專利名稱：篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的芯片及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物信息學(xué)及生物檢疫鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的芯片及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
椰子死亡類病毒屬類病毒(CocadviiOid)屬于馬鈴薯紡錘形塊莖類病毒科(Pospiviroidae),根據(jù)國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy ofViruses, ICTV)第八次分類報告，該屬包括柑橘類病毒IV (Citrus viroid IV，CVd-1 V)、挪子死亡類病毒(Coconut cadang-cadang viroid, CCCVd)、挪子敗生類病毒(Coconut tinangaja viroid, CTiVd)及啤酒花潛隱類病毒(Hop latent viroid, HLVd)等 4 種類病毒。其中椰子死亡類病毒和椰子敗生類病毒是2007年發(fā)布的《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》中的檢疫性有害生物。該屬的類病毒可侵染椰子(Cocos nucifera)、油棕(Elaeis guineensis)、長柄貝葉掠(Corypha elata)，人工接種寄主有模榔(Areca catechu)、散尾葵(ChrysalidocaprusIutescens)、率椰(Phoenix dactylifera)、大王椰(Roystonea regia)、圣誕椰(Veitchiamerrillii)、甜澄(Citrus sinensis)和枸橡(Citrus medica)等多種重要的作物。椰子死亡類病毒是我國進境植物檢疫性有害生物，也是國際上著名的檢疫性有害生物，它嚴重危害椰子和油棕等棕櫚科植物的生產(chǎn)，主要分布于菲律賓。1937年首次報道在菲律賓的椰子死亡病，病樹根部壞死，頂芽枯死，底部葉脫落，花序短小、壞死；1976年確定該病病原體為椰子死亡類病毒。菲律賓從1914年發(fā)現(xiàn)椰子死亡病以來，約有3億株椰子樹死亡，據(jù)估算每株感病椰子的經(jīng)濟損失約為80 100美元。菲律賓每年約有50萬株病樹枯死，僅1986年由新出現(xiàn)的病樹引起的直接經(jīng)濟損失達2000萬美元以上。椰子是我國熱帶主要果樹之一，具有很高經(jīng)濟價值，在熱帶作物種植業(yè)中占據(jù)重要地位。海南島是我國椰子分布最集中的地方，是我國椰子的主產(chǎn)區(qū)，全省椰子種植面積達到68萬畝，年產(chǎn)椰子2. 26億個，產(chǎn)量占全國的99%。此外，椰子在粵西的雷州半島和西雙版納以及西沙群島也都有少量栽培。觀賞棕櫚植物種植是當(dāng)前農(nóng)業(yè)開發(fā)的熱點，不斷從國外引進棕櫚科觀賞植物新品種，椰子類病毒傳入我國的可能性加大。因此，建立該屬類病毒的篩查方法，對防止該屬類病毒傳入我國，保護我國棕櫚科植物的生產(chǎn)和環(huán)境、旅游資源，具有重要經(jīng)濟意義。由于本屬具有潛在新發(fā)檢疫性類病毒的可能，而目前用于該屬類病毒檢測的方法如指示植物法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、核酸斑點雜交技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)等只能對該屬已知類病毒進行特異性檢測，對于未知及新發(fā)的類病毒監(jiān)測無能為力，所以容易造成危險性類病毒漏檢并傳播擴散，進而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失和不良的社會影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定椰子死亡類病毒屬類病毒的探針組。本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定椰子死亡類病毒屬類病毒的探針組，由探針I(yè)-探針9共9條探針組成，所述探針I(yè)-探針9的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-9。上述探針中，所述椰子死亡類病毒屬類病毒為柑橘類病毒IV、椰子死亡類病毒、椰子敗生類病毒或啤酒花潛隱類病毒。本發(fā)明的另一個目的是提供一種篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的基因芯片。本發(fā)明提供的篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的基因芯片，為將上述的探針固定在片基表面得到的基因芯片。在上述基因芯片中，所述片基為醛基化玻璃片基，在本發(fā)明的實施例中采用的是博奧生物有限公司晶芯 微陣列基片，產(chǎn)品目錄號420022。
