片段，與經(jīng)Bspl407 I和Kpn I消化的重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy中回收的大片段基因通過T4DNA連接酶連接，連接完成后再進行PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定，構(gòu)建成psy和zds基因ニ價融合植物表達載體，即重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy-zds；所述步驟60具體如下所述重組質(zhì)粒pMD18_pds經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal I和XhoI消化后，將從中回收的1704bp的pds基因片段，與經(jīng)Sal I和Xho I消化的重組質(zhì) 粒pBI2A2ApSy-zdS中回收的大片段基因通過T4DNA連接酶連接，連接完成后再進行PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定，最后構(gòu)建成psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體pBI2A2Apsy-pds-zdso進ー步地,步驟10中所述psy、pds、zds基因的三對引物及其對應酶切位點如下psy基因的PSYF引物的引物序列如SEQ ID NO. 3所示，其酶切位點為Xba I ；psy基因的PSYR引物的引物序列如SEQ ID NO. 4所示，其酶切位點為BamH I ；pds基因的I3DSF引物的引物序列如SEQ ID NO. 5所示，其酶切位點為Sal I ；pds基因的roSR引物的引物序列如SEQ ID NO. 6所示，其酶切位點為Xho I ；zds基因的ZDSF引物的引物序列如SEQ ID NO. 7所示，其酶切位點為Bspl407 I ；zds基因的ZDSR引物的引物序列如SEQ ID NO. 8所示，其酶切位點為Kpn I。進一步地,步驟20 中所述序列 a 含有 Xba I、Hae II、Sac II、BamH I、2A、SalI > Pvu I > Xho I、2A、Bspl407 I、Xma III、Kpn I、Sac I 酶切位點。本發(fā)明具有如下優(yōu)點本發(fā)明利用ロ蹄疫病毒2A序列將草莓psy、pds和zds基因融合在一起，即利用FMDV2A序列的特殊結(jié)構(gòu)構(gòu)建多價融合表達載體，融合蛋白能夠在2A的G和P氨基酸處發(fā)生正確、高效地切割分離，將融合蛋白“切割”成単獨的功能蛋白，并避免了融合基因中2個或3個基因由于空間的障礙而影響某個基因活性的可能。通過本發(fā)明構(gòu)建方法進行多價基因植物表達載體的構(gòu)建，大大提高了載體構(gòu)建成功的概率，節(jié)約構(gòu)建載體的時間，縮小工作量，后期可以通過多基因遺傳轉(zhuǎn)化，將多個目的基因一次性的導入受體植物中，可以同時改良品種的多個性狀，大大提高轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明為多價基因植物表達載體的構(gòu)建提供技術(shù)支持。本發(fā)明構(gòu)建的草莓psy、pds和zds基因雙價和三價植物表達載體,為通過psy、pds和zds基因協(xié)同表達提高草莓果實類胡蘿卜素含量、開展類胡蘿卜素品質(zhì)育種奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，并為進ー步研究草莓類胡蘿卜素生物合成途徑中各種代謝酶的調(diào)控功能以及類胡蘿卜素積累特點和代謝機制奠定技術(shù)平臺。


下面參照附圖結(jié)合實施例對本發(fā)明作進ー步的說明。圖I為本發(fā)明植物表達載體的構(gòu)建流程圖。圖2為本發(fā)明用于融合表達載體的psy、pds和zds基因克隆電泳圖。圖3為本發(fā)明中Xba I和Sac I酶切pMD18_2A2A電泳圖。圖4為本發(fā)明中Xba I和Sac I酶切pBI2A2A電泳圖。圖5為本發(fā)明中Xba I和BamH I酶切pBI2A2Apsy電泳圖。 圖6為本發(fā)明中Bspl407 I和Kpn I酶切pBI2A2Apsy-zds電泳圖。圖7為本發(fā)明中PCR檢測重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy_zds電泳圖。圖8 為本發(fā)明中 Sal I / Xho I 酶切 pBI2A2Apsy-pds_zds 電泳圖。圖9為本發(fā)明中PCR檢測重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy-pds_zds電泳圖。
