專利名稱：N-乙酰半胱氨酸對(duì)中央記憶性t細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及N-乙酰半胱氨酸對(duì)中央記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
N -乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine,簡(jiǎn)稱NAC)是細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽(GSH)的前體，NAC分子式=C5H9NO3S,相對(duì)分子質(zhì)量163 *20。NAC曾作為一種黏液溶解劑多年來應(yīng)用于治療各種呼吸系統(tǒng)疾病。近年又發(fā)現(xiàn)NAC具有肝細(xì)胞保護(hù)作用而用于治療多種原因引起的肝細(xì)胞損害，其中NAC治療對(duì)乙酰氨基酚致急性肝功能衰竭已獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)。 近年研究顯示，NAC具有多種藥理作用，它可以直接清除自由基，增加機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力，并可減少炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子產(chǎn)生。此外，NAC還可以調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)和細(xì)胞凋亡程序。許多文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示NAC作為一種含活性巰基抗氧化劑，無毒副作用，具備較高的生物安全性，除醫(yī)療用途之外，也廣泛應(yīng)用于細(xì)胞系的培養(yǎng)，可有效地維持細(xì)胞系的存活。由于T細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中起著重要的作用，越來越多的研究小組嘗試運(yùn)用T細(xì)胞的過繼治療的方式來進(jìn)行腫瘤治療。中央記憶性T細(xì)胞(TCM)具有自我更新的能力，而且應(yīng)答時(shí)間短，作用時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)人體的副作用小。今年來，多個(gè)研究組報(bào)道，發(fā)現(xiàn)具有記憶功能的T細(xì)胞回輸腫瘤患者體內(nèi)以后，治療效果明顯并且持續(xù)治療時(shí)間長(zhǎng)，可以減少患者的痛苦以及降低細(xì)胞體外培養(yǎng)次數(shù)過多的生物安全風(fēng)險(xiǎn)。但是在人體內(nèi)相對(duì)數(shù)量較少，且由于體外長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)的T細(xì)胞會(huì)使T細(xì)胞失去活力，絕大部分細(xì)胞分化為終末分化的效應(yīng)細(xì)胞，使得回輸體內(nèi)的T細(xì)胞存活時(shí)間過短，無法產(chǎn)生持續(xù)的殺傷腫瘤細(xì)胞的功能，因此如何在體外獲得大量的記憶性T細(xì)胞是細(xì)胞免疫治療的一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。目前，國(guó)外的許多研究小組通過構(gòu)建人工抗原提呈細(xì)胞，將其應(yīng)用于T細(xì)胞的體外培養(yǎng)，提高T細(xì)胞的存活時(shí)間，用于過繼免疫治療，但要獲得足夠量的T細(xì)胞，技術(shù)要求復(fù)雜，培養(yǎng)的成功率較低。在進(jìn)行T細(xì)胞治療時(shí)，主要策略是先通過克隆擴(kuò)增，得到足夠量的具有殺傷功能的T細(xì)胞，可以與DC等提呈細(xì)胞共培養(yǎng)，也可以直接用相關(guān)腫瘤抗原刺激細(xì)胞克隆擴(kuò)增，得到具有特定腫瘤抗原特異性的T細(xì)胞。此種辦法培養(yǎng)得到的T細(xì)胞未經(jīng)過任何轉(zhuǎn)基因修飾，安全性較高。但這種腫瘤高反應(yīng)性的細(xì)胞需要擴(kuò)增至臨床需要的IO9 -IO11治療劑量的數(shù)量數(shù)，過程持續(xù)時(shí)間比較長(zhǎng)，對(duì)于腫瘤患者來說時(shí)間也是一個(gè)需要更多考慮的因素。而且體外培養(yǎng)的時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞容易變老，活力下降，多為終末分化的細(xì)胞，在體外有較好的效果，但是在體內(nèi)存活時(shí)間較短，治療效果受影響。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供N-乙酰半胱氨酸對(duì)中央記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用。
本發(fā)明涉及N-乙酰半胱氨酸(NAC)對(duì)中央記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用。本發(fā)明所述中央記憶性T細(xì)胞為⑶4+ T或⑶8+T細(xì)胞。本發(fā)明還提供了 N-乙酰半胱氨酸體外擴(kuò)增T細(xì)胞的最適劑量為I mmol/flOmmol/L0本發(fā)明采用小分子藥物NAC對(duì)CD4+ T或CD8+T中央記憶性細(xì)胞進(jìn)行了有效的體外擴(kuò)增，并且找出了其促進(jìn)體外擴(kuò)增的最適濃度，該方法具有安全性高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，為過繼免疫治療的廣泛開展提供了良好的技術(shù)支持。


圖I為不同濃度的NAC對(duì)⑶4+ T細(xì)胞的擴(kuò)增效果。圖2為NAC處理后不同時(shí)間點(diǎn)的兩組⑶4+ T細(xì)胞數(shù)量的比較。圖3為不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)⑶4+ T細(xì)胞中⑶4+ TCM所占比例的檢測(cè)。圖4為兩組數(shù)據(jù)⑶4+TCM的數(shù)量(15天)。圖5為不同濃度的NAC對(duì)⑶8+ T細(xì)胞的擴(kuò)增效果。圖6為NAC處理后不同時(shí)間點(diǎn)的兩組⑶8+ T細(xì)胞數(shù)量的比較。
具體實(shí)施例方式為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面結(jié)合試驗(yàn)和結(jié)果來說明NAC對(duì)中央記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用。試驗(yàn)材料
