專利名稱：一種用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及檢驗(yàn)微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
牙周炎是口腔中的常見病和多發(fā)病，屬于細(xì)菌感染性疾病。流行病學(xué)研究表明，牙銀口卜啉菌(Porphyromonas gingivalis, P. gingivalis)與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展顯著相關(guān),是牙周炎的優(yōu)勢致病菌。牙周炎發(fā)病后期引起的牙齦萎縮、牙槽骨喪失一般難以再生，因此，牙周炎的早期診斷、P. gingivalis的早期檢出至關(guān)重要。目前的P. gingivalis檢驗(yàn)手段主要是銀下菌斑采樣進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR),該種方法需要對樣本進(jìn)行DNA提取和PCR引物設(shè)計(jì)，且需要配備PCR相關(guān)儀器設(shè)備，成本昂貴，操作 復(fù)雜。微生物培養(yǎng)是一種用人工方法使微生物生長繁殖的技術(shù)，而選擇性培養(yǎng)基是用來促進(jìn)或抑制一定類型的生物體(如細(xì)胞或細(xì)菌等)而設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，利用這種培養(yǎng)基可以將所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。人類口腔中寄居著500多種細(xì)菌，其中定植在齦下的就有300多種，正是由于這種復(fù)雜的樣本環(huán)境，使得牙垢標(biāo)本P. gingivalis的培養(yǎng)分離率低，口腔主流菌群中的鏈球菌、表皮葡萄球菌、奈瑟氏菌、乳桿菌、螺旋體、假絲酵母在目前的培養(yǎng)基中比牙齦卟啉菌生長更快，很快覆蓋了培養(yǎng)基，牙齦卟啉菌無法生長
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠用于牙垢標(biāo)本的，對牙齦卟啉菌分離率高的培養(yǎng)基。本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是一種用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基，其特征在，配制IOOOml培養(yǎng)基的配方中含有麥芽浸粉15 30g ;雞蛋蛋白液15(T200ml ;濃度為5 mg/ml的氯化血紅素溶液2. 5 ml ;濃度為10mg/ml的維生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸櫞酸鎂O. I O. 4g ;瓊脂15 20g ;共殺素15 20mg ;泰利霉素8 12mg ;利奈唑胺5 IOmg ;天門冬素3. 6 g ;四水檸檬酸鈣O. 0Γ0. 2g ;蒸餾水加至1000ml。優(yōu)化方案中，每1000ml培養(yǎng)基還含有大蒜榨出汁0. 05、· 5g。優(yōu)化方案中，每1000ml培養(yǎng)基還含有L-半胱氨酸0. θΓθ. lg。優(yōu)化方案中，每1000ml培養(yǎng)基還含有濃度200g/L的黃精水煮液20(T300ml。最優(yōu)化方案中，每1000ml培養(yǎng)基還含有大蒜榨出汁0. 05、. 5g ;L_半胱氨酸
0.θΓθ. Ig ;濃度 200g/L 的黃精水煮液 20(T300ml。一種用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括以下步驟
(1)取黃精加水煮沸I小時(shí)，過濾，取濾液，調(diào)整體積到濃度為200g/L，得黃精水煮液；
(2)取去皮新鮮大蒜洗凈后，粉碎機(jī)榨汁并過濾，得大蒜榨出汁；
(3)取麥芽浸粉；雞蛋蛋白液；氯化血紅素溶液；維生素Kl乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂；共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；四水檸檬酸鈣；L_半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步驟I所得黃精水煮液中，混勻過濾后，蒸餾水定容，850C間歇滅菌2次，每次45 min,滅菌后分裝。其中所述的麥芽浸粉提供碳氮源和能量；枸櫞酸鎂和四水檸檬酸鈣為緩沖劑，并可以抑制雜菌生長；氯化血紅素和維生素Kl為營養(yǎng)劑；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑；共殺素可以抑制革蘭氏陽性菌蛋白質(zhì)的合成，對于廣泛耐藥的革蘭氏陽性菌也有效；泰利霉素對于奈瑟氏菌、乳桿菌、假絲酵母具有一定的抑菌作用；利奈唑胺對耐藥性金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、釀膿鏈球菌、溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌和腸球菌屬等均具有良好活性；天門冬素、L-半胱氨酸屬氨基酸類，為營養(yǎng)劑；雞蛋蛋白液含有各種多肽、脂肪、生長因子、激素等，這些物質(zhì)對促進(jìn)牙齦卟啉菌的繁殖和生長都是很重要的因素，此外雞蛋蛋白液還具有維持培養(yǎng)基PH值恒定的作用。