在上述基因芯片中，所述椰子死亡類病毒屬類病毒為柑橘類病毒IV、椰子死亡類病毒、椰子敗生類病毒或啤酒花潛隱類病毒。本發(fā)明的第三個目的是提供一種篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的基因芯片。上述試劑盒還包括用于擴增所述椰子死亡類病毒屬類病毒的cDNA的引物對，所述引物對具體由序列表中序列10和序列表中序列11所示的DNA分子組成；所述椰子死亡類病毒屬類病毒為啤酒花潛隱類病毒。上述探針組、上述基因芯片或上述試劑盒在如下1)-4)中的應(yīng)用，也是本發(fā)明保護的范圍I)鑒定或輔助鑒定椰子死亡類病毒屬類病毒；2)制備鑒定或輔助鑒定椰子死亡類病毒屬類病毒產(chǎn)品；3)鑒定或輔助鑒定待測植物感染椰子死亡類病毒屬類病毒；4)制備鑒定或輔助鑒定待測植物感染椰子死亡類病毒屬類病毒產(chǎn)品。上述應(yīng)用中，所述待測植物為椰子、柑橘或啤酒花；所述椰子死亡類病毒屬類病毒為柑橘類病毒IV、椰子死亡類病毒、椰子敗生類病毒或啤酒花潛隱類病毒。本發(fā)明的第四個目的是提供一種篩查或輔助篩查待測植物感染椰子死亡類病毒屬類病毒的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)將待測植物的組織的cDNA進行標(biāo)記，得到標(biāo)記后產(chǎn)物；2)將步驟I)得到的標(biāo)記后產(chǎn)物與上述的基因芯片進行雜交，得到雜交后芯片；3)將步驟2)得到的雜交后芯片掃描，若所述基因芯片上的至少一條所述探針的信號絕對值不小于600且信噪比不小于3. 0，則待測植物感染或候選感染椰子死亡類病毒屬類病毒。上述方法中，步驟I)中，所述標(biāo)記為以所述cDNA為模板，以上述的試劑盒中的任一所述引物對進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，再將所述PCR產(chǎn)物進行Klenow酶標(biāo)記，得到標(biāo)記后產(chǎn)物；步驟2)中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時間為12h ；在所述步驟2)后和步驟3)前還包括將所述雜交后芯片進行洗滌的步驟；所述至少一條所述探針為所述探針組中的任意一條；
所述待測植物為啤酒花，所述組織為葉片；所述椰子死亡類病毒屬類病毒為啤酒花潛隱類病毒。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明提供的篩查椰子死亡類病毒屬類病毒芯片中的探針具有椰子死亡類病毒屬類病毒屬水平上的高兼容性和屬內(nèi)的特異性，所需的樣品量少，一般僅需O. lg。另外數(shù)據(jù)的分析與計算機圖像處理軟件相結(jié)合，達到分析結(jié)果能夠直觀化、可視化。本發(fā)明采用生物信息學(xué)方法對椰子死亡類病毒屬類病毒的核苷酸序列進行分析，設(shè)計了該屬的兼容性探針，標(biāo)準類病毒樣品驗證結(jié)果證明探針效果良好。本發(fā)明的椰子死亡類病毒屬類病毒篩查芯片可用于椰子死亡類病毒屬類病毒的檢疫鑒定。


圖I為椰子死亡類病毒屬類病毒篩查芯片探針點陣示意圖(6X7) 圖2為應(yīng)用啤酒花潛隱類病毒樣品驗證屬篩查芯片的特異性圖3為應(yīng)用啤酒花潛隱類病毒樣品驗證屬篩查芯片的靈敏度檢測結(jié)果圖4為PCR靈敏度檢測結(jié)果
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的芯片的制備I、屬級高兼容性寡核苷酸探針的設(shè)計從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)及國際病毒學(xué)分類委員會(ICTV)數(shù)據(jù)庫下載類病毒屬全基因組及核酸序列；去除90%以上長度與其它序列有95%相似度的核酸序列；以5個堿基作為間隔，連續(xù)提取所有40mer的核酸序列；以40% ( GC含量< 60%、單個堿基含量< 50%、連續(xù)重復(fù)堿基數(shù)目< 4，且無大于6個堿基的發(fā)卡結(jié)構(gòu)為標(biāo)準對提取的核酸序列進行篩選，并在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源性比較以保證所獲得探針的特異性。根據(jù)上述原則設(shè)計了椰子死亡類病毒屬類病毒的9條探針(探針I(yè)-探針9)，其核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1-9所示?？梢匀斯ず铣缮鲜?條探針。2、芯片的制備將上述I得到的9條探針分別用點樣緩沖液(博奧生物有限公司晶芯@芯片點樣液，產(chǎn)品目錄號440010)溶解，濃度為50μΜ，每條探針橫向重復(fù)3點點在醛基化玻璃片基芯片(博奧生物有限公司晶芯 微陣列基片，產(chǎn)品目錄號420022)上，每點約O. 25nL，點直徑約180 μ m,點間距為300 μ m,點樣均勻度的標(biāo)準方差為15%。