專利名稱：多肽的生產(chǎn)的制作方法
多肽的生產(chǎn)本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2005年8月26日的、發(fā)明名稱為“多肽的生產(chǎn)”的中國(guó)專利申請(qǐng) 200580036899. I (PCT/US2005/030437)的分案申請(qǐng)。相關(guān)申請(qǐng)本申請(qǐng)要求于2004年8月27日遞交的臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/605，097,60/604, 941和60/605，074的優(yōu)先權(quán)，均在此處整體引用作為參考。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)和多肽作為治療物質(zhì)已日益重要。大多數(shù)情況下，治療性蛋白質(zhì)和多肽產(chǎn)生于細(xì)胞培養(yǎng)物中，所述細(xì)胞經(jīng)過基因工程操作和/或選擇以產(chǎn)生非比尋常的高水平特定目的蛋白質(zhì)或多肽。細(xì)胞培養(yǎng)條件的調(diào)控和優(yōu)化對(duì)于蛋白質(zhì)和多肽的成功商業(yè)化生產(chǎn)至關(guān) 重要。許多在細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽均系分批或補(bǔ)料分批方法產(chǎn)生，其中將細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間，然后終止培養(yǎng)并分離產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或多肽。細(xì)胞培養(yǎng)條件能顯著影響所產(chǎn)生蛋白質(zhì)或多肽的最終數(shù)量和質(zhì)量。例如，常規(guī)分批或補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法常常導(dǎo)致產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞増殖、存活力以及目的蛋白質(zhì)和多肽的產(chǎn)生或穩(wěn)定性有不良影響的代謝廢物。盡管已經(jīng)努力改善分批或補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法中蛋白質(zhì)和多肽的生產(chǎn)，仍然有進(jìn)ー步改進(jìn)的需要。此外，也投入了大量的精力以發(fā)展用于培養(yǎng)細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的限定培養(yǎng)基(即由已知單個(gè)成分組合的、缺乏血清或其他動(dòng)物性副產(chǎn)物的培養(yǎng)基)。細(xì)胞在限定培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)特性相對(duì)于血清來源培養(yǎng)基中可能有很大差別。尤其需要發(fā)展出在限定培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生蛋白質(zhì)和多肽的改良系統(tǒng)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了在細(xì)胞培養(yǎng)物中大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)和/或多肽的改良系統(tǒng)。例如，本發(fā)明提供了利用培養(yǎng)基進(jìn)行商業(yè)規(guī)模(如500L或更多)培養(yǎng)的方法，所述培養(yǎng)基具有下列ー項(xiàng)或多項(xiàng)的特征i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM;ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2 ;iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2 ；iv)累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的比率為約O. 4至I ;或V)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺濃度的組合累積量大于約16mM。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理應(yīng)知道上文所用的“累積”是指，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入的特定成分的總量，包括在培養(yǎng)起始時(shí)加入的成分以及其后加入的成分。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，期待將培養(yǎng)期間的“補(bǔ)料”減少到最小，因此需要最大化培養(yǎng)起始時(shí)的量。當(dāng)然培養(yǎng)基成分在培養(yǎng)期間被代謝，因此如果在不同時(shí)間加入某些成分(例如全部于起始時(shí)加入和ー些通過補(bǔ)料加入)，則特定成分累積量相同的培養(yǎng)基的絕對(duì)水平會(huì)有所差異。根據(jù)本發(fā)明，此類培養(yǎng)基的應(yīng)用能提高蛋白質(zhì)產(chǎn)生的水平，并減少某些不良因子如銨鹽和/或乳酸鹽的蓄積。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道，本發(fā)明的培養(yǎng)基配方包括限定和非限定培養(yǎng)基。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，培養(yǎng)基為成分已知并受控的限定培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，培養(yǎng)方法包括將第一組培養(yǎng)條件變?yōu)榈诙M培養(yǎng)條件，從而改變細(xì)胞的代謝。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到其最大細(xì)胞密度約20-80%時(shí)實(shí)施這ー改變。在某些實(shí)施方案中，所述改變包括改變培養(yǎng)物的維持溫度(或溫度范圍)。備選地或額外地，本發(fā)明提供了調(diào)整的方法，以使培養(yǎng)物中乳酸鹽和/或銨鹽水平在達(dá)到峰值后隨時(shí)間而下降。在其他實(shí)施方案中，所述改變包括改變PH值、摩爾滲透壓濃度或化學(xué)物誘導(dǎo)物如鏈烷酸或其鹽的水平。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)物可任選添加營(yíng)養(yǎng)素和/或其他培養(yǎng)基成分，包括激素和/或其他生長(zhǎng)因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(終濃度通常極低的無機(jī)化合物)、氨基酸、脂質(zhì)或葡萄糖或其他能源。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，向培養(yǎng)基中添加化學(xué)誘導(dǎo)物如六亞甲基ニこ酰胺(“HMBA”)和丁酸鈉(“NaB”)是有利的。這些任選增補(bǔ)劑可在培養(yǎng)起始時(shí)加入，或者稍后加入以補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)素或以備他用。一般而言，期望根據(jù)本發(fā)明需要選擇初始培養(yǎng)基成分以使添加降至最低?？杀O(jiān)測(cè)本發(fā)明的多種培養(yǎng)條件，包括pH、細(xì)胞密度、細(xì)胞存活力、乳酸鹽水平、銨鹽水平、摩爾滲透壓濃度或表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的滴度。 附圖簡(jiǎn)述圖I顯示了利用抗⑶F-8細(xì)胞對(duì)搖瓶中培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基2的比較。圖2顯示了培養(yǎng)基I中抗⑶F-8細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)和存活力。圖3顯示了抗⑶F-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對(duì)照和無谷氨酰胺補(bǔ)料培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)。圖4顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對(duì)照和無谷氨酰胺補(bǔ)料培養(yǎng)條件下的細(xì)胞存活力。圖5顯示了抗⑶F-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對(duì)照和無谷氨酰胺補(bǔ)料培養(yǎng)條件下的銨鹽水平。圖6顯示了抗⑶F-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對(duì)照和無谷氨酰胺補(bǔ)料培養(yǎng)條件下的乳酸鹽水平。圖7顯示了在對(duì)照和無谷氨酰胺補(bǔ)料培養(yǎng)條件下的抗⑶F-8滴度。圖8顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對(duì)照和谷氨酰胺饑餓的補(bǔ)料培養(yǎng)條件下的細(xì)胞
山I又O圖9顯示了抗GDF-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對(duì)照和谷氨酰胺饑餓的補(bǔ)料培養(yǎng)條件下的細(xì)胞存活力。

圖10顯示了抗⑶F-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對(duì)照和谷氨酰胺饑餓的培養(yǎng)條件下的銨鹽水平。圖11顯示了抗⑶F-8細(xì)胞培養(yǎng)物在對(duì)照和谷氨酰胺饑餓的培養(yǎng)條件下的乳酸鹽水平。圖12顯示了在對(duì)照和谷氨酰胺饑餓的培養(yǎng)條件下的抗⑶F-8滴度。圖13顯示了培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基2中抗⑶F-8細(xì)胞的鐵劑量應(yīng)答。圖14顯示了補(bǔ)充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度。圖15顯示了補(bǔ)充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物中的細(xì)胞存活力。圖16顯示了補(bǔ)充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物中的抗Lewis Y滴度。