具體實施方式—種psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體,所述psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體的基因序列如SEQ ID NO. I所示。重點參閱圖1，ー種psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體的構(gòu)建方法，所述構(gòu)建方法包括以下步驟步驟10、分別根據(jù)克隆的草莓果實類胡蘿卜素生物合成途徑重要基因psy、pds、zds的cDNA全長序列，結(jié)合植物雙元表達載體PBI121載體上的酶切位點，設(shè)計3對含有不同酶切位點的引物；并利用這3對引物，以草莓總RNA為模版，通過RT-PCR法分別克隆草莓psy、pds和zds的開放閱讀框,連接到pMD18_T simple載體上,得到重組質(zhì)粒pMD18_psy、pMD18-pds 和 pMD18_zds ；步驟20、設(shè)計合成一含有酶切位點和2個ロ蹄疫病毒2A序列的一序列a，所述序列a如SEQ ID NO. 2所示；步驟30、將序列a插入到植物雙元表達載體pBI121的Xba I和Sac I酶切位點之間,得到改造后的重組質(zhì)粒pB 11212A ;步驟40、將重組質(zhì)粒pMD18_psy上的psy基因插入到重組質(zhì)粒pBI1212A的Xba I和BamH I酶切位點之間,得到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy ；步驟50、將重組質(zhì)粒pMD18_zds上的zds基因插入到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy的Bspl407 I和Kpn I酶切位點之間，經(jīng)PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定后，構(gòu)建成psy和zds基因ニ價融合植物表達載體pBI2A2ApSy-zdS ；步驟60、將重組質(zhì)粒pMD18_pds上的pds基因插入到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy_zds的Sal I和Xho I酶切位點之間，經(jīng)PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定后，構(gòu)建成psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體pBI2A2Apsy-pds_zds。較優(yōu)的，所述步驟30具體為利用經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I對植物雙元表達載體PBI121和序列a分別進行雙酶切，分別回收長度為190bp的序列a目的片段以及植物表達載體PBI121的線性大片段，并使用T4DNA連接酶進行連接，最后得到含有酶切位點和2個2A序列的重組質(zhì)粒pBI1212A。較優(yōu)的,所述步驟40具體為所述重組質(zhì)粒pMD18_psy經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I消化后，從中回收的長度為1194bp的psy基因片段，與經(jīng)Xba I和BamH I消化的重組質(zhì)粒PBI2A2A中回收的大片段基因經(jīng)T4DNA連接酶連接，再進行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，最后得到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy ；所述步驟50具體為所述重組質(zhì)粒pMD18_zds經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bspl407 I和KpnI消化后，將從中回收的1710bp的zds基因片段，與經(jīng)Bspl407 I和Kpn I消化的重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy中回收的大片段基因通過T4DNA連接酶連接，連接完成后再進行PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定，構(gòu)建成Psy和zds基因ニ價融合植物表達載體，即重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy-zds ；所述步驟60具體為所述重組質(zhì)粒pMD18_pds經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal I和XhoI消化后，將從中回收的1704bp的pds基因片段，與經(jīng)Sal I和Xho I消化的重組質(zhì)粒pBI2A2ApSy-zdS中回收的大片段基因通過T4DNA連接酶連接，連接完成后再進行PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定，最后構(gòu)建成psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體pBI2A2Apsy-pds-zdso