大蒜榨出汁所含的蒜酶、過氧化酶、磷酸酯酶及水解酶等，有氧化和水解作用，可以致使牙垢標(biāo)本中的核梭桿菌、脆弱類桿菌胞壁消失或變薄，核糖體聚集成團(tuán)塊，最終導(dǎo)致細(xì)菌變形及破裂，達(dá)到抑制核梭桿菌、脆弱類桿菌的作用。黃精為百合科植物黃精、多花黃精和滇黃精的根莖，含有蔗糖、葡萄糖、葉酸、多種氨基酸等成分，可以提供能量代謝、細(xì)胞發(fā)育、新陳代謝因子，且水煮液對堇色毛癬菌、紅色表皮 癬菌、石膏樣毛癬菌、考夫曼-沃爾夫氏表皮癬菌、螺旋體、皰疹病毒均有抑制作用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有檢出可靠、牙齦卟啉菌分離率高的特點(diǎn)。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)際情況，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說明。實(shí)施例1，配制IOOOml培養(yǎng)基的配方中含有麥芽浸粉15g ;雞蛋蛋白液150ml ;濃度為5 mg/ml的氯化血紅素溶液2. 5ml ;濃度為10mg/ml的維生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸櫞酸鎂O. Ig ;瓊脂15g ;共殺素15mg ;泰利霉素8mg ;利奈唑胺IOmg ;天門冬素3. 6 g ;四水朽1fefef丐O. 2g ;蒸懼水加至1000ml。制備方法取麥牙浸粉；雞蛋蛋白液；氣化血紅素溶液；維生素Kl乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂；共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；四水檸檬酸鈣溶于蒸餾水中，混勻，蒸餾水定容至1000ml，85°C間歇滅菌2次，每次45 min，滅菌后分裝。實(shí)施例2，配制IOOOml培養(yǎng)基的配方中含有麥芽浸粉30g ;雞蛋蛋白液200ml ;濃度為5 mg/ml的氯化血紅素溶液2. 5ml ;濃度為10mg/ml的維生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸櫞酸鎂O. 4g ;瓊脂20g ;共殺素20mg ;泰利霉素12mg ;利奈唑胺5mg ;天門冬素3. 6 g ;四水檸檬酸鈣O. Olg ;蒸餾水加至1000ml。制備方法取麥芽浸粉；雞蛋蛋白液；氯化血紅素溶液；維生素Kl乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂；共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；四水檸檬酸鈣溶于蒸餾水中，混勻，蒸餾水定容至1000ml，85°C間歇滅菌2次，每次45 min，滅菌后分裝。實(shí)施例3，配制IOOOml培養(yǎng)基的配方中含有麥芽浸粉15g ;雞蛋蛋白液150ml ;濃度為5 mg/ml的氯化血紅素溶液2. 5ml ;濃度為10mg/ml的維生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸櫞酸鎂O. Ig ;瓊脂15g ;共殺素15mg ;泰利霉素8mg ;利奈唑胺IOmg ;天門冬素3. 6 g ;四水朽1檬酸鈣O. 2g ;大蒜榨出汁O. 05g, L-半胱氨酸O. Ig ;蒸餾水加至IOOOml。制備方法取去皮新鮮大蒜洗凈后，粉碎機(jī)榨汁并過濾，得大蒜榨出汁；取麥芽浸粉；雞蛋蛋白液；氯化血紅素溶液；維生素Kl乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂；共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；四水檸檬酸鈣；L-半胱氨酸；大蒜榨出汁溶于蒸餾水中，混勻，蒸餾水定容至1000ml，85°C間歇滅菌2次，每次45 min,滅菌后分裝。實(shí)施例4，配制IOOOml培養(yǎng)基的配方中含有麥芽浸粉30g ;雞蛋蛋白液200ml ;濃度為5 mg/ml的氯化血紅素溶液2. 5ml ;濃度為10mg/ml的維生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸櫞酸鎂O. 4g ;瓊脂20g ;共殺素20mg ;泰利霉素12mg ;利奈唑胺5mg ;天門冬素3. 6 g ;四水朽1檬酸I丐O. Olg,大蒜榨出汁O. 5g, L-半胱氨酸O. Olg ;蒸懼水加至1000ml。制備方法取去皮新鮮大蒜洗凈后，粉碎機(jī)榨汁并過濾，得大蒜榨出汁；取麥芽浸粉；雞蛋蛋白液；氯化血紅素溶液；維生素Kl乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂；共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；四水檸檬酸鈣；L-半胱氨酸；大蒜榨出汁溶于蒸餾水中，混勻，蒸餾水定容至1000ml，85°C間歇滅菌2次，每次45 min，滅菌后分裝。