圖17顯示了補(bǔ)充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物中的乳酸鹽水平。圖18顯示了補(bǔ)充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物中的銨鹽水平。圖19顯示了補(bǔ)充了谷氨酸和谷氨酰胺的培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。圖20顯示了抗Lewis Y細(xì)胞的細(xì)胞密度。每一曲線為相同條件下生長(zhǎng)的兩只搖瓶的平均值。圖21顯示了抗Lewis Y細(xì)胞的細(xì)胞存活力。每一曲線為相同條件下生長(zhǎng)的兩只搖瓶的平均值。圖22顯示了抗Lewis Y培養(yǎng)物的平均滴度。每一曲線為相同條件下生長(zhǎng)的兩只搖瓶的平均值。圖23顯示了抗Lewis Y細(xì)胞的銨鹽水平。每一曲線為相同條件下生長(zhǎng)的兩只搖 瓶的平均值。圖24顯示了補(bǔ)料分批培養(yǎng)中所用的葉輪竄動(dòng)。圖25顯示了多種試驗(yàn)條件下抗⑶F-8細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。圖26顯示了多種試驗(yàn)條件下抗⑶F-8細(xì)胞的存活力。圖27顯示了多種試驗(yàn)條件下的抗⑶F-8滴度。圖28顯示了多種試驗(yàn)條件下抗⑶F-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。圖29顯示了多種試驗(yàn)條件下抗⑶F-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。圖30顯示了多種試驗(yàn)條件下抗⑶F-8細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。圖31顯示了多種試驗(yàn)條件下的抗⑶F-8滴度。圖32顯示了多種試驗(yàn)條件下抗⑶F-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。圖33顯示了多種試驗(yàn)條件下抗⑶F-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。圖34顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。圖35顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞存活力。圖36顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。圖37顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。圖38顯示了在不同水平含谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8培養(yǎng)物的谷氨酰胺水平。圖39顯示了含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中的抗GDF-8滴度。圖40顯示了在含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺的改良培養(yǎng)基9中抗GDF-8培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。圖41顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。圖42顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。
圖43顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。圖44顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的谷氨酰胺水平。圖45顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的谷氨酸水平。圖46顯示了含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中的抗GDF-8滴度。圖47顯示了在含不同水平天門冬酰胺和半胱氨酸的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。圖48顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中抗⑶F-8細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。
圖49顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中抗⑶F-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。圖50顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中抗⑶F-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。圖51顯示了在含不同水平氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中抗GDF-8培養(yǎng)物的谷氨酰胺水平。圖52顯示了含不同水平氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中的抗⑶F-8滴度。圖53顯示了在含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養(yǎng)基中抗⑶F-8細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。圖54顯示了在含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養(yǎng)基中抗⑶F-8培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。圖55顯示了在含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養(yǎng)基中抗⑶F-8培養(yǎng)物的銨鹽水平。圖56顯示了含不同水平維生素、微量元素E和鐵的培養(yǎng)基中的抗⑶F-8滴度。圖57顯示了在培養(yǎng)基1、3和9中抗⑶F_8細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。圖58顯示了培養(yǎng)基I、3和9中的抗⑶F_8滴度。圖59顯示了含不同水平谷氨酰胺以及含不同水平谷氨酰胺和天門冬酰胺組合總量時(shí)的外推抗GDF-8滴度。圖60顯示了在多種測(cè)試培養(yǎng)基條件下抗A β細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。圖61顯示了在多種測(cè)試培養(yǎng)基條件下抗A β細(xì)胞的存活力。圖62顯示了在多種測(cè)試培養(yǎng)基條件下抗A β培養(yǎng)物的乳酸鹽水平。圖63顯示了在多種測(cè)試培養(yǎng)基條件下抗A β培養(yǎng)物的銨鹽水平。圖64顯示了多種測(cè)試培養(yǎng)基條件下的抗A β滴度。圖65顯示了在多種測(cè)試培養(yǎng)基條件下抗A β培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。圖66顯示了在多種試驗(yàn)條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)。圖67顯示了在多種試驗(yàn)條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞的存活力。圖68顯示了在多種試驗(yàn)條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞培養(yǎng)物中的殘留葡萄糖。圖69顯示了在多種試驗(yàn)條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞培養(yǎng)物中的谷氨酰胺水平。圖70顯示了在多種試驗(yàn)條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞培養(yǎng)物中的乳酸鹽濃度。
圖71顯示了在多種試驗(yàn)條件下表達(dá)TNFR-Ig的細(xì)胞培養(yǎng)物中的銨鹽水平。圖72顯示了多種試驗(yàn)條件下的TNFR-Ig相對(duì)滴度。圖73顯示了生長(zhǎng)于6000L和IL生物反應(yīng)器內(nèi)的抗⑶F_8細(xì)胞的細(xì)胞密度。圖74顯示了生長(zhǎng)于6000L和IL生物反應(yīng)器內(nèi)的抗⑶F_8細(xì)胞的滴度。圖75顯示了生長(zhǎng)于6000L和IL生物反應(yīng)器內(nèi)的抗⑶F_8細(xì)胞的乳酸鹽水平。圖76顯示了生長(zhǎng)于6000L和IL生物反應(yīng)器內(nèi)的抗⑶F_8細(xì)胞的銨鹽水平。定義“約”、“大約”當(dāng)此處所用的術(shù)語(yǔ)“約”和“大約”用于ー種或多種具體細(xì)胞培養(yǎng)條件時(shí)，是指與所述培養(yǎng)條件下指定的參考值相似的一系列值。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“約” 是指處在所述培養(yǎng)條件下指定參考值的百分之25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1或更小范圍的系列值?！鞍被帷?此處所用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”，指用于常規(guī)制備多肽的20種天然氨基酸中的任意ー種，或所述氨基酸的類似物或衍生物。本發(fā)明中于培養(yǎng)基內(nèi)向細(xì)胞培養(yǎng)物提供氨基酸。培養(yǎng)基中所含的氨基酸可為鹽或水合物形式。“抗體”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”，是指免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，如Fab或F (ab' ) 2片段，其含有一個(gè)或多個(gè)能與抗原特異性結(jié)合(免疫反應(yīng))的抗原結(jié)合位點(diǎn)。此處所用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”和“單克隆抗體組合物”，是指僅含有ー種能與特定抗原表位發(fā)生免疫反應(yīng)的抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子克隆群，而術(shù)語(yǔ)“多克隆抗體”和“多克隆抗體組合物”是指含有多種能與某一特定抗原相互作用的抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體分子群。單克隆抗體的定義既包括了常規(guī)技術(shù)得到的克隆分子，也包括了通過操作或變異特定殘基得到的指定序列分子，如人源化抗體?！胺峙囵B(yǎng)此處所用的術(shù)語(yǔ)“分批培養(yǎng)”是ー種細(xì)胞培養(yǎng)方法，其中所有最終將用于培養(yǎng)細(xì)胞的成分均于培養(yǎng)過程起始時(shí)加入，包括培養(yǎng)基(見下文“培養(yǎng)基”定義)和細(xì)胞本身。一般在某一點(diǎn)終止分批培養(yǎng)，收集培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或成分，并任選純化之?！吧锓磻?yīng)器”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“生物反應(yīng)器”是指用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)的任何容器。只要能用于培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞，生物反應(yīng)器可為任意大小。一般而言，生物反應(yīng)器為至少 I 升，也可為 10、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10，000、12，0000 升或更大，或其間任意容積。一般在培養(yǎng)期間調(diào)控生物反應(yīng)器的內(nèi)部條件，包括但不僅限于pH和溫度。生物反應(yīng)器可以由適于容納在本發(fā)明培養(yǎng)條件下懸浮于培養(yǎng)基內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物的任何材料構(gòu)成，包括玻璃、塑料或金屬。此處所用的術(shù)語(yǔ)“生產(chǎn)生物反應(yīng)器”是指用于生產(chǎn)目的多肽或蛋白質(zhì)的終末生物反應(yīng)器。大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)生物反應(yīng)器的容積ー般至少為500升，也可為1000、2500、5000、8000、10，000、12，0000升或更大，或其間任意容積。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)了解井能夠選擇合適的生物反應(yīng)器用于實(shí)施本發(fā)明?！凹?xì)胞密度”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞密度”是指在指定體積培養(yǎng)基中存在的細(xì)胞數(shù)目?！