較優(yōu)的，步驟10中所述psy、pds、zds基因的三對引物及其對應酶切位點如下psy基因的PSYF引物的引物序列如SEQ ID NO. 3所示，其酶切位點為Xba I ；psy基因的PSYR引物的引物序列如SEQ ID NO. 4所示，其酶切位點為BamH I ；pds基因的I3DSF引物的引物序列如SEQ ID NO. 5所示，其酶切位點為Sal I ；pds基因的roSR引物的引物序列如SEQ ID NO. 6所示，其酶切位點為Xho I ；zds基因的ZDSF引物的引物序列如SEQ ID NO. 7所示，其酶切位點為Bspl407 I ；zds基因的ZDSR引物的引物序列如SEQ ID NO. 8所示，其酶切位點為Kpn I。較優(yōu)的，步驟20 中所述序列 a 含有 Xba I、Hae II、Sac II、BamH I、2A、Sal I、Pvu I > Xho I、2A、Bspl407 I、Xma III、Kpn I、Sac I 酶切位點。以下結(jié)合實施例對本發(fā)明做進ー步的說明。實施例一用于融合表達載體的psy、pds和zds基因克隆重點參閱圖2，所述圖2中的A為psy的ORF ；B為pds的ORF ；C為zds的ORF ；M為 TaKaRa DL2000marker。用psy基因ORF引物進行PCR，PCR擴增體系為包含25ng模板cDNAl U L，0. 4 u mo I / L 弓丨物 liiL，0. 15mmol / L dNTP 5 u L, IU Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，I. 5mmol /L MgC12的IOXPCR緩沖液2. 5iiL，加入滅菌的超純水至25iiL。反應條件為94°C預變性3min ；94°C 30s, 54°C 60s, 72°C 40s, 35個循環(huán)；72°C延伸IOmin0擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，得到長度為1.2kp的片段，與預期擴增片段相符，將PCR產(chǎn)物連接到MD18-T simple載體上，經(jīng)PCR篩選獲得陽性克隆重組質(zhì)粒pMD18-pSy，將所獲得的陽性克隆重組質(zhì)粒pMD18-psy進行測序,測序結(jié)果表明與在GenBank庫中登錄號為FJ784889. I的psy基因序列同源性為100%，具有草莓psy基因完整的開放閱讀框，共1194個堿基，編碼398氨基酸。用pds基因ORF引物進行PCR，PCR擴增體系為包含25ng模板cDNAl u L，0. 4 u mo I / L 弓丨物 liiL，0. 15mmol / L dNTP 5 u L, IU Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，I. 5mmol /L MgCl2的10XPCR緩沖液2. 5 u L，加入滅菌的超純水至25 Uし反應條件為94°C預變性3min ；94°C 30s, 56°C 90s, 72°C 40s，35個循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測，得到長度為I. 7kp的片段，與預期擴增片段相符，將PCR產(chǎn)物連接到MD18-T simple載體上，經(jīng)PCR篩選獲得陽性克隆重組質(zhì)粒pMD18-pds，將所獲得的陽性克隆重組質(zhì)粒pMD18-pds進行測序，測序結(jié)果表明與在GenBank庫中登錄號為FJ795342. I的pds基因序列同源性為100%，具有草莓pds基因完整的開放閱讀框，共1704個堿基，編碼568氨基酸。用zds基因ORF引物進行PCR，PCR擴增體系為包含25ng模板cDNAl u L，
0.4 u mo I / L 引物 liiL，0. 15mmol / L dNTP5 u L, IU Taq DNA 聚合酶 0. 2 y L，I. 5mmol /L MgCl2的10XPCR緩沖液2. 5 u L，加入滅菌的超純水至25 Uし反應條件為94°C預變性3min ；94°C 30s, 55°C 90s, 72°C 40s，35 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。得到長度為 I. 7kp 的片段，與預期擴增片段相符，將PCR產(chǎn)物克隆到MD18-T simple載體上，經(jīng)PCR篩選獲得陽性克隆重組質(zhì)粒pMD18-zds，將所獲得的陽性克隆質(zhì)粒pMD18-zds進行測序，測序結(jié)果表明與在GenBank庫中登錄號為FJ795343. I的zds基因序列同源性為100%，具有草莓zds基因完整的開放閱讀框，共1710個堿基，編碼569氨基酸。實施例ニ 植物雙元表達載體PBI121改造及鑒定
