一種化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性試驗識別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物毒性識別領(lǐng)域，具體涉及一種化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性試驗識別方法。
【背景技術(shù)】
[0002]化工廢水中內(nèi)分泌干擾物具有很強的遺傳毒性，其是一種外源性干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)的化學(xué)物質(zhì)，指環(huán)境中存在的能干擾人類或動物內(nèi)分泌系統(tǒng)諸環(huán)節(jié)并導(dǎo)致異常效應(yīng)的物質(zhì)，它們通過攝入、積累等各種途徑，并不直接作為有毒物質(zhì)給生物體帶來異常影響，而是類似雌激素作用于有機體，使其遺傳物質(zhì)在染色體水平、分子水平和堿基水平上受到各種損傷，即使數(shù)量極少，也能讓生物體的內(nèi)分泌失衡，出現(xiàn)種種異?，F(xiàn)象。這類物質(zhì)會導(dǎo)致動物體和人體生殖器障礙、行為異常、生殖能力下降、幼體死亡、甚至滅絕。內(nèi)分泌干擾物的遺傳毒性對男性生殖系統(tǒng)影響最大，主要表現(xiàn)為男性雌性化，引起各種形式的雌性生殖系統(tǒng)發(fā)展障礙，精子數(shù)目減少乃至無精，睪丸腫瘤，性欲降低和不育癥，對女性生殖系統(tǒng)具體表現(xiàn)為女孩青春期提前，子宮內(nèi)膜異位發(fā)病率增加，月經(jīng)周期改變等。人體妊娠時接觸廢水中內(nèi)分泌干擾物會對子代產(chǎn)生有害效應(yīng)，其子代生殖器癌癥發(fā)病率無論男女均有增加。因此，不論是從保護水環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)還是保障我們?nèi)祟愖陨淼纳眢w健康和生命安全，建立一種短期、快速、有效的化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性的識別方法是非常重要的。
[0003]傳統(tǒng)的識別化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性的方法有發(fā)光細(xì)菌法、體外微核識別法、試管法、雙核法等，這些方法都能識別出化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性，但步驟繁瑣，實際操作難度較大，不能敏感反應(yīng)出廢水中內(nèi)分泌干擾物的遺傳毒性問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明針對化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性識別不靈敏的問題，提出了單細(xì)胞分子電泳法，解決了傳統(tǒng)的毒理學(xué)方法不能敏感反應(yīng)出廢水中內(nèi)分泌干擾物的遺傳毒性問題，可廣泛應(yīng)用于研宄和評價污染物對人、動物和植物細(xì)胞的遺傳毒性。
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案:
(1)篩選處于妊娠期的攜帶XylE的轉(zhuǎn)基因健康母鼠作為試驗對象，并對轉(zhuǎn)基因母鼠進行繁殖建系；
(2)提取化工廢水中內(nèi)分泌干擾物并與自來水充分混合，內(nèi)分泌干擾物的濃度比例為1.0% -3.0% ；
(3)將轉(zhuǎn)基因母鼠充分暴露在內(nèi)分泌干擾液環(huán)境下，存活1-3天；
(4)提取轉(zhuǎn)基因母鼠體內(nèi)細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞，分別置于細(xì)胞懸浮液中，待檢測；
(5)采用單細(xì)胞分子電泳技術(shù)，對細(xì)胞懸浮液中的母體細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞進行檢測，分析其DNA損傷程度，并繪制彗星尾圖譜，對試驗結(jié)果進行分析。
[0006]本發(fā)明與其它方法相比，有益之處在于:
本發(fā)明提供了一種化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性試驗識別方法，通過將處于妊娠期的攜帶xylE的轉(zhuǎn)基因健康母鼠作為受試體，并置于配置好的含有濃度梯度的內(nèi)分泌干擾液中培養(yǎng)1-3天，然后采用單細(xì)胞分子電泳對母鼠及其子代細(xì)胞進行檢測，最后通過分析，識別出化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性，具有簡便、快速、靈敏、樣品量少和無需放射性標(biāo)記等優(yōu)點，解決了傳統(tǒng)的毒理學(xué)方法不能敏感反應(yīng)出廢水中內(nèi)分泌干擾物的遺傳毒性問題，可廣泛應(yīng)用于研宄和評價污染物對人、動物和植物細(xì)胞的遺傳毒性。