凹?xì)胞存活力”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞存活力”是指培養(yǎng)物中的細(xì)胞在ー組指定培養(yǎng)條件或試驗(yàn)變量下存活的能力。此處所用的術(shù)語(yǔ)也指在某一特定時(shí)間內(nèi)存活的那部分細(xì)胞與該時(shí)間培養(yǎng)物中活細(xì)胞和死細(xì)胞總數(shù)之間的關(guān)系?！芭囵B(yǎng)物”、“細(xì)胞培養(yǎng)物”和“哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物”:此處所用的這些術(shù)語(yǔ)是指在適于細(xì)胞群存活和/或生長(zhǎng)的條件下，懸浮于培養(yǎng)基(見下文“培養(yǎng)基”定義)內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞群。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，此處所用的這些術(shù)語(yǔ)也指包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞群和細(xì)胞群懸浮于其中的培養(yǎng)基的組合?！把a(bǔ)料分批培養(yǎng)”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“補(bǔ)料分批培養(yǎng)”是在培養(yǎng)過程起始后的某ー時(shí)間向培養(yǎng)物內(nèi)加入額外成分的細(xì)胞培養(yǎng)方法。所提供的成分一般包括在培養(yǎng)過程中已消耗的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)添加剤。一般在某一點(diǎn)終止補(bǔ)料分批培養(yǎng)，收集培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或成分，并任選純化之?！捌巍?此處所用的術(shù)語(yǔ)“片段”指多肽并且被定義為給定多肽中特有的或特征性的任意分離部分。此處所用的該術(shù)語(yǔ)也指給定多肽中保留至少部分全長(zhǎng)多肽活性的任意分離部分。優(yōu)選保留的活性部分至少為全長(zhǎng)多肽活性的10%。更優(yōu)選保留的活性部分至少為全長(zhǎng)多肽活性的20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。更優(yōu)選保留的活性部分至少為全長(zhǎng)多肽活性的95%、96%、97%、98%或99%。最優(yōu)選保留的活性部分為全長(zhǎng)多肽活性的100%。此處所用的該術(shù)語(yǔ)也指包括全長(zhǎng)多肽中至少ー個(gè)確定序列元件的指定多肽的任意部分。優(yōu)選該序列元件跨越全長(zhǎng)多肽的至少4-5個(gè)，更優(yōu)選至少約10、15、20、25、30、35、40、45、50或 更多氨基酸?！盎颉?此處所用的術(shù)語(yǔ)“基因”指DNA或RNA的任意核苷酸序列，其中至少某些部分編碼分離的在細(xì)胞代謝或發(fā)育的某些方面發(fā)揮作用的終產(chǎn)物，一般為(但不僅限于)多肽。該術(shù)語(yǔ)并非僅指編碼多肽或其他分離終產(chǎn)物的編碼序列，還包括位于編碼序列之前或之后、調(diào)節(jié)基礎(chǔ)表達(dá)水平的區(qū)域(見下文“遺傳控制元件”定義)，以及單個(gè)編碼區(qū)段(“外顯子，，)之間的插入序列(“內(nèi)含子”)。“遺傳控制元件”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“遺傳控制元件”，是指調(diào)節(jié)與其有效連接的基因表達(dá)的任意序列元件。遺傳控制元件通過提高或降低表達(dá)水平而發(fā)揮功能，可位于編碼序列之前、之中或之后。通過調(diào)節(jié)如轉(zhuǎn)錄起始、延伸或終止；mRNA剪接、mRNA編輯、mRNA穩(wěn)定性、mRNA細(xì)胞內(nèi)定位；翻譯起始、延伸或終止；或基因表達(dá)的任何其他階段，遺傳控制元件可以作用于基因表達(dá)的任意階段。遺傳控制元件可以單獨(dú)作用或彼此聯(lián)合作用?！半s交瘤”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“雜交瘤”，是指將免疫來源的永生細(xì)胞與抗體產(chǎn)生細(xì)胞融合而得到的細(xì)胞。所產(chǎn)生的雜交瘤為能產(chǎn)生抗體的永生細(xì)胞。用于產(chǎn)生雜交瘤的單個(gè)細(xì)胞可來自任何哺乳動(dòng)物，包括但不僅限于大鼠、豬、兔、綿羊、豬、山羊和人。該術(shù)語(yǔ)也包括三體瘤細(xì)胞系，后者為人細(xì)胞和鼠骨髓瘤細(xì)胞系融合產(chǎn)生的異雜交骨髓瘤融合體的子代，再與漿細(xì)胞融合的產(chǎn)物。此外,該術(shù)語(yǔ)還包括任何產(chǎn)生抗體的永生雜交細(xì)胞系,例如四體瘤(見如 Milstein 等人·，Nature, 537:3053 (1983))?！熬C合活細(xì)胞密度”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“綜合活細(xì)胞密度”，是指在培養(yǎng)過程中活細(xì)胞的平均密度乘以培養(yǎng)持續(xù)的時(shí)間量。假設(shè)產(chǎn)生多肽和/或蛋白質(zhì)的量與培養(yǎng)過程中存在的活細(xì)胞數(shù)目成正比，則綜合活細(xì)胞密度是估計(jì)培養(yǎng)過程中產(chǎn)生多肽和/或蛋白質(zhì)量的有カエ具?！芭囵B(yǎng)基”、“細(xì)胞培養(yǎng)基”:此處所用的這些術(shù)語(yǔ)是指含有滋養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)素的溶液。一般而言，這些溶液提供細(xì)胞基本生長(zhǎng)和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、維生素、能源、脂質(zhì)和微量元素。溶液中也可含有促進(jìn)最低速率以上生長(zhǎng)和/或存活的成分，包括激素和生長(zhǎng)因子。所述溶液優(yōu)選配制為適于細(xì)胞存活和増殖的PH和鹽濃度。培養(yǎng)基也可為“限定培養(yǎng)基” 一一不含蛋白質(zhì)、水解產(chǎn)物或未知組合物成分的無血清培養(yǎng)基。限定培養(yǎng)基中不含有動(dòng)物來源的成分，并且其所有成分均具有已知的化學(xué)結(jié)構(gòu)。“代謝廢物”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“代謝廢物”是指細(xì)胞培養(yǎng)物在正?；蚍钦４x過程中產(chǎn)生的、對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的某些方面(特別是對(duì)所需重組多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性)具有不良作用的化合物。例如，代謝廢物可能對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)或存活力有不良作用，可能減少重組多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，可能改變表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性、糖基化或其他翻譯后修飾，可能對(duì)細(xì)胞和/或重組多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的任意其他方面具有不良作用。代謝廢物的實(shí)例包括糖代謝產(chǎn)生的乳酸鹽，以及谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的銨鹽。本發(fā)明的目的之一在于減慢哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中代謝廢物的生成，減少或甚至杜絕哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的代謝廢物。“摩爾滲透壓濃度”和“重量摩爾滲透壓濃度”“重量摩爾滲透壓濃度”是對(duì)水溶液中溶解的溶質(zhì)顆粒滲透壓的測(cè)量。溶質(zhì)顆粒包括離子和非離子分子。重量摩爾滲透壓濃度表示為溶于Ikg溶液中滲透活性顆粒的濃度(即滲透壓摩爾)(38° C的ImOsm/kg H2O相當(dāng)于19mmHg滲透壓)。與之相反，“摩爾滲透壓濃度”是指溶于I升溶液中溶質(zhì)顆粒的數(shù) 目。此處所用的簡(jiǎn)寫“ mOsm”指“毫滲透壓摩爾/kg溶液”。“灌流式培養(yǎng)”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“灌流式培養(yǎng)”為ー種在培養(yǎng)過程起始后，持續(xù)或半持續(xù)地向培養(yǎng)物中供以額外成分的細(xì)胞培養(yǎng)方法。所提供的成分一般包括在培養(yǎng)過程中消耗的細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)添加剤。一般在持續(xù)或半持續(xù)的基礎(chǔ)上收集培養(yǎng)基中的細(xì)胞和/或成分部分，并任選純化之?！岸嚯摹?此處所用的術(shù)語(yǔ)“多肽”是指通過肽鍵相連的順序氨基酸鏈。該術(shù)語(yǔ)用以指任意長(zhǎng)度的氨基酸鏈，然而本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道該術(shù)語(yǔ)不僅指代長(zhǎng)鏈，也可用于指含有通過肽鍵相連的2個(gè)氨基酸的最短鏈?！暗鞍踪|(zhì)”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”是指作用如離散單位的ー個(gè)或多個(gè)多肽。如果單個(gè)多肽即為離散的功能単位，且不需要與其他多肽的持久物理締合以形成該獨(dú)立的功能単位，則此處術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用。如果該離散功能単位由多于ー個(gè)彼此物理締合的多肽組成，則此處所用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”指物理偶聯(lián)的并且共同作為離散単位起作用的多個(gè)多肽?！爸亟M表達(dá)多肽”和“重組多肽”:此處所用的這些術(shù)語(yǔ)是指從經(jīng)遺傳工程修飾以表達(dá)該多肽的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中表達(dá)的多肽。重組表達(dá)多肽可以與哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)的多肽相同或相似。重組表達(dá)多肽也可為宿主細(xì)胞的外源物，即異源于哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞正常表達(dá)的多肽?；蛘咧亟M表達(dá)多肽為嵌合多肽，即部分多肽含有與哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)的多肽相同或相似的氨基酸序列，而其他部分為宿主細(xì)胞外源物?！敖臃N”:此處所用的術(shù)語(yǔ)“接種”是指將細(xì)胞培養(yǎng)物供予生物反應(yīng)器或另一容器的方法。之前細(xì)胞可在另一生物反應(yīng)器或容器中増殖。或者細(xì)胞為冰凍并于供予生物反應(yīng)器或容器之前解凍。該術(shù)語(yǔ)用于指任意數(shù)目細(xì)胞，包括單個(gè)細(xì)胞?！暗味取?此處所用的術(shù)語(yǔ)“滴度”是指由哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)生的重組表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的總量除以給定量的培養(yǎng)基體積。滴度一般用每毫升培養(yǎng)基毫克多肽或蛋白質(zhì)的單位表示。某些優(yōu)選實(shí)施方案的詳述