重點參閱圖3，所述圖3中I為pMD18-2A2A用Xba I和Sac I進行雙酶切的電泳圖；M 為 TaKaRa DL5000 marker 含有2個ロ蹄疫病毒2A序列的載體PMD18-2A2A用限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I進行雙酶切鑒定，如圖3所示，切出了 190bp左右目的片段，回收后與經(jīng)Xba I和Sac I消化的植物雙元表達載體PBI121中回收的大片段經(jīng)連接，獲得改造后的重組質(zhì)粒PBI2A2A ；重點參閱圖4，所述圖4中I為pBI2A2A用Xba I和Sac I進行雙酶切的電泳圖；M 為 TaKaRa DL 10000 marker 將改造后的重組質(zhì)粒PBI2A2A進行PCR鑒定后用Xba I和Sac I進行雙酶切，并切下190bp左右目的片段，測序結(jié)果說明重組質(zhì)粒pBI2A2A構(gòu)建成功。實施例三草莓psy和zds ニ價融合植物表達載體的構(gòu)建及鑒定重點參閱圖5，所述圖5中A為pB 12A2Ap sy用Xba和BamH I進行雙酶切的電泳圖；M 為入-EcoT14 I digest。將重組質(zhì)粒pMD18_psy和pBI2A2A分別利用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I進行雙酶切，純化回收目的片段，利用T4DNA連接酶連接，經(jīng)PCR篩選后確認為陽性克隆質(zhì)粒，將該陽性克隆質(zhì)粒用Xba I和BamH I雙酶切鑒定，并切下I. 194kp目的片段，獲得含有psy基因的重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy。重點參閱圖6以及圖7，所述圖6中A為pBI2A2Apsy-zds用Bspl407 I和Kpn I進行雙酶切pBI2A2Apsy-zds的電泳圖;M為入_EcoT14 I digest ;所述圖7中I為用PSYF和 ZDSR 引物進行 PCR 鑒定 pBI2A2Apsy-zd 的電泳圖 s，M 為 TaKaRa DL10000 marke。將重組質(zhì)粒pMD18_zds和pBI2A2Apsy分別利用限制性內(nèi)切酶Bspl407 I和Kpn I進行雙酶切，純化回收目的片段，利用T4DNA連接酶連接，經(jīng)PCR篩選后確認為陽性克隆質(zhì)粒，將該陽性克隆質(zhì)粒用Bspl407 I和Kpn I雙酶切鑒定，并切下I. 71kp目的片段，再用PSYF和ZDSR引物進行PCR鑒定，如圖7所示，擴增出3. 054kp (含psy基因、2A和zds基因)的條帶，測序結(jié)果說明psy和zds ニ價融合植物表達載體pBI2A2Apsy_zds構(gòu)建成功。實施例四草莓psy、pds和zds三價融合植物表達載體的構(gòu)建及鑒定重點參閱圖8和圖9，所述圖8中I為pBI2A2Apsy-pds-zds用Sal I和Xho I進行雙酶切的電泳圖，M為入-EcoT14 I digest ;所述圖9中的I為用PSYF和ZDSR引物進行PCR 鑒定 pBI2A2Apsy-pds_zds 的電泳圖；]\1為 TaKaRa DLIOOOOmarker。
將重組質(zhì)粒pMD18_pds和pBI2A2Apsy-zds分別利用限制性內(nèi)切酶Sal I和Xho I進行雙酶切，純化回收目的片段，利用T4DNA連接酶連接，經(jīng)PCR篩選后確認為陽性克隆質(zhì)粒，將陽性克隆質(zhì)粒用Sal I和Xho I雙酶切鑒定，并切下I. 704kp目的片段，再用PSYF和ZDSR引物進行PCR鑒定，如圖8所示，擴增出4. 752kp (含psy基因、2A、psy基因、2A和zds基因)的條帶，測序結(jié)果說明psy、pds和zds三價融合植物表達載體pBI2A2Apsy-pds_zds構(gòu)建成功。本發(fā)明利用ロ蹄疫病毒2A序列將草莓psy、pds和zds基因融合在一起，即利用FMDV2A序列的特殊結(jié)構(gòu)構(gòu)建多價融合表達載體，融合蛋白能夠在2A的G和P氨基酸處發(fā)生正確、高效地切割分離，將融合蛋白“切割”成単獨的功能蛋白，并避免了融合基因中2個或3個基因由于空間的障礙而影響某個基因活性的可能。通過本發(fā)明構(gòu)建方法進行多價基因植物表達載體的構(gòu)建，大大提高了載體構(gòu)建成功的概率，節(jié)約構(gòu)建載體的時間，縮小工作量，后期可以通過多基因遺傳轉(zhuǎn)化，將多個目的基因一次性的導入受體植物中，可以同時改良品種的多個性狀，大大提高轉(zhuǎn)化效率。本發(fā)明為多價基因植物表達載體的構(gòu)建提供技術(shù)支持。