【具體實施方式】
[0007]一種化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性試驗識別方法，其步驟包括:
(1)選擇受試物:篩選處于妊娠期的攜帶XylE的轉(zhuǎn)基因健康母鼠作為試驗對象，并對轉(zhuǎn)基因母鼠進行繁殖建系；
(2)配置內(nèi)分泌干擾液:提取化工廢水中內(nèi)分泌干擾物并與自來水充分混合，內(nèi)分泌干擾物的濃度比例為1.0% -3.0% ;
(3)對受試體進行染毒處理:將轉(zhuǎn)基因母鼠充分暴露在內(nèi)分泌干擾液環(huán)境下，存活1-3
天;
(4)提取細(xì)胞:提取轉(zhuǎn)基因母鼠體內(nèi)細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞，分別置于細(xì)胞懸浮液中，待檢測；
(5)細(xì)胞的檢測:采用單細(xì)胞分子電泳技術(shù)，對細(xì)胞懸浮液中的母體細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞進行檢測，分析其DNA損傷程度，并繪制彗星尾圖譜，對試驗結(jié)果進行分析。
[0008]所述的轉(zhuǎn)基因母鼠，是以穿梭質(zhì)粒pESnx為載體，將xylE誘變革El基因植入母鼠體內(nèi)；之所以選擇處于妊娠期的母鼠，是為了進一步說明遺傳毒性對于生物及其后代的影響。
[0009]所述的細(xì)胞懸浮液的配置方法為:(I)先制備小鼠細(xì)胞培養(yǎng)液，成分為:微量元素、促生長因子、無機鹽、維生素和小鼠血漿等。(2)將母鼠體內(nèi)細(xì)胞及胚胎細(xì)胞先剪碎，然后用分解酶處理成單個細(xì)胞。(3)然后把這些單個細(xì)胞放入小鼠細(xì)胞培養(yǎng)液中。(4)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的PH值為6.9，并放入適宜的環(huán)境下培養(yǎng)即可。
[0010]所述的單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)可以快速檢測單細(xì)胞DNA的損傷，根據(jù)繪制的彗星尾圖譜，可以檢測到每1.903X l(T41kg中0.09DNA的斷裂。本方法能更加直觀、準(zhǔn)確的檢測水質(zhì)的遺傳毒性，結(jié)果易于統(tǒng)一，重現(xiàn)性好，能夠?qū)λ|(zhì)污染狀況做出精準(zhǔn)判斷。
下面通過三個具體事例來加以說明實施例1
[0011]首先篩選處于妊娠期的攜帶xylE的轉(zhuǎn)基因健康母鼠作為受試體，并對轉(zhuǎn)基因母鼠進行繁殖建系；然后提取化工廢水中內(nèi)分泌干擾物并與自來水充分混合，內(nèi)分泌干擾物的濃度比例為1.0% ;將轉(zhuǎn)基因母鼠充分暴露在內(nèi)分泌干擾液環(huán)境下存活I(lǐng)天之后提取其體內(nèi)細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞，分別置于細(xì)胞懸浮液中，采用單細(xì)胞分子電泳技術(shù)，對細(xì)胞懸浮液中的母體細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞進行檢測，結(jié)果表明，此環(huán)境下彗星尾長和尾矩提高了 93.3%,即化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性為低。
實施例2
[0012]首先篩選處于妊娠期的攜帶xylE的轉(zhuǎn)基因健康母鼠作為受試體，并對轉(zhuǎn)基因母鼠進行繁殖建系；然后提取化工廢水中內(nèi)分泌干擾物并與自來水充分混合，內(nèi)分泌干擾物的濃度比例為2.0% ;將轉(zhuǎn)基因母鼠充分暴露在內(nèi)分泌干擾液環(huán)境下存活2天之后提取其體內(nèi)細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞，分別置于細(xì)胞懸浮液中，采用單細(xì)胞分子電泳技術(shù)，對細(xì)胞懸浮液中的母體細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞進行檢測，結(jié)果表明，此環(huán)境下彗星尾長和尾矩提高了 96.4%,即化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性為中。
實施例3
