一種專門針對環(huán)境樣品內分泌干擾效應的測試方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種專門針對環(huán)境樣品內分泌干擾效應的無代謝活化(-S9)酵母雙雜交實驗方法，屬于環(huán)境檢測和評價技術范疇。通過優(yōu)化培養(yǎng)基的組成、濃度，優(yōu)化培養(yǎng)、暴露條件，解決了測試環(huán)境樣品內分泌干擾效應時稀釋倍數(shù)過多的問題，也緩解了環(huán)境樣品采集量大、樣品前處理過程中需要高濃縮倍數(shù)的壓力。本方法采用錐形瓶為菌液培養(yǎng)容器，采用96孔板為環(huán)境樣品暴露、測試的容器，采用采用酶標儀作為測定吸光度的工具。實現(xiàn)了對污染物、環(huán)境樣品內分泌干擾效應的簡便、準確檢測，也便于方法的推廣普及。
【專利說明】一種專門針對環(huán)境樣品內分泌干擾效應的測試方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種專門針對環(huán)境樣品內分泌干擾效應的無代謝活化(-S9)雙雜交酵母實驗方法，屬于環(huán)境污染檢測和評價技術范疇。
【背景技術】
[0002]隨著工農業(yè)生產的快速發(fā)展，環(huán)境污染對人類造成的危害遠遠超過預想的程度，其中，環(huán)境污染物的內分泌干擾效應受到越來越廣泛的關注。內分泌干擾效應，是指由污染物引起的對生物體內分泌系統(tǒng)或與內分泌相關系統(tǒng)的干擾損害。有關內分泌干擾效應的研究主要是從細胞、亞器官或器官及組織等水平，揭示污染物對生態(tài)系統(tǒng)的生物種群、群落或生態(tài)系統(tǒng)的影響機制。內分泌干擾效應的測試和評價方法也在不斷開發(fā)、優(yōu)化。目前，檢測環(huán)境雌激素效應的方法多為生物測試法，包括雌激素受體重組酵母實驗、子宮增重實驗、細胞增殖實驗、卵黃蛋白原誘導實驗等。其中，重組酵母實驗體系是近年研究、應用較多的方法之一。該實驗采用聚合酶鏈反應法擴增人雌激素受體基因hER，通過構建誘餌質粒，提取、純化含有hER共激活因子基因的靶質粒，將誘餌質粒和靶質粒同時轉染酵母細胞構建hER雙雜交酵母。當具有雌激素效應的受試物作用于重組酵母時，可與雌激素受體形成復合物，促進報告基因LacZ的表達，產生β -半乳糖苷酶，通過測定β -半乳糖苷酶的活性反映受試物的雌激素效應。
[0003]在傳統(tǒng)的無代謝活化(-S9)雙雜交酵母實驗操作中，待測樣品在暴露環(huán)節(jié)中其濃度被稀釋到原始樣品濃度的1/200，很難準確測定其內分泌干擾效應。為了得到準確的毒性測試結果，往往需要配置濃度很高的樣品儲備液。由于很多化學物質的水溶性較差，配制高濃度溶液往往需要添加有毒的助溶劑，如二甲基亞砜DMS0，由于生物毒性實驗對助溶劑DMSO的含量要求不能超過0.1%，否則容易引起假陽性結果。對于環(huán)境樣品而言，一般是通過提高樣品濃縮倍數(shù)才能進行內分`泌干擾效應測試。為得到高濃縮倍數(shù)的待測樣品，需要采集大量環(huán)境樣品，給采樣帶來困難；另外，環(huán)境樣品往往需要復雜的固相萃取等濃縮富集操作，如果濃縮倍數(shù)過高，往往很難保證其準確性。因此，有必要開發(fā)一種專門針對環(huán)境樣品的簡便、準確的內分泌干擾效應測試方法，以降低采樣和樣品制備的成本，提高測試結果的準確性。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是為克服無代謝活化(-S9)雙雜交酵母實驗體系中待測樣品濃度稀釋倍數(shù)過大、要求環(huán)境樣品濃縮倍數(shù)過高等缺點，為化學污染物和環(huán)境樣品無代謝活化(-S9)酵母雙雜交實驗測試方法的推廣開辟一條新途徑。
[0005]本發(fā)明的目的通過以下方式實現(xiàn):通過調整培養(yǎng)基的組分及其含量，調整受試重組酵母細胞的培養(yǎng)時間和溫度，提高酵母細胞暴露密度，使其懸濁液在600nm處吸光度達0.5-2.5。在此基礎上，調整暴露實驗過程中酵母細胞懸濁液和待測環(huán)境樣品的添加體積，在保證測試結果準確的前提下，待測環(huán)境樣品在暴露環(huán)節(jié)僅稀釋2倍，大大降低了采樣體積和樣品前處理的成本。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點主要體現(xiàn)在以下幾個方面:(I)降低環(huán)境樣品前處理過程中的濃縮倍數(shù)，省去樣品高倍濃縮的步驟，減少了采樣量，降低了采樣和樣品前處理的成本。(2)環(huán)境樣品的暴露濃度稀釋為原樣品濃度的1/2，使環(huán)境樣品的檢測更方便。