·
本發(fā)明構(gòu)建的草莓psy、pds和zds基因雙價和三價植物表達載體,通過psy、pds和zds基因協(xié)同表達能夠提高草莓果實類胡蘿卜素含量，并為進一歩研究草莓類胡蘿卜素生物合成途徑中各種代謝酶的調(diào)控功能以及類胡蘿卜素積累特點和代謝機制奠定技術(shù)平臺，為通過psy、pds和zds基因協(xié)同表達提高草莓果實類胡蘿卜素含量、開展類胡蘿卜素品質(zhì)育種奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。雖然以上描述了本發(fā)明的具體實施方式
，但是熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應當理解，我們所描述的具體的實施例只是說明性的，而不是用于對本發(fā)明的范圍的限定，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員在依照本發(fā)明的精神所作的等效的修飾以及變化，都應當涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求所保護的范圍內(nèi)。此外,本發(fā)明中所涉及的ー種psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體及構(gòu)建方法的核苷酸序列見所附的核苷酸或氨基酸序列表。
權(quán)利要求
1.ー種psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體,其特征在于所述psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體的基因序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體的構(gòu)建方法,其特征在于所述構(gòu)建方法包括以下步驟 步驟10、分別根據(jù)克隆的草莓果實類胡蘿卜素生物合成途徑重要基因psy、pds、zds的cDNA全長序列，結(jié)合植物雙元表達載體PBI121載體上的酶切位點，設(shè)計3對含有不同酶切位點的引物；并利用這3對引物，以草莓總RNA為模版，通過RT-PCR法分別克隆草莓psy、pds和zds的開放閱讀框,連接到pMD18_T simple載體上,得到重組質(zhì)粒pMD18_psy、pMD18-pds 和 pMD18_zds ； 步驟20、設(shè)計合成一含有酶切位點和2個ロ蹄疫病毒2A序列的一序列a，所述序列a如 SEQ ID NO. 2 所示； 步驟30、將序列a插入到植物雙元表達載體PBI121的Xba I和Sac I酶切位點之間，得到改造后的重組質(zhì)粒PBI1212A ; 步驟40、將重組質(zhì)粒pMD18_psy上的psy基因插入到重組質(zhì)粒pBI1212A的Xba I和BamH I酶切位點之間,得到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy ； 步驟50、將重組質(zhì)粒pMD18-zds上的zds基因插入到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy的Bspl407 I和Kpn I酶切位點之間，經(jīng)PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定后，構(gòu)建成psy和zds基因ニ價融合植物表達載體pBI2A2Apsy_zds ； 步驟60、將重組質(zhì)粒pMD18-pds上的pds基因插入到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy_zds的Sal I和Xho I酶切位點之間，經(jīng)PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定后，構(gòu)建成psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體pBI2A2Apsy-pds_zds。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體的構(gòu)建方法,其特征在于 所述步驟30具體為利用經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I和Sac I對植物雙元表達載體pBI 121和序列a分別進行雙酶切，分別回收長度為190bp的序列a目的片段以及植物表達載體PBI121的線性大片段，并使用T4DNA連接酶進行連接，最后得到含有酶切位點和2個2A序列的重組質(zhì)粒PBI1212A。