人的外周成分血由廣州市血液中心提供，試驗(yàn)中隨機(jī)選取了 24份正常人的血液樣本。主要試劑胎牛血清購(gòu)自于GIBCO公司；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自于INVERTR0GEN公司；NAC購(gòu)自于INVERTR0GEN公司；流式細(xì)胞儀檢測(cè)抗體anti-CD4_PE、anti-CD27_FITC、anti-CCR7-PECY5 購(gòu)自于 BD 公司；anti-CD45RA_ECD 購(gòu)自于 BECKMAN 公司；Annexin_V 購(gòu)自于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自于天津?yàn)柹镏破酚邢挢?zé)任公司；CD4+ T細(xì)胞陰性選擇磁珠購(gòu)自于BD公司。主要的實(shí)驗(yàn)儀器臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5810R)、流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter 公司)、CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo SCIENTIFIC)、生物安全柜(ThermoSCIENTIFIC)、倒置生物顯微鏡(Leica)、磁珠分選磁力架(BD Pharmigen)0細(xì)胞培養(yǎng)
2.I細(xì)胞提取分離
將外周成分血與PBS緩沖液(含2% BSA、0. 5% EDTA)按1:4混合均勻；然后將稀釋后的血液緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液的上方，二者的比例為1:1 ;離心300Xg 30 min;小心吸取單核細(xì)胞，置入另一離心管中，加入5倍體積的PBS (含0. 5% BSA,2% EDTA)稀釋，混合均勻后，300 Xg 15 min ;重復(fù)上一步驟一次；孵育⑶4+ T或⑶8+T細(xì)胞陰選一抗，15 min; 10倍體積的PBS (含0.5% BSA,2% EDTA)稀釋，混合均勻后，300 Xg 12 min ;孵育帶有磁珠的二抗，30 min ;過柱進(jìn)行細(xì)胞分選，得到⑶4+ T或⑶8+T細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞后調(diào)整細(xì)胞至所需濃度；2.2培養(yǎng)條件
在5% CO2、飽和濕度及37°C下，將5 X 105個(gè)/孔的⑶4+ T細(xì)胞置于I mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)。細(xì)胞鋪板及加藥處理
3.I鋪板
將分選出來的CD4+T或CD8+T細(xì)胞鋪在12孔板中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，每孔預(yù)期的細(xì)胞數(shù)為5X105。鋪板后用血球計(jì)數(shù)板和臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),每孔實(shí)際的活細(xì)胞數(shù)為4. 88X 105±1. 18X IO4 ；
3.2加藥處理 對(duì)鋪板后的CD4+T或CD8+T細(xì)胞進(jìn)行5種不同的處理，每種處理設(shè)置三個(gè)復(fù)孔作為平行對(duì)照，并在細(xì)胞培養(yǎng)的第4天，第7天，第10天，第13天施加相應(yīng)刺激；
權(quán)利要求
1.N-こ酰半胱氨酸對(duì)中央記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的N-こ酰半胱氨酸對(duì)中央記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用，其特征在于，所述中央記憶性T細(xì)胞為⑶4+ T或⑶8+T細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的N-こ酰半胱氨酸對(duì)中央記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用，其特征在于，所述N-こ酰半胱氨酸的濃度為I mmol/flO mmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的N-こ酰半胱氨酸對(duì)中央記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用，其特征在于，所述T細(xì)胞的提取方法是先將外周成分血與含2% BSA和O. 5%EDTA的PBS按1:4混合均勻；然后將稀釋后的血液緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液的上方，二者的比例為1:1 ;離心300Xg 30 min ;小心吸取單核細(xì)胞，置入另ー離心管中，加入5倍體積的含O. 5% BSA和2% EDTA的PBS稀釋，混合均勻后，300Xg 15 min ;重復(fù)上ー步驟一次；孵育CD4+ T或CD8+T細(xì)胞陰選ー抗，15 min ;用10倍體積的含O. 5% BSA和2% EDTA的PBS稀釋，混合均勻后，300Xg 12 min;孵育帶有磁珠的ニ杭，30 min ;過柱進(jìn)行細(xì)胞分選，得到CD4+ T 或 CD8+T 細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的N-こ酰半胱氨酸對(duì)中央記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用，其特征在于，所述T細(xì)胞的培養(yǎng)方法是在5% CO2、飽和濕度及37°C條件下將.5 X IO5個(gè)/孔的⑶4+ T或⑶8+T細(xì)胞置于I mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了N-乙酰半胱氨酸對(duì)中央記憶性T細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)量在體外擴(kuò)增上的應(yīng)用，并且找出了其促進(jìn)體外擴(kuò)增的最適濃度。該方法具有安全性高、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，為過繼免疫治療的廣泛開展提供了良好的技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12N5/0783GK102732480SQ20121019035
公開日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者劉超, 張輝, 武雙鑫, 羅海華 申請(qǐng)人:中山大學(xué)