[0007]附圖附表說明
[0008]圖1.本發(fā)明實施例雌二醇劑量-效應曲線
【具體實施方式】
[0009]實施例:
[0010]將0.02毫升凍存的酵母細胞株轉接入盛有20毫升培養(yǎng)基的錐形瓶中，于30°C振蕩培養(yǎng)12小時，稀釋懸濁液，至600nm處吸光度(OD6J為2.5。移取稀釋后的酵母懸濁液
0.90毫升、培養(yǎng)基0.10毫升、不同濃度的雌二醇溶液1.00毫升，至容積為5毫升的玻璃離心管中，混勻。從離心管中移取0.20毫升溶液至96孔板中，500轉/分、30°C培養(yǎng)4小時，之后立即測定600nm處的吸光度值(OD6tltl)。從96孔板中吸走0.15毫升溶液，再加入0.12毫升緩沖溶液、0.02毫升氯仿，800轉/分、30°C培養(yǎng)10分鐘。隨后加入鄰硝基苯-β -D-吡喃半乳糖苷(ONPG)溶液0.04毫升，800轉/分培養(yǎng)I小時。再加入0.10毫升碳酸鈉(Na2CO3)溶液，30°C,800轉/分培養(yǎng)10分鐘。測定420nm處吸光度(OD420)。
[0011]用以下公式計算β -半乳糖苷酶活性U:
[0012]f/= 1000x 6.6X (^420-Q^o)

{txVxOD6J
[0013]待測物濃度-酶活性 作圖。
[0014]t:與ONPG反應的時間；
[0015]V:測定OD42tl時菌液的體積；
[0016]OD420:樣品在420nm處的吸光度；
[0017]OD420?:空白對照樣品在420nm處的吸光度值。
【權利要求】
1.一種專門針對環(huán)境樣品內分泌干擾效應的測試方法，屬于環(huán)境檢測和評價技術范疇。利用無代謝活化(-S9)雙雜交酵母實驗體系，通過優(yōu)化受試生物酵母細胞的培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和暴露條件，彌補了傳統(tǒng)方法暴露環(huán)節(jié)中因待測樣品稀釋倍數(shù)較大而要求樣品前處理必須達到很高的濃縮倍數(shù)等不足，降低了環(huán)境樣品前處理過程中的濃縮倍數(shù)，實現(xiàn)了利用少量環(huán)境樣品、簡單前處理即可檢測內分泌干擾效應的目標。該方法簡便、準確，對實驗操作技術水平要求不高，便于推廣應用。
2.權利要求1所述的環(huán)境樣品內分泌干擾效應的測試方法，其特征還在于:對傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)基的組成和濃度進行了調整，培養(yǎng)基組分主要包括無氮源氮堿、葡萄糖、硫酸腺嘌呤、混合氨基酸、氯化鉀、氯化鎂等，其濃度為傳統(tǒng)方法濃度的0.1-50倍。
3.權利要求1所述的環(huán)境樣品內分泌干擾效應的測試方法，其特征還在于:所有細胞培養(yǎng)、暴露、顯色等過程中的實驗溫度在5-40°C之間。
4.權利要求1所述的環(huán)境樣品內分泌干擾效應的測試方法，其特征還在于:在檢測過程中，受試生物酵母細胞的暴露密度(以600nm處的吸光度值表示)在0.5-2.5之間。
5.權利要求1所述的一種環(huán)境樣品內分泌干擾效應的測試方法，其特征在于:用無代謝活化(-S9)雙雜交酵母實驗體系進行測試，確定了受試生物的培養(yǎng)條件和暴露條件，避免了待測樣品在暴露環(huán)節(jié)中稀釋倍數(shù)過大等問題。
6.權利要求1所述的一種環(huán)境樣品內分泌干擾效應的測試方法，其特征在于:減少了環(huán)境樣品的采樣量，降低了環(huán)境樣品的濃縮倍數(shù)，簡化了環(huán)境樣品濃縮等前處理步驟。
7.權利要求1所述的環(huán)境 樣品內分泌干擾效應的測試方法，其特征還在于:不僅適用于單一化學污染物、復合化學污染物的內分泌干擾效應檢測，也適用于液態(tài)、固態(tài)、氣態(tài)環(huán)境樣品的內分泌干擾效應檢測，包括河流、湖泊、水庫、工業(yè)廢水、市政污水、家庭廢水、再生水、農田排水、礦山尾水等液體樣品，底泥、污泥、土壤、垃圾、生物質等其他固體樣品，工廠、居室、辦公室等氣體樣品。
【文檔編號】C12Q1/02GK103509849SQ201210199433
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月18日 優(yōu)先權日:2012年6月18日
【發(fā)明者】魏東斌, 趙慧敏, 杜宇國 申請人:中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心