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于 所述步驟40具體為所述重組質(zhì)粒pMD18-psy經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I消化后,從中回收的長度為1194bp的psy基因片段，與經(jīng)Xba I和BamH I消化的重組質(zhì)粒PBI2A2A中回收的大片段基因經(jīng)T4DNA連接酶連接，再進行限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，最后得到重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy ； 所述步驟50具體為所述重組質(zhì)粒pMD18-zds經(jīng)限制性內(nèi)切酶Bspl407 I和Kpn I消化后，將從中回收的1710bp的zds基因片段，與經(jīng)Bspl407 I和Kpn I消化的重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy中回收的大片段基因通過T4DNA連接酶連接，連接完成后再進行PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定，構(gòu)建成Psy和zds基因ニ價融合植物表達載體，即重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy-zds ； 所述步驟60具體為所述重組質(zhì)粒pMD18-pds經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sal I和Xho I消化后，將從中回收的1704bp的pds基因片段，與經(jīng)Sal I和Xho I消化的重組質(zhì)粒pBI2A2Apsy-zds中回收的大片段基因通過T4DNA連接酶連接，連接完成后再進行PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測序鑒定，最后構(gòu)建成psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體pBI2A2Apsy-pds-zdso
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體的構(gòu)建方法,其特征在于步驟10中所述psy、pds、zds基因的三對引物及其對應酶切位點如下 psy基因的PSYF引物的引物序列如SEQ ID NO. 3所示，其酶切位點為Xba I ;psy基因的PSYR引物的引物序列如SEQ ID NO. 4所示，其酶切位點為BamH I ； Pds基因的I3DSF引物的引物序列如SEQ ID NO. 5所示，其酶切位點為Sal I ;pds基因的I3DSR引物的引物序列如SEQ ID NO. 6所示，其酶切位點為Xho I ； zds基因的ZDSF引物的引物序列如SEQ ID NO. 7所示，其酶切位點為Bspl407 I ；zds基因的ZDSR引物的引物序列如SEQ ID NO. 8所示，其酶切位點為Kpn I。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體的構(gòu)建方法,其特征在于步驟20中所述序列a含有Xba I、Hae II、Sac II、BamH I、2A、Sal I、PvuI、Xho I、2A、Bspl407 I、Xma III、Kpn I ,Sac I 酶切位點。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種psy、pds和zds基因三價融合植物表達載體及構(gòu)建方法，本發(fā)明的植物表達載體的基因序列如SEQ ID NO.1所示；其構(gòu)建方法如下設(shè)計合成一序列a，所述序列a如SEQ ID NO.2所示，再將序列a插入到植物雙元表達載體pBI121的XbaⅠ和SacⅠ酶切位點之間，得到改造后的重組質(zhì)粒pBI1212A，分別將psy、pds、zds基因依次插入到重組質(zhì)粒pBI1212A，最后構(gòu)建成三價融合植物表達載體。本發(fā)明通過psy、pds和zds基因協(xié)同表達能夠提高草莓果實類胡蘿卜素含量，并為研究草莓類胡蘿卜素生物合成途徑中各種代謝酶的調(diào)控功能以及類胡蘿卜素積累特點和代謝機制奠定技術(shù)平臺。
文檔編號C12N15/66GK102776227SQ20121025497
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月20日 公開號201210254974.發(fā)明者朱海生, 溫慶放 申請人:福建省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所