實(shí)施例5，配制IOOOml培養(yǎng)基的配方中含有麥芽浸粉25g ;雞蛋蛋白液170ml ;濃度為5 mg/ml的氯化血紅素溶液2. 5 ml ;濃度為10mg/ml的維生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸櫞酸鎂O. 3g ;瓊脂18g ;共殺素18mg ;泰利霉素IOmg ;利奈唑胺8mg ;天門冬素3. 6 g ;四水檸檬酸鈣O. Ig,大蒜榨出汁O. 3g，L-半胱氨酸O. 05g ;蒸餾水加至IOOOml。制備方法取去皮新鮮大蒜洗凈后，粉碎機(jī)榨汁并過濾，得大蒜榨出汁；取麥芽浸粉；雞蛋蛋白液；氯化血紅素溶液；維生素Kl乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂；共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；四水檸檬酸鈣；L-半胱氨酸；大蒜榨出汁溶于蒸餾水中，混勻，蒸餾水定容至1000ml，85°C間歇滅菌2次，每次45 min，滅菌后分裝。實(shí)施例6，配制IOOOml培養(yǎng)基的配方中含有麥芽浸粉15g ;雞蛋蛋白液150ml ;濃度為5 mg/ml的氯化血紅素溶液2. 5 ml ;濃度為10mg/ml的維生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸櫞酸鎂O. Ig ;瓊脂15g ;共殺素15mg ;泰利霉素8mg ;利奈唑胺IOmg ;天門冬素3. 6 g ;四水檸檬酸鈣O. 2g，大蒜榨出汁O. 05g，L-半胱氨酸O. lg，濃度200g/L的黃精水煮液200ml ;蒸餾水加至1000ml。制備方法
(1)取黃精加水煮沸I小時(shí)，過濾，取濾液，調(diào)整體積到濃度為200g/L，得黃精水煮液；
(2)取去皮新鮮大蒜洗凈后，粉碎機(jī)榨汁并過濾，得大蒜榨出汁；
(3)取麥芽浸粉；雞蛋蛋白液；氯化血紅素溶液；維生素Kl乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂；共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；四水檸檬酸鈣；L-半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步驟I所得黃精水煮液中，混勻過濾后，蒸餾水定容，850C間歇滅菌2次，每次45 min,滅菌后分裝。實(shí)施例7，配制IOOOml培養(yǎng)基的配方中含有麥芽浸粉30g ;雞蛋蛋白液200ml ;濃度為5 mg/ml的氯化血紅素溶液2. 5 ml ;濃度為10mg/ml的維生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸櫞酸鎂O. 4g ;瓊脂20g ;共殺素20mg ;泰利霉素12mg ;利奈唑胺5mg ;天門冬素3. 6 g ;四水檸檬酸鈣O. Olg，大蒜榨出汁O. 5g，L-半胱氨酸O. Olg，濃度200g/L的黃精水煮液300ml ；蒸懼水加至1000ml。制備方法
(1)取黃精加水煮沸I小時(shí)，過濾，取濾液，調(diào)整體積到濃度為200g/L，得黃精水煮液；
(2)取去皮新鮮大蒜洗凈后，粉碎機(jī)榨汁并過濾，得大蒜榨出汁；
(3)取麥芽浸粉；雞蛋蛋白液；氯化血紅素溶液；維生素Kl乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂； 共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；四水檸檬酸鈣；L_半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步驟I所得黃精水煮液中，混勻過濾后，蒸餾水定容，850C間歇滅菌2次，每次45 min,滅菌后分裝。實(shí)施例8，配制IOOOml培養(yǎng)基的配方中含有麥芽浸粉25g ;雞蛋蛋白液170ml ;濃度為5 mg/ml的氯化血紅素溶液2. 5 ml ;濃度為10mg/ml的維生素Kl乙醇溶液O. 5ml ;枸櫞酸鎂O. 3g ;瓊脂18g ;共殺素18mg ;泰利霉素IOmg ;利奈唑胺8mg ;天門冬素3. 6 g ;四水檸檬酸鈣O. lg，大蒜榨出汁O. 3g，L-半胱氨酸O. 05g，濃度200g/L的黃精水煮液250ml ;蒸餾水加至1000ml。制備方法
(1)取黃精加水煮沸I小時(shí)，過濾，取濾液，調(diào)整體積到濃度為200g/L，得黃精水煮液；
(2)取去皮新鮮大蒜洗凈后，粉碎機(jī)榨汁并過濾，得大蒜榨出汁；
(3)取麥芽浸粉；雞蛋蛋白液；氯化血紅素溶液；維生素Kl乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂；共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；四水檸檬酸鈣；L-半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步 驟I所得黃精水煮液中，混勻過濾后，蒸餾水定容，85°C間歇滅菌2次，每次45 min，滅菌后分裝。所述的黃精水煮液濃度為200g/L，指的是每升黃精水煮液中含有生藥200g。本發(fā)明所得牙齦卟啉菌培養(yǎng)基用于牙垢標(biāo)本具有檢出可靠、牙齦卟啉菌分離率高的特點(diǎn)，為臨床資料充分證明，有關(guān)資料如下。I對象與方法