將芯片點有探針的一面在65°C水浴鍋上水合IOs,芯片距水面距離為3cm,在空氣中室溫自然干燥,在進行一次水合。將點有探針的一面向上，放在紫外交聯(lián)儀中250mJ交聯(lián)。將芯片放在42°C預(yù)熱，O. 5% SDS清洗lOmin。將芯片轉(zhuǎn)移到42°C預(yù)熱蒸餾水中清洗2min。把芯片放在50mL錐形離心管中，2000rpm離心lmin，以去除芯片表面的液體，獲得篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的芯片。篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的芯片如圖I所示，圖I中1-9為椰子死亡類病毒屬類病毒篩查芯片探針1-9 (對應(yīng)序列1-9)，Hex為芯片固定陽性質(zhì)控，PC為雜交陽性質(zhì)控，NC為雜交陰性質(zhì)控。實施例2、篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的芯片的應(yīng)用一、篩查芯片檢測樣品 I、用于檢測的樣品總RNA提取I)取感染啤酒花潛隱類病毒的啤酒花組織(啤酒花潛隱類病毒拉丁名Hop latentviroid,記載在First report of Hop latent viroid(HLVd) in China, BSPP-New DiseaseReports, 2007,16, 17.，公眾可從中國檢驗檢疫科學(xué)研究院獲得；啤酒花記載在；啤酒花記載在啤酒花防癌，《健康人生》，2006年第2期；公眾可從中國檢驗檢疫科學(xué)研究院獲得)0. Ig樣品，用液氮研磨成粉末狀，移入滅菌的I. 5mL離心管中，然后加入ImL的Trizol試劑，劇烈震蕩搖勻； 2) 4°C, 12000rpm離心IOmin,將上清液轉(zhuǎn)入一新的I. 5mL離心管中；3)加 0. 5mL 氯仿,劇烈振蕩 15s,室溫放置 15min ；4°C, 12000rpm 離心 15min ；4)將上層水相轉(zhuǎn)移到新的I. 5mL離心管中，加等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫保持15min ；5)4°C，12000rpm離心IOmin ;倒掉上清液，加入75%的冷乙醇洗滌沉淀，然后4°C，12000rpm離心5min,棄乙醇；7)沉淀室溫下充分干燥后，溶于40 μ L雙蒸水(DEPC處理)中，_20°C保存?zhèn)溆?，得?RNA。2、樣品標(biāo)記與雜交將上述得到的RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。PCR擴增，即在O. 2mL的反應(yīng)管中加入cDNA產(chǎn)物2 μ L、上游引物O. 5 μ L (終濃度為 0. 5mmol/L)、下游引物 0. 5μ L (終濃度為 0. 5mmoL/L)、dNTP Mix (10mmol/L) O. 5 μ L、Taq 酶(5U/ μ L) O. 5 μ L、PCR 緩沖液(10 X ) 2 μ L 及 DEPC-H2O 14 μ L，然后按照 PCR 反應(yīng)程
序進行擴增。 上下游引物由用于擴增啤酒花潛隱類病毒的弓I物組成，上游引物5’-ACCTACTCGAGCGAGGCGGAG-3’(序列 10);下游引物5’-GCACGAACTGGCGCTCGAT-3’(序列 11);其PCR 反應(yīng)程序為94°C 5min;94°C 30s、58°C 30s,72°C 30s;共 30 個循環(huán)；72°C延伸8min。Klenow酶標(biāo)記體系為25 μ L，即在0. 2mL的PCR反應(yīng)管中加入PCR產(chǎn)物5 μ L，9N隨機引物(invitrogen，Cat. No. 48190-011)( 100 μ mol/L)2 μ L 及 H2O 12μ L，95°C變性 3min,冰浴5min。然后向反應(yīng)管中加入IOXKlenow酶緩沖液2.5 μ L，dNTP (2. 5mmol/L) 2μ L,cy3~dCTP O. 5 μ L (Amersham, Cat. No. PA 53021 終濃度為 5nmol/L), klenow 酶(5U/ μ L)I μ L。37°C反應(yīng)I. 5h，70°C變性5min，冰浴5min，得到標(biāo)記樣品。雜交體系為16 μ L，包括 2. 4μ L SSC (終濃度 3Χ )、0· 32 μ LSDS (終濃度 0. 2% )、4μ L 甲酰胺(終濃度 25%)、I. 6 μ LDenhardt ’ s (Ameresco, Cat. No. E717，終濃度 5X )和標(biāo)記樣品7. 68 μ L0 95°C變性3min，冰浴5min，瞬時離心。將雜交液加到芯片上，蓋玻片蓋好，42°C水浴雜交過夜(12h)，分別得到雜交后的芯片(啤酒花潛隱類病毒)。3、洗漆、掃描