本發(fā)明提供了通過細(xì)胞培養(yǎng)物生成蛋白質(zhì)和/或多肽的改良系統(tǒng)。具體而言，本發(fā)明提供了使一種或多種對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活力和/或蛋白質(zhì)產(chǎn)生或質(zhì)量有害的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生最小化的系統(tǒng)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞培養(yǎng)物為分批或補(bǔ)料分批培養(yǎng)。其他某些本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案將詳述于下文。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道多種對(duì)這些優(yōu)選實(shí)施方案的修改均處于所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。權(quán)利要求書及其等同物定義了本發(fā)明的范圍，并不限于也不應(yīng)當(dāng)限于此處對(duì)某些優(yōu)選實(shí)施方案的說明。根據(jù)本發(fā)明，可以生成任何能在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的多肽。該多肽表達(dá)自宿主細(xì)胞內(nèi)源性基因，或表達(dá)自通過基因工程引入宿主細(xì)胞中的基因。該多肽可為天然存在的多肽，也可以具有人工操作或選擇的序列。經(jīng)加工的多肽可為天然存在的其他單個(gè)多肽片段組裝而成，也可包括一個(gè)或多個(gè)并非天然存在的片段。能夠根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的多肽的選擇，是基于其目的生物或化學(xué)活性。例如，本發(fā)明可用于表達(dá)任意藥物或商業(yè)相關(guān)的酶、受體、抗體、激素、調(diào)節(jié)因子、抗原、結(jié)合劑等。 抗體考慮到目前應(yīng)用或研究中的用作藥物或其他商業(yè)物質(zhì)的抗體數(shù)目之巨，本發(fā)明的抗體生產(chǎn)具有特別意義?？贵w為能特異性結(jié)合特定抗原的蛋白質(zhì)。任何表達(dá)于宿主細(xì)胞的抗體都可以用于本發(fā)明。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)的抗體為單克隆抗體。在另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，單克隆抗體為嵌合抗體。嵌合抗體含有來源于多于ー種生物的氨基酸片段。嵌合抗體分子可包括，例如來自小鼠、大鼠或其他物種抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和人恒定區(qū)。制備嵌合抗體的多種方法已被描述。見如Morrison等人，Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 81,6851 (1985) ; Takeda 等人，Nature 314，452 (1985)，Cabilly 等人，美國(guó)專利號(hào)4, 816，567 ；Boss等人，美國(guó)專利號(hào)4，816，397 ；Tanaguchi等人，歐洲專利出版號(hào)EP171496 ;歐洲專利出版號(hào)0173494，英國(guó)專利GB 2177096B。在另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，單克隆抗體為人抗體，如通過應(yīng)用核糖體展示或噬菌體展示文庫(kù)得到(見如Winter等人，美國(guó)專利號(hào)6，291，159和Kawasaki,美國(guó)專利號(hào)5，658，754)，或利用天然抗體基因失活并被人抗體基因功能性替代、而天然免疫系統(tǒng)的其他成分完好的異種移植物種得到(見如Kucherlapati等人，美國(guó)專利號(hào)6，657，103)。在另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，單克隆抗體為人源化抗體。人源化抗體為嵌合抗體，其中大部分氨基酸殘基來自人抗體，因此將施用于人受試者時(shí)的潛在免疫反應(yīng)降至最低。人源化抗體中互補(bǔ)性決定區(qū)域的氨基酸至少部分被非人物種的殘基所取代，后者可賦予所需的抗原特異性或親和力?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的若干技術(shù)中的任意ー種制備此類改變的免疫球蛋白分子(例如 Teng 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.，80，7308-7312 (1983) ；Kozbor等人,Immunology Today, 4, 7279(1983) ；01sson 等人,Meth.Enzymol. , 92, 3-16(1982))，并優(yōu)選根據(jù)PCT出版號(hào)W092/06193或EP0239400的教導(dǎo)制備，均在此處引用作為參考)。人源化抗體可以由如 Scotgen Limited, 2Holly Road, Twickenham, Middlesex, GreatBritain 商業(yè)化制備。更多參考見 Jones 等人，Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann 等人,Nature332 :323-329 (1988)；以及 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593-596 (1992)，均在此處引用作為參考。在另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，上述單克隆、嵌合或人源化抗體中可能含有自然界任何物種的任何抗體中都不天然存在的氨基酸殘基。這些外源性殘基可用于，如為單克隆、嵌合或人源化抗體帶來新的或改良的特異性、親和カ或效應(yīng)物功能。在另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，上述抗體可綴合于藥物用于全身性藥物治療，例如毒素、低分子量細(xì)胞毒藥物、生物應(yīng)答調(diào)節(jié)物和放身寸性核素(見如 Kunz 等人，Calicheamicin derivative-carrier coniugates,US20040082764A1)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該抗體特異性結(jié)合淀粉樣前體蛋白的Αβ片段或淀粉樣斑塊的其他成分，且可用于對(duì)抗Alzheimer’ s病特征性大腦中淀粉樣斑塊的聚集(見如美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng) 60/636，684)。在另ー實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體針對(duì)增殖性疾病如癌癥的靶細(xì)胞和/或組織中表達(dá)的細(xì)胞表面抗原。在某一實(shí)施方案中，該抗體為IgGl抗Lewis Y抗體。Lewis Y為糖抗原，其結(jié)構(gòu)為2Gal β I — 4 [ Fucql— 3]GlcNac β I —3R(Abe 等人(1983) J. Biol.Chem. ,25811793-11797)。LewisY抗原表達(dá)于60%至90%的人上皮腫瘤(包括乳腺、結(jié)腸、 肺和前列腺上皮腫瘤)的表面，其中至少40%過量表達(dá)該抗原，而在正常組織中限量表達(dá)。為靶定Ley并有效靶定腫瘤，最好需要對(duì)該抗原有專ー特異性的抗體。因此，優(yōu)選本發(fā)明的抗Lewis Y抗體不與I型結(jié)構(gòu)(即乳糖系列血型(Lea和Leb))發(fā)生交叉反應(yīng)，且優(yōu)選不結(jié)合其他2型表位(即新乳糖結(jié)構(gòu))如Lex和H-型2型結(jié)構(gòu)。優(yōu)選的抗Lewis丫抗體的實(shí)例命名為111135193(見美國(guó)專利號(hào)6，310，185 ;6，518，415 ;5，874，060，在此處整體引用作為參考)。人源化抗體hu3S193(Attia，M.A.等人· 1787-1800)經(jīng)CDR移植從3S193(Kitamura, K.，12957-12961)產(chǎn)生，3S193為針對(duì)腺癌細(xì)胞產(chǎn)生的對(duì)Ley具有高度特異性的鼠單克隆抗體。HU3S193不僅保留了 3S193對(duì)Ley的特異性，而且獲得了介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(以下稱為CDC)以及抗體依賴性細(xì)胞毒作用(以下稱為ADCC)的能力(Attia, Μ. A.等人1787-1800)。該抗體靶定裸鼠中表達(dá)Ley的異種移植物，如利用1251、IllIn或18F，以及需要螯合劑的其他放射性標(biāo)記如lllIn、99mTc或90Y標(biāo)記的hu3S193進(jìn)行生物分布研究所示(Clark等人4804-4811)。在另ー實(shí)施方案中，抗體為稱為Myo29、Myo28及Myo22的人抗⑶F_8抗體以及由其衍生的抗體和抗原結(jié)合片段之一。這些抗體能高親和カ結(jié)合成熟⑶F-8，抑制⑶F-8的體外和體內(nèi)活性(如抑制ActRIIB結(jié)合和報(bào)告基因檢測(cè)所示)，還可抑制與骨骼肌重量和骨密度負(fù)調(diào)節(jié)相關(guān)的⑶F-8活性。見如Veldman等人，美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0040142382。受體可有效作為藥物和/或商業(yè)物質(zhì)的另ー類多肽包括受體。受體一般為通過識(shí)別細(xì)胞外信號(hào)配體而發(fā)揮作用的跨膜糖蛋白。除配體識(shí)別結(jié)構(gòu)域外，受體一般還具有蛋白質(zhì)激酶結(jié)構(gòu)域，后者在結(jié)合受體后通過磷酸化細(xì)胞內(nèi)靶分子而起始信號(hào)途徑，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)育或代謝改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，修飾目的受體以移除其跨膜和/或細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，而可任選以IgG結(jié)構(gòu)域取代之。在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明生產(chǎn)的受體為受體酪氨酸激酶(RTK)。RTK家族包括對(duì)眾多細(xì)胞類型中多種功能具有關(guān)鍵作用的受體(見如Yarden 和 Ullrich, Ann. Rev. Biochem. 57:433-478, 1988 ；Ullrich 和 Schlessinger, Cell61:243-254, 1990，此處引用作為參考)。RTK的非限制性實(shí)例包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)受體家族成員、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)受體家族成員、血小板衍生生長(zhǎng)因子(TOGF)受體、攜帯免疫球蛋白和EGF同源結(jié)構(gòu)域-1 (TIE-I)及TIE-2受體的酪氨酸激酶(Sato等人，Nature376(6535) : 70-74 (1995)，此處引用作為參考)以及c-Met受體，其中一些似乎能直接或間接促進(jìn)血管形成(Mustonen 和 Alitalo, J. Cell Biol. 129:895-898，1995)。其他RTK的非限制性實(shí)例包括胎肝激酶I (FLK-I)(有時(shí)稱為含激酶插入結(jié)構(gòu)域的受體(KDR)(Terman等人，0ncogene6:1677-83, 1991)或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2 (VEGFR-2))、fms 樣酪氨酸激酶-I (Flt-I) (DeVries 等人 Science 255; 989-991，1992 ；Shibuya 等人，Oncogene 5:519-524，1990)，有時(shí)稱為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體I (VEGFR-I)、神經(jīng)氈蛋白-I、內(nèi)皮糖蛋白、內(nèi)皮唾液酸蛋白和Axl。