I. I培養(yǎng)基制備共設(shè)4組，分別為實(shí)施例8方案組、實(shí)施例5方案組、實(shí)施例2方案組和對照組，對照組為巧克力瓊脂培養(yǎng)基。I. 2齦下菌斑采集培養(yǎng)方法隔濕唾液，齦上刮治器去除齦上牙石，碘酊消毒后，用無菌Gracey刮治器采集2顆下頜中切牙唇側(cè)近中至遠(yuǎn)中的齦下菌斑。將采集的菌斑懸浮于Iml生理鹽水，用接種環(huán)分區(qū)劃線接種，厭氧環(huán)境下37°C培養(yǎng)24h，挑取細(xì)小菌落進(jìn)行菌屬鑒定。I. 3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS 13. O進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P〈 O. 05表示有顯著性意義。2結(jié)果在84份經(jīng)由PCR確定牙齦卟啉菌陽性的牙垢標(biāo)本，細(xì)菌培養(yǎng)分離并鑒定為牙齦卟啉菌的，實(shí)施例8方案組為79例，實(shí)施例5方案組為78例，實(shí)施例2方案組為74例，對照組巧克力瓊脂培養(yǎng)基為24例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，本發(fā)明各實(shí)施例組與對照組比較具有明顯差異(P〈0. 001)。結(jié)果表明，本發(fā)明實(shí)施例牙齦卟啉菌分離率明顯高現(xiàn)有的培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.一種用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基，其特征在，配制IOOOml培養(yǎng)基的配方中含有 麥芽浸粉15 30g ； 雞蛋蛋白液15(T200ml ； 濃度為5 mg/ml的氯化血紅素溶液2. 5 ml ; 濃度為10mg/ml的維生素Kl乙醇溶液0. 5ml ； 枸櫞酸鎂0. I 0. 4g ； 瓊脂15 20g ； 共殺素15 20mg ； 泰利霉素8 12mg ； 利奈唑胺5 I Omg ； 天門冬素3. 6 g ; 四水檸檬酸鈣0. oro. 2g ； 蒸餾水加至1000ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基，其特征在于每IOOOml培養(yǎng)基還含有大蒜榨出汁0. 05、. 5g。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基，其特征在于每IOOOml培養(yǎng)基還含有L-半胱氨酸0. oro. lg。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基，其特征在于每IOOOrnl培養(yǎng)基還含有濃度200g/L的黃精水煮液20(T300ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基，其特征在于每IOOOrnl培養(yǎng)基還含有大蒜榨出汁0. 05、. 5g ；L-半胱氨酸0. Of 0. Ig ;濃度200g/L的黃精水煮液 20(T300ml。
6.一種制備權(quán)利要求5中所述用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)取黃精加水煮沸I小時(shí)，過濾，取濾液，調(diào)整體積到濃度為200g/L，得黃精水煮液； (2)取去皮新鮮大蒜洗凈后，粉碎機(jī)榨汁并過濾，得大蒜榨出汁； (3)取麥芽浸粉；雞蛋蛋白液；氯化血紅素溶液；維生素Kl乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂；共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；四水檸檬酸鈣；L-半胱氨酸及大蒜榨出汁溶于步驟I所得黃精水煮液中，混勻過濾后，蒸餾水定容，850C間歇滅菌2次，每次45 min,滅菌后分裝。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于牙垢標(biāo)本的牙齦卟啉菌培養(yǎng)基及其制備方法。其特征在于，配制1000ml培養(yǎng)基的配方中含有麥芽浸粉；雞蛋蛋白液；氯化血紅素溶液；維生素K1乙醇溶液；枸櫞酸鎂；瓊脂；共殺素；泰利霉素；利奈唑胺；天門冬素；蒸餾水加至1000ml。最佳優(yōu)化配方制備方法為取麥芽浸粉、雞蛋蛋白液、氯化血紅素、瓊脂、枸櫞酸鎂、四水檸檬酸鈣、共殺素、大蒜榨出汁、L-半胱氨酸溶于黃精水煮液中，混勻，定容，滅菌后分裝。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有檢出可靠、牙齦卟啉菌分離率高的特點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102703568SQ20121022777
公開日2012年10月3日 申請日期2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月4日
發(fā)明者候素君, 秦娜 申請人:候素君