清洗體系及程序如下
權(quán)利要求
1.一種鑒定或輔助鑒定椰子死亡類病毒屬類病毒的探針組，由探針I(yè)-探針9共9條探針組成，所述探針I(yè)-探針9的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-9。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的探針組，其特征在于所述椰子死亡類病毒屬類病毒為柑橘類病毒IV、椰子死亡類病毒、椰子敗生類病毒或啤酒花潛隱類病毒。
3.—種篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的基因芯片，為將權(quán)利要求I或2所述的探針組固定在片基表面得到的基因芯片。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因芯片，其特征在于所述片基為醛基化玻璃片基；所述椰子死亡類病毒屬類病毒為柑橘類病毒IV、椰子死亡類病毒、椰子敗生類病毒或啤酒花潛隱類病毒。
5.一種篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的試劑盒，包括權(quán)利要求3或4所述的基因芯片。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括用于擴增所述椰子 死亡類病毒屬類病毒的cDNA的引物對，所述引物對具體由序列表中序列10和序列表中序列11所示的DNA分子組成；所述椰子死亡類病毒屬類病毒為啤酒花潛隱類病毒。
7.權(quán)利要求I或2所述探針組、權(quán)利要求3或4所述的基因芯片、權(quán)利要求5或6所述的試劑盒 在如下I)-4)中的應(yīng)用，也是本發(fā)明保護的范圍 O鑒定或輔助鑒定椰子死亡類病毒屬類病毒； 2)制備鑒定或輔助鑒定椰子死亡類病毒屬類病毒產(chǎn)品； 3)鑒定或輔助鑒定待測植物感染椰子死亡類病毒屬類病毒； 4)制備鑒定或輔助鑒定待測植物感染椰子死亡類病毒屬類病毒產(chǎn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述待測植物為椰子、柑橘或啤酒花；所述椰子死亡類病毒屬類病毒為柑橘類病毒IV、椰子死亡類病毒、椰子敗生類病毒或啤酒花潛隱類病毒。
9.一種篩查或輔助篩查待測植物感染椰子死亡類病毒屬類病毒的方法，包括如下步驟 1)將待測植物的組織的cDNA進行標(biāo)記，得到標(biāo)記后產(chǎn)物； 2)將步驟I)得到的標(biāo)記后產(chǎn)物與權(quán)利要求3或4所述的基因芯片進行雜交，得到雜交后芯片； 3)將步驟2)得到的雜交后芯片掃描， 若所述基因芯片上的至少一條所述探針的信號絕對值不小于600且信噪比不小于3.0，則待測植物感染或候選感染椰子死亡類病毒屬類病毒。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于 步驟I)中，所述標(biāo)記為以所述cDNA為模板，以權(quán)利要求6所述的試劑盒中的任一所述引物對進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，再將所述PCR產(chǎn)物進行Klenow酶標(biāo)記，得到標(biāo)記后產(chǎn)物； 步驟2)中，所述雜交的溫度為42°C，所述雜交的時間為12h ； 在所述步驟2)后和步驟3)前還包括將所述雜交后芯片進行洗滌的步驟； 所述至少一條所述探針為所述探針組中的任意一條； 所述待測植物為啤酒花，所述組織為葉片；所述椰子死亡類病毒屬類病毒為啤酒花 潛隱類病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的芯片及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定椰子死亡類病毒屬類病毒的探針，由9條探針組成，所述9條探針的核苷酸序列依次分別為序列表中的序列1-9。還提供了篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的基因芯片，為將上述的探針固定在片基表面得到的基因芯片。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明采用生物信息學(xué)方法對椰子死亡類病毒屬類病毒的核苷酸序列進行分析，設(shè)計了該組的兼容性探針，標(biāo)準類病毒樣品驗證結(jié)果證明探針效果良好。本發(fā)明的篩查椰子死亡類病毒屬類病毒的芯片可用于椰子死亡類病毒屬類病毒的檢疫鑒定。
文檔編號C12N15/11GK102719562SQ20121019358
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者張永江, 朱水芳, 李世訪, 李明福, 李桂芬, 辛言言 申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院