[0013]首先篩選處于妊娠期的攜帶xylE的轉(zhuǎn)基因健康母鼠作為受試體，并對轉(zhuǎn)基因母鼠進行繁殖建系；然后提取化工廢水中內(nèi)分泌干擾物并與自來水充分混合，內(nèi)分泌干擾物的濃度比例為3.0% ;將轉(zhuǎn)基因母鼠充分暴露在內(nèi)分泌干擾液環(huán)境下存活3天之后提取其體內(nèi)細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞，分別置于細(xì)胞懸浮液中，采用單細(xì)胞分子電泳技術(shù)，對細(xì)胞懸浮液中的母體細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞進行檢測，結(jié)果表明，此環(huán)境下彗星尾長和尾矩提高了 99.8%,即化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性為高。
[0014]以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明的設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程的技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案做出的各種變形和改進，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性試驗識別方法，其步驟包括: (1)選擇受試物:篩選處于妊娠期的攜帶XylE的轉(zhuǎn)基因健康母鼠作為試驗對象，并對轉(zhuǎn)基因母鼠進行繁殖建系； (2)配置內(nèi)分泌干擾液:提取化工廢水中內(nèi)分泌干擾物并與自來水充分混合，內(nèi)分泌干擾物的濃度比例為1.0% -3.0% ; (3)對受試體進行染毒處理:將轉(zhuǎn)基因母鼠充分暴露在內(nèi)分泌干擾液環(huán)境下，存活1-3天; (4)提取細(xì)胞:提取轉(zhuǎn)基因母鼠體內(nèi)細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞，分別置于細(xì)胞懸浮液中，待檢測； (5)細(xì)胞的檢測:采用單細(xì)胞分子電泳技術(shù)，對細(xì)胞懸浮液中的母體細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞進行檢測，分析其DNA損傷程度，并繪制彗星尾圖譜，對試驗結(jié)果進行分析。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性試驗識別方法，其特征在于:所述的轉(zhuǎn)基因母鼠，是以穿梭質(zhì)粒PESnx為載體，將xylE誘變靶基因植入母鼠體內(nèi)；之所以選擇處于妊娠期的母鼠，是為了進一步說明遺傳毒性對于生物及其后代的影響。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性試驗識別方法，其特征在于:所述的細(xì)胞懸浮液的配置方法為: (1)先制備小鼠細(xì)胞培養(yǎng)液，成分為:微量元素、促生長因子、無機鹽、維生素和小鼠血楽等; (2)將母鼠體內(nèi)細(xì)胞及胚胎細(xì)胞先剪碎，然后用分解酶處理成單個細(xì)胞； (3)然后把這些單個細(xì)胞放入小鼠細(xì)胞培養(yǎng)液中； (4)調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值為6.9，并放入適宜的環(huán)境下培養(yǎng)即可。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性試驗識別方法，其特征在于:所述的單細(xì)胞分子電泳技術(shù)可以快速檢測單細(xì)胞DNA的損傷，根據(jù)繪制的彗星尾圖譜，可以檢測到每1.903Xl(T41kg中0.09個DNA的斷裂。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種化工廢水中內(nèi)分泌干擾遺傳毒性試驗識別方法，屬于生物毒性識別領(lǐng)域。其步驟為：先選擇受試物，然后配置內(nèi)分泌干擾液，并對受試體進行染毒處理，提取轉(zhuǎn)基因母鼠體內(nèi)細(xì)胞以及胚胎細(xì)胞，最后采用單細(xì)胞分子電泳技術(shù)，對細(xì)胞進行檢測。本發(fā)明通過將處于妊娠期的攜帶xy1E的轉(zhuǎn)基因健康母鼠作為受試體，并采用單細(xì)胞分子電泳對母鼠及其子代細(xì)胞進行檢測，具有簡便、快速、靈敏、樣品量少和無需放射性標(biāo)記等優(yōu)點，解決了傳統(tǒng)的毒理學(xué)方法不能敏感反應(yīng)出廢水中內(nèi)分泌干擾物的遺傳毒性問題，可廣泛應(yīng)用于研究和評價污染物對人、動物和植物細(xì)胞的遺傳毒性。
【IPC分類】G01N33/50
【公開號】CN104914237
【申請?zhí)枴緾N201510259290
【發(fā)明人】趙遠, 徐波, 蔡強, 孫向武, 陳文艷, 肖嫻, 仇愛峰, 俞潔, 孫娜
【申請人】常州大學(xué)
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年5月20日