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選表達(dá)的其他受體。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的腫瘤壞死因子抑配方如腫瘤壞死因子α和β受體形式(TNFR-1，發(fā)表于1991年3月20日的ΕΡ417，563 ；以及 TNFR-2，發(fā)表于 1991 年 3 月 20 日的 EP 417，014)(綜述見 Naismith 和 Sprang, JInflamm. 47 (1-2) : 1-7 (1995-96)，此處引用作為參考)。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施方案，腫瘤壞死因子抑配方包括可溶性TNF受體及優(yōu)選TNFR-Ig。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明優(yōu)選的TNF抑配方為TNFRI和TNFRII的可溶形式，以及可溶性TNF結(jié)合蛋白質(zhì)。在另ー實(shí)施方案中，該TNFR-Ig融合物為TNFR:Fc，此處所用的該術(shù)語(yǔ)指“依那西普(etanerc印t) ”，其為兩分子 p75 TNF- α受體胞外部分的ニ聚體，每ー分子由人IgG亞型I的Fe部分的235個(gè)氨基酸組成。生長(zhǎng)因子和其他信號(hào)分子可有效作為藥物和/或商業(yè)物質(zhì)的另ー類多肽包括生長(zhǎng)因子和其他信號(hào)分子。生長(zhǎng)因子一般為糖蛋白，其由細(xì)胞分泌并結(jié)合和活化其他細(xì)胞上的受體，起始受體細(xì)胞中的代謝或發(fā)育改變。在一個(gè)實(shí)施方案中，目的蛋白質(zhì)為包括ActRIIB受體胞外結(jié)構(gòu)域和抗體 Fe 部分的 ActRIIB 融合多妝(見如 Wolfman 等人，ActRIIB fusion polypeptides anduses therefor, US2004/0223966A1)。在另ー實(shí)施方案中，生長(zhǎng)因子為修飾的⑶F-8前肽、見如 ffolfman #A · , Modifed and stabilized GDF propeptides and uses thereof，US2003/0104406A1)?；蛘吣康牡鞍诪楹瑸V泡素抑制素結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)(見如Hill等人,GASPl:a follistatin domain containinR protein,US2003/0162714A1, Hill 等人，GASPl:a follistatin domain containinR protein,US 2005/0106154A1, Hill 等人,Follistatin domain containinR proteins, US2003/0180306A1)。哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)因子和其他信號(hào)分子的非限制性實(shí)例包括細(xì)胞因子；表皮生長(zhǎng)因子(EGF);血小板衍生生長(zhǎng)因子(I3DGF);成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)如aFGF和bFGF ;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)如 TGF-α 和 TGF-β，包括TGF-β 1、TGF_β 2、TGF_β 3、TGF_β 4或TGF-β 5 ；胰島素樣生長(zhǎng)因子I和IKIGF-I和IGF-II) ;des (1-3)-IGF-I (腦IGF-I)，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白AD蛋白質(zhì)如⑶_3、⑶_4、⑶-8和⑶-19 ;紅細(xì)胞生成素；骨生成誘導(dǎo)因子；免疫毒素；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP);干擾素如干擾素α、β和Y ;集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF ;白介素(TL)如IL-I至IL-IO ;腫瘤壞死因子(TNF) α和β ;胰島素A鏈；胰島素B鏈；胰島素原；促卵泡激素；降鈣素；黃體生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子VIIIC、因子IX、組織因子和馮維勒布蘭德因子；抗凝因子如蛋白C ;心鈉素；肺表面活性物質(zhì)；纖溶酶原激活物如尿激酶或人尿或組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子(t-PA)；蛙皮素；凝血酶、造血生長(zhǎng)因子；腦啡肽酶；RANTES(調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子)；人巨噬細(xì)胞炎癥蛋白質(zhì)(MIP-1-α);米勒抑制物質(zhì)；松弛素A-鏈；松弛素B-鏈；松弛素原；小鼠促性腺激素相關(guān)肽；神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子如骨源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3、4、5或6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或神經(jīng)生長(zhǎng)因子如NGF-β。一名本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)了解可根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的其他生長(zhǎng)因子或信號(hào)分子。G —蛋白偶聯(lián)受體可有效作為藥物和/或商業(yè)物質(zhì)的另ー類多肽包括生長(zhǎng)因子和/或其他信號(hào)分子。G —蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)為具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)。一旦配體與GPCR結(jié)合，將在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，從而使細(xì)胞的生物或生理性質(zhì)發(fā)生改變。GPCR以及G蛋白和效應(yīng)物(受G蛋白調(diào)控的胞內(nèi)酶和通道)，是將細(xì)胞內(nèi)第二信使?fàn)顟B(tài)和細(xì)胞外輸入相聯(lián)系的調(diào)節(jié)信號(hào)系統(tǒng)的組分。這些基因和基因產(chǎn)物是疾病的潛在誘因。
視紫紅質(zhì)基因和V2血管加壓素受體基因的特定缺陷會(huì)導(dǎo)致多種形式的常染色體顯性和常染色體隱性視網(wǎng)膜色素變性、腎性尿崩癥。這些受體對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周生理過程都至關(guān)重要。GPCR蛋白質(zhì)超家族目前包括250種以上的旁系同源物(基因復(fù)制(或其他過程)產(chǎn)生的變體受體)，與之對(duì)應(yīng)的直系同源物為不同物種的相同受體。該超家族可分為5個(gè)家族家族I，以視紫紅質(zhì)和β 2腎上腺素受體為代表的受體，目前具有200以上的獨(dú)特成員；家族II，最近表征的甲狀旁腺激素/降鈣素/膜泌素受體家族；家族III，哺乳動(dòng)物代謝型谷氨酸受體家族；家族IV，cAMP受體家族，在化學(xué)趨化作用和盤基網(wǎng)柄菌(D. discoideum)的發(fā)育中具有重要作用；以及家族V，真菌交配信息素受體如STE2。GPCR包括生物胺、炎癥脂質(zhì)介質(zhì)、肽激素和感覺信號(hào)介質(zhì)的受體。當(dāng)受體結(jié)合其細(xì)胞外配體時(shí)GPCR被活化。配體ー受體相互作用引發(fā)的GPCR構(gòu)象改變，會(huì)影響G蛋白對(duì)GPCR胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力。這使得GTP以增強(qiáng)的親和カ結(jié)合于G蛋白。由GTP活化G蛋白，引發(fā)了 G蛋白α亞基與腺苷酸環(huán)化酶或其他第二信使分子產(chǎn)生物間的相互作用。這ー相互作用調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶的活性，繼而調(diào)節(jié)了第二信使分子cAMP的產(chǎn)生。cAMP調(diào)節(jié)其他細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的磷酸化和活化。備選地，GPCR的活性也可上調(diào)或下調(diào)其他第二信使分子如cGMP或eicosinoid的細(xì)胞水平。GTPase水解GTP失活G蛋白α亞基,隨后α、β和γ亞基重新組合。然后異三聚體G蛋白從腺苷酸環(huán)化酶或其他第二信使分子產(chǎn)生物上脫落下來。也可通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域或環(huán)的磷酸化調(diào)節(jié)GPCR的活性。谷氨酸受體構(gòu)成了ー組在神經(jīng)傳導(dǎo)中很重要的GPCR。谷氨酸為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要神經(jīng)遞質(zhì)，在神經(jīng)元可塑性、認(rèn)知、記憶、學(xué)習(xí)和某些神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、中風(fēng)和神經(jīng)變性中起重要作用(Watson, S.和 S. Arkinstall (1994) The G-Protein Linked ReceptorFacts Book, Academic Press, San Diego CA, 130-132 頁(yè))。谷氨酸的這些作用主要通過兩類不同的受體介導(dǎo)，即離子型和代謝型。離子型受體含有內(nèi)源性陽(yáng)離子通道井介導(dǎo)谷氨酸的快速激動(dòng)性作用。代謝型受體為調(diào)節(jié)性受體，通過抑制鈣依賴性鉀電導(dǎo)并同時(shí)抑制和加強(qiáng)離子型受體的興奮性傳導(dǎo)，提高神經(jīng)元的膜興奮性。代謝型受體基于激動(dòng)劑藥理學(xué)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可分為5個(gè)亞類，并廣泛分布于腦組織中。血管活性腸肽(VIP)家族為ー組也通過GPCR介導(dǎo)作用的相關(guān)多肽。該家族的核心成員為VIP本身、胰泌素和生長(zhǎng)激素釋放因子(GRF) JIP具有廣泛的生理作用，包括松弛平滑肌、刺激或抑制多種組織中的分泌、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中多種免疫細(xì)胞活性以及多種興奮性或抑制性活性。胰泌素刺激胰腺和腸中酶和離子的分泌，在腦中也少量存在。GRF為重要的神經(jīng)內(nèi)分泌物質(zhì)，調(diào)節(jié)腺垂體中生長(zhǎng)激素的合成和釋放(Watson, S.和S. Arkinstall同上，278-283 頁(yè))。配體結(jié)合GPCR后，構(gòu)象變化傳遞到G蛋白，導(dǎo)致α亞基將結(jié)合的GDP分子更換為GTP分子，并從β、Y亞基上解離下來。α亞基的GTP結(jié)合形式一般作用如效應(yīng)物調(diào)節(jié)部分，導(dǎo)致第二信使的產(chǎn)生，如環(huán)化AMP (如通過腺苷酸環(huán)化酶的活化)、甘油ニ酯或肌醇磷酸。已知人有多于20種不同類型的α亞基，與較少類型的β和Y亞基相連。哺乳動(dòng)物G蛋白的實(shí)例包括Gi、Go、Gq、Gs和Gt。G蛋白詳述于Lodish H.等人Molecular CellBiology 中(Scientific American Books Inc. , New York, N. Y.，1995),其內(nèi)容在此處引用作為參考。GPCR為藥物作用和研發(fā)的主要靶位。實(shí)際上，目前已知藥物的一半以上均為受體所致(Drews, Nature Biotechnology, 1996，14:1516),而 GPCR 為治療干預(yù)最重要的革巴位，臨床用藥的30%為GPCR的拮抗劑或激動(dòng)劑(Milligan, G.和Rees, S，(1999) TIPS, 20:118-124)這表明，這些受體作為治療物質(zhì)已有確定的且經(jīng)證實(shí)的歷史。一般而言，本發(fā)明的實(shí)施者會(huì)選擇其目的多肽，并已知其準(zhǔn)確的氨基酸序列。本發(fā)明的技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于生產(chǎn)多樣化多肽，其包括如針對(duì)生長(zhǎng)和分化因子8的人單克隆抗體(實(shí)施例1、3、4、7-14)、人源化抗Lewis Y抗體(實(shí)施例5和6)、抗A β (實(shí)施例15)以及腫瘤壞死因子受體的ニ聚Fe-融合蛋白(實(shí)施例16)，提示本發(fā)明可用于表達(dá)多種不同的多肽和蛋白質(zhì)。將根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的任何給定蛋白質(zhì)都具有自身的特異反應(yīng)性特征，并可能影響培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞密度或存活力，其表達(dá)水平可能低于相同培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的另ー種多肽或蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能適當(dāng)修飾本發(fā)明的步驟和組合物，從而優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)和/或任意給定表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。遺傳控制元件對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員顯而易見的是，遺傳控制元件可用于調(diào)控多肽或蛋白質(zhì)的基因表達(dá)。選擇此類遺傳控制元件使其在相關(guān)宿主細(xì)胞中具有活性。控制元件可具有組成型活性或?yàn)橹付l件下可誘導(dǎo)?？烧T導(dǎo)型控制元件在表達(dá)蛋白質(zhì)具毒性或?qū)?xì)胞生長(zhǎng)和/或存活力具其他不良影響時(shí)特別有用。在這種情況下，通過可誘導(dǎo)型控制元件調(diào)控多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)，可以改善細(xì)胞存活力、細(xì)胞密度和/或表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的總產(chǎn)率。可用于實(shí)施本發(fā)明的大量控制元件為本領(lǐng)域公知且可獲取?？捎糜诒景l(fā)明的代表性組成型哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括但不僅限于，次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HPTR)啟動(dòng)子、腺苷脫氨酶啟動(dòng)子、丙酮酸激酶啟動(dòng)子、β肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子以及其他本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的組成型啟動(dòng)子。此外,能驅(qū)動(dòng)真核細(xì)胞中編碼序列的組成型表達(dá)的病毒啟動(dòng)子包括，如猿猴病毒啟動(dòng)子、單純皰疫病毒啟動(dòng)子、乳頭瘤病毒啟動(dòng)子、腺病毒啟動(dòng)子、人免疫缺陷病毒(HIV)啟動(dòng)子、勞斯肉瘤病毒啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、莫洛尼鼠白血病病毒及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR)、單純皰疹病毒胸苷激酶啟動(dòng)子，以及其他本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的病毒啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可在存在誘導(dǎo)劑時(shí)驅(qū)動(dòng)有效連接的編碼序列的表達(dá)，也可根據(jù)本發(fā)明使用。例如在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，金屬硫蛋白啟動(dòng)子在某些金屬離子存在時(shí)能誘導(dǎo)下游編碼序列的轉(zhuǎn)錄。其他誘導(dǎo)型啟動(dòng)子為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所識(shí)別和/或公知。一般而言，基因表達(dá)序列也包括分別涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5’非轉(zhuǎn)錄和5’非翻譯序列，如TATA盒、帽子序列、CAAT序列等。增強(qiáng)子元件可任選用于增強(qiáng)欲表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)水平?？稍诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中作用的增強(qiáng)子元件的實(shí)例包括SV40早期基因增強(qiáng)子(如Dijkema等人，EMB0J. (1985)4:761所述)、以及來自勞斯肉瘤病毒(RSV)(如Gorman等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777 所述)和人巨細(xì)胞病毒(如 Boshart 等人，Cell (1985)41:521所述)長(zhǎng)末端重復(fù)序列的增強(qiáng)子/啟動(dòng)子。將控制元件連接到編碼序列的系統(tǒng)為本領(lǐng)域公知(普通分子生物學(xué)和重組DNA技術(shù)，如 SambrooK，F(xiàn)ritsch 和 Maniatis, Molecular Cloning: ALaboratory Manual,弟ニ版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989,此處引用作為參考)。適用于插入優(yōu)選編碼序列以在多種生長(zhǎng)和誘導(dǎo)條件下的多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的商業(yè)載體也為本領(lǐng)域所公知。將編碼序列和相關(guān)控制元件引入宿主細(xì)胞 適于將表達(dá)目的多肽或蛋白質(zhì)所需的足量核酸引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)的方法為本領(lǐng)域所公知。見如Gething等人,Nature, 293:620-625 (1981) ；Mantei等人，Nature, 281:40-46(1979) ;Levinson 等人；EP 117，060;以及 EP 117，058，均在此處引
用作為參考。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞而言，優(yōu)選轉(zhuǎn)化方法包括，Graham和van derErb, Virology, 52:456-457 (1978)的憐酸 丐沉淀法，或 Hawley-Nelson, Focusl5:73 (1193)的lipofectamine . (Gibco BRL)法。哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的一般方面已由Axel述于1983年8月16日遞交的美國(guó)專利號(hào)4，399，216。轉(zhuǎn)化哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種技術(shù)可見 Keown 等人，Methods in Enzymoiogy (1989)、Keown 等人，Methods in Enzymolog,185:527-537(1990)，以及 Mansour 等人，Nature, 336:348-352(1988)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的合適載體的非限制性代表實(shí)例包括P⑶NAl ;pra，見Okayama等人· (1985)Mol. Cell Biol. 5:1136-1142 ；pMClneo Poly-A,見 Thomas 等人· (1987)Cell51:503-512 ;以及桿狀病毒載體如pAC373或pAC610。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，多肽或蛋白質(zhì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞中。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明可用于瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞。細(xì)胞本發(fā)明中可應(yīng)用任何易于細(xì)胞培養(yǎng)及表達(dá)多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)胞類型?？捎糜诒景l(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的非限制性實(shí)例，包括BALB/c小鼠骨髓瘤細(xì)胞系(NSO/1，ECACCNo:85110503);人成視網(wǎng)膜細(xì)胞(PER. C6 (CruCelI, Leiden, The Netherlands)) ;SV40 轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系(COS-7，ATCC CRL 1651);人胎腎細(xì)胞系(亞克隆的293或293細(xì)胞用于在懸浮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，Graham等人，J. Gen Virol.，36:59 (1977));幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK, ATCCCCL 10);中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 +/-DHFR (CHO, Urlaub 和 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 77:4216(1980));小鼠支持細(xì)胞(TM4, Mather, Biol. Reprod. , 23:243-251 (1980));猴腎細(xì)胞(CVl ATCC CCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76，ATCC CRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HeLa, ATCC CCL 2);狗腎細(xì)胞(MDCK, ATCC CCL 34);布法羅大鼠肝細(xì)胞(BRL3A, ATCC CRL1442);人肺細(xì)胞(W138,ATCC CCL 75);人肝細(xì)胞(Hep G2, HB 8065);小鼠乳腺腫瘤(MMT060562，ATCC CCL51) ;TRI 細(xì)胞(Mather 等人，Annals N. Y. Acad. Sci. , 383:44-68 (1982))；MRC 5細(xì)胞；FS4細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系(Hep G2)。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明用于培養(yǎng)和表達(dá)來自CHO細(xì)胞系的多肽及蛋白質(zhì)。此外，任意數(shù)目的商業(yè)和非商業(yè)可得的能表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的雜交瘤細(xì)胞系可用于本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，雜交瘤細(xì)胞系可能具有不同的營(yíng)養(yǎng)要求，和/或可能需要不同的培養(yǎng)條件以達(dá)到最佳的生長(zhǎng)和多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)，井能按需改變條件。如上所述，在許多情況下需要選擇或設(shè)計(jì)細(xì)胞以產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)或多肽。通常對(duì)細(xì)胞進(jìn)行遺傳工程操作以產(chǎn)生高水平蛋白質(zhì)，例如通過引入編碼目的蛋白質(zhì)或多肽的基因，和/或通過引入調(diào)控編碼目的多肽的基因(內(nèi)源性或引入的)表達(dá)的控制元件。某些多肽可能對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞存活力或某些其他細(xì)胞特征具有不良影響，從而最終在某些方面限制了目的多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。即使在經(jīng)過遺傳工程改造以表達(dá)某ー特定多肽的特定類型細(xì)胞群中，細(xì)胞群內(nèi)部也存在差異，某些細(xì)胞個(gè)體生長(zhǎng)更好和/或產(chǎn)生更多目的多肽。在本發(fā)明某些優(yōu)選實(shí)施方案中，實(shí)施者經(jīng)驗(yàn)性選擇在選定的特定細(xì)胞培養(yǎng) 條件下生長(zhǎng)良好的細(xì)胞系。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于細(xì)胞生長(zhǎng)、最終細(xì)胞密度、細(xì)胞存活力百分比、表達(dá)多肽的滴度或由這些或由實(shí)施者重視的其他條件的任意組合，選擇經(jīng)改造表達(dá)特定多肽的個(gè)體細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。細(xì)胞培養(yǎng)階段生產(chǎn)目的多肽的一般方法包括分批培養(yǎng)和補(bǔ)料分批培養(yǎng)。分批培養(yǎng)方法一般包括用特定細(xì)胞密度的種子培養(yǎng)物接種大規(guī)模生產(chǎn)培養(yǎng)物，使細(xì)胞在有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和存活力的條件下生長(zhǎng)、當(dāng)細(xì)胞達(dá)到特定細(xì)胞密度時(shí)收集培養(yǎng)物，并純化表達(dá)多肽。補(bǔ)料分批培養(yǎng)方法包括額外的步驟，即向分批培養(yǎng)物中補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)素或其他細(xì)胞生長(zhǎng)中消耗的成分。常規(guī)分批和補(bǔ)料分批培養(yǎng)中長(zhǎng)期未決的問題，在于對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、存活力以及表達(dá)多肽產(chǎn)生有害的代謝廢物的產(chǎn)生。兩類特別有害的代謝廢物為乳酸鹽和銨鹽，分別為葡萄糖和谷氨酰胺代謝所產(chǎn)生。除谷氨酰胺代謝中酶促產(chǎn)生銨鹽外，細(xì)胞培養(yǎng)物中也會(huì)因?yàn)殡S時(shí)間的非代謝降解蓄積銨鹽。本發(fā)明提供了大規(guī)模生產(chǎn)多肽的改良方法，能通過減緩甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中這些廢物的蓄積，使銨鹽和乳酸鹽的不良影響最低化。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明可用于任何細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，包括但不僅限于分批、補(bǔ)料分批和灌流系統(tǒng)。在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，細(xì)胞生長(zhǎng)于分批或補(bǔ)料分批系統(tǒng)。培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)基配方，包括可購(gòu)買培養(yǎng)基如Ham’s FlO (Sigma)、極限必需培養(yǎng)基([MEM], Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)和 Dulbecco’ s 改良 Eagle’s 培養(yǎng)基([DMEM], Sigma)，含有相對(duì)高水平的葡萄糖和與其他氨基酸相比而言相對(duì)高水平的谷氨酰胺。通常認(rèn)為需要大量這些成分，因?yàn)樗鼈兪羌?xì)胞的主要代謝能量來源。然而，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的快速消耗導(dǎo)致了上述乳酸鹽和銨鹽的蓄積。此外，高初始水平的葡萄糖和谷氨酰胺以及隨后乳酸鹽和銨鹽的蓄積會(huì)導(dǎo)致高摩爾滲透壓濃度，后者本身往往就對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞存活力和多肽的產(chǎn)生有害。本發(fā)明提供了多種培養(yǎng)基配方，當(dāng)與此處所述的其他培養(yǎng)步驟一同使用時(shí)，能最小化甚至逆轉(zhuǎn)乳酸鹽和銨鹽的蓄積。對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和/或存活力以及對(duì)多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)有利的本發(fā)明培養(yǎng)基配方，包括以下ー項(xiàng)或多項(xiàng)i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM；ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2 ;iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2 ；iv)累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的比率為約O. 4至I ;或V)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺濃度的組合累積量大于約16mM。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解上文所用的“累積”，是指細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入的特定成分或成分的總量，包括在培養(yǎng)起始時(shí)加入的成分和其后加入的成分。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的培養(yǎng)基配方包括限定和非限定培養(yǎng)基。相對(duì)于本發(fā)明培養(yǎng)基配方，常規(guī)培養(yǎng)基配方起始時(shí)具有相對(duì)低水平的總氨基酸。例如，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基DME-F12 (Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基與Ham’s F培養(yǎng)基12的50:50混合物)中總氨基酸含量為7. 29mM，而常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640的總氨基酸含量為 6. 44mM (見如 H. J. Morton, In Vitro, 6:89-108 (1970), R. G. Ham, Proc. Nat. Assoc. Sci.(USA)，53:288-293 (1965)，G. E. Moore 等人，J. Am. Medical Assn.，199:519-24 (1967)，均在此處引用作為參考)。在某些本發(fā)明某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中的氨基酸濃度優(yōu)選大于約70mM。更優(yōu)選本發(fā)明培養(yǎng)基配方中初始培養(yǎng)基含有氨基酸濃度大于約70mM。已經(jīng)證實(shí)當(dāng)初始培養(yǎng)基的氨基酸濃度在此范圍內(nèi)時(shí)，培養(yǎng)物生長(zhǎng)期間的細(xì)胞密度和滴度得以提高(見實(shí)施例13)。 此外，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中的谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比比其他可購(gòu)買或不可購(gòu)買的培養(yǎng)基降低。優(yōu)選培養(yǎng)基中的谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比小于約2。此外，在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中的谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比比其他可購(gòu)買或不可購(gòu)買的培養(yǎng)基降低。優(yōu)選培養(yǎng)基中的谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比小于約 0. 2。如本發(fā)明中降低初始培養(yǎng)基中的谷氨酰胺與天冬酰胺或與總氨基酸濃度的摩爾比，得到的有趣而出人預(yù)料的結(jié)果是，除了觀察到銨鹽蓄積減少外，乳酸鹽蓄積也減少了。在某些實(shí)施方案中，銨鹽和乳酸鹽的蓄積水平不僅低于對(duì)照培養(yǎng)物的水平，實(shí)際上在初始蓄積后也降低了(例如，見實(shí)施例3和7)。Boraston(美國(guó)專利號(hào)5，871，999)已公開了總無機(jī)離子與總氨基酸摩爾比為I至10的培養(yǎng)基。Boraston顯示，使用總無機(jī)離子與總氨基酸摩爾比位于此范圍內(nèi)的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的CHO細(xì)胞聚集有所減少。在本發(fā)明的另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，培養(yǎng)基中總無機(jī)離子與總氨基酸摩爾比進(jìn)一歩降低至約O. 4至I。如實(shí)施例13所示，將該比例從I. 75降至約O. 7，使得培養(yǎng)物生長(zhǎng)期間的細(xì)胞密度和表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生顯著增加。在本發(fā)明的另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，培養(yǎng)基含有谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度為約16至36mM。如實(shí)施例14、表22所示，含谷氨酰胺與天冬酰胺的組合總濃度位于此范圍內(nèi)的培養(yǎng)基，相對(duì)于谷氨酰胺與天冬酰胺的組合總濃度在此范圍外的培養(yǎng)基，其表達(dá)多肽的滴度更高。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠選擇該范圍內(nèi)恰當(dāng)?shù)墓劝滨０放c天冬酰胺組合濃度，從而優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)和/或存活力，并最大化表達(dá)多肽的產(chǎn)生。此外，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到以上所列的任ー種條件都可単獨(dú)使用或彼此多種組合使用。利用具有上述ー種、幾種或所有特征的培養(yǎng)基配方，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)和/或存活力，并最大化表達(dá)多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明中公開的任何培養(yǎng)基配方可任選于必要時(shí)添加激素和/或其他生長(zhǎng)因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機(jī)化合物)、氨基酸、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)水解物或葡萄糖或其他能量來源。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，向培養(yǎng)基中添加化學(xué)誘導(dǎo)劑如六亞甲基ニこ酰胺(“HMBA”)和丁酸鈉(“NaB”)是有利的。可于培養(yǎng)起始加入這些任選添加劑，也可在稍后加入以補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)或另作他用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道可加入公開培養(yǎng)基配方中的任何有利或必需的添カロ劑。提供哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物制備用于通過分批或補(bǔ)料分批培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)或多肽的哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多種方法為本領(lǐng)域公知。如上所述，可通過任意數(shù)目的公知技術(shù)將足以進(jìn)行表達(dá)的核酸(一般為含有編碼目的多肽或蛋白質(zhì)基因及任何有效連接的遺傳控制元件的載體)引入宿主細(xì)胞系內(nèi)。一般而言，篩查細(xì)胞以確定哪些宿主細(xì)胞實(shí)際獲得了載體并表達(dá)目的多肽或蛋白質(zhì)。檢測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的某一特定目的多肽或蛋白質(zhì)的常規(guī)方法，包括但不僅限于免疫組化、免疫沉淀、流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光顯微術(shù)、SDS-PAGE, Western印跡、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)技術(shù)、生物活性測(cè)定和親和層析。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì) 知道檢測(cè)表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的其他合適技木。如果多個(gè)宿主細(xì)胞表達(dá)目的多肽或蛋白質(zhì)，可以使用某些或所有上述技術(shù)確定哪些細(xì)胞表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的水平最高。一旦表達(dá)目的多肽或蛋白質(zhì)的細(xì)胞得以鑒定，通過任意的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的多種方法于培養(yǎng)物中増殖細(xì)胞。一般使細(xì)胞在有利于細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和存活力的溫度和培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，來增殖表達(dá)目的多肽和蛋白質(zhì)的細(xì)胞。初始培養(yǎng)基體積可為任意大小，但通常小于最終生成目的多肽或蛋白質(zhì)的生產(chǎn)生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基體積，且通常在將細(xì)胞接種于生產(chǎn)生物反應(yīng)器前，使細(xì)胞在容積遞增的生物反應(yīng)器傳代數(shù)次。攪拌或搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)物以提高培養(yǎng)基的充氧程度和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在細(xì)胞中的散布。備選地或額外地，可使用本領(lǐng)域公知的特殊噴射裝置提高和控制培養(yǎng)物的充氧程度。根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員知道控制或調(diào)控某些生物反應(yīng)器的內(nèi)部條件是有利的，包括但不僅限于pH、溫度、充氧等。生產(chǎn)生物反應(yīng)器中的起始細(xì)胞密度可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員選定。根據(jù)本發(fā)明，生產(chǎn)生物反應(yīng)器中的起始細(xì)胞密度可低至每單位培養(yǎng)物體積含ー個(gè)細(xì)胞。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，生產(chǎn)生物反應(yīng)器中的起始細(xì)胞密度可為約每毫升2X IO2個(gè)活細(xì)胞，至約每毫升2X 103、2X 104、2X 105、2X 106、5X IO6 或 IOXlO6 個(gè)活細(xì)胞及更高?？墒蛊鹗己椭虚g細(xì)胞培養(yǎng)物生長(zhǎng)至任何所需的密度，再接種下一中間或最終生產(chǎn)生物反應(yīng)器。優(yōu)選在接種前大部分細(xì)胞都存活，盡管具有完全存活力或近于完全的存活力并非必需。在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，可通過如低速離心將細(xì)胞從上清液中分離出來。也可以在接種下一生物反應(yīng)器前用培養(yǎng)基洗滌取出的細(xì)胞，以除去任何不需要的代謝廢物或培養(yǎng)基成分。該培養(yǎng)基可為細(xì)胞之前生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，也可為由本發(fā)明實(shí)施者選擇的不同的培養(yǎng)基或洗滌溶液?？蓪⒓?xì)胞稀釋至合適的密度以接種生產(chǎn)生物反應(yīng)器。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，將細(xì)胞稀釋于生產(chǎn)生物反應(yīng)器所用的相同培養(yǎng)基中。或者也可根據(jù)本發(fā)明實(shí)施者的需要或愿望，或?yàn)檫m應(yīng)細(xì)胞本身的特定需求(例如在接種生產(chǎn)生物反應(yīng)器前它們需短期貯存)，將細(xì)胞稀釋至另一培養(yǎng)基或溶液中。起始生長(zhǎng)階段
一旦如上所述接種生產(chǎn)生物反應(yīng)器，在有利于細(xì)胞培養(yǎng)物存活、生長(zhǎng)和存活力的條件下將細(xì)胞培養(yǎng)物維持在起始生長(zhǎng)階段。準(zhǔn)確的條件將取決于細(xì)胞類型、獲取細(xì)胞的生物以及表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的性質(zhì)和特征而改變。根據(jù)本發(fā)明，生產(chǎn)生物反應(yīng)器可以為適合多肽或蛋白質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn)的任意容積。在優(yōu)選實(shí)施方案中，生產(chǎn)生物反應(yīng)器的容積為至少500升。在另ー優(yōu)選實(shí)施方案中，生產(chǎn)生物反應(yīng)器的容積為1000、2500、5000、8000、10，000、12，000升或更大，或其間的任意容積。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知道也能夠選擇合適的生物反應(yīng)器用于實(shí)施本發(fā)明。該生產(chǎn)生物反應(yīng)器可由有利于細(xì)胞生長(zhǎng)和存活力、且不干擾產(chǎn)生的多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)或穩(wěn)定性的任意材料構(gòu)成。起始生長(zhǎng)階段細(xì)胞培養(yǎng)物溫度的選擇主要是基于細(xì)胞培養(yǎng)物可保持存活力的溫度范圍。例如，在起始生長(zhǎng)階段，CHO細(xì)胞在37° C生長(zhǎng)良好。一般而言，大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞在約25° C至42° C的范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好。優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞在約35° C至40° C的范圍內(nèi)生長(zhǎng)良好。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能根據(jù)細(xì)胞的需求和實(shí)施者的生產(chǎn)要求，選擇細(xì)胞 生長(zhǎng)的合適溫度。在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，將起始生長(zhǎng)階段的溫度維持在單一、恒定的溫度。在另ー實(shí)施方案中，將起始生長(zhǎng)階段的溫度維持在一系列溫度范圍內(nèi)。例如可在起始生長(zhǎng)階段穩(wěn)步提高或降低溫度?；蛘咭部稍谄鹗忌L(zhǎng)階段的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)不連續(xù)地提高或降低溫度。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠確定是否應(yīng)當(dāng)使用単一或多個(gè)溫度，以及該溫度是否應(yīng)當(dāng)穩(wěn)步改變還是不連續(xù)地改變。根據(jù)實(shí)施者的需要和細(xì)胞本身的需求，細(xì)胞在起始生長(zhǎng)階段生長(zhǎng)的時(shí)間可長(zhǎng)可短。在一個(gè)實(shí)施方案中，使細(xì)胞生長(zhǎng)足以達(dá)到活細(xì)胞密度的時(shí)間，所述活細(xì)胞密度為細(xì)胞在不受干擾時(shí)生長(zhǎng)最終可達(dá)到的最大活細(xì)胞的給定百分比。例如，可使細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間，該時(shí)間內(nèi)足以達(dá)到所需的活細(xì)胞密度，其為最大活細(xì)胞密度的百分之1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 99。在另ー實(shí)施方案中使細(xì)胞生長(zhǎng)指定的時(shí)間。例如，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)物的起始濃度、細(xì)胞生長(zhǎng)的溫度以及細(xì)胞的內(nèi)在生長(zhǎng)速率，可使細(xì)胞生長(zhǎng)0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天時(shí)間。在某些情況下，可使細(xì)胞生長(zhǎng)ー個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。如果細(xì)胞在起始生長(zhǎng)階段的溫度下、接種生物反應(yīng)器中的生長(zhǎng)足以使接種時(shí)生產(chǎn)生物反應(yīng)器中活細(xì)胞密度已經(jīng)達(dá)到所需的最大活細(xì)胞密度百分比，則細(xì)胞可在生產(chǎn)生物反應(yīng)器中生長(zhǎng)O天。本發(fā)明實(shí)施者能夠根據(jù)多肽或蛋白質(zhì)生產(chǎn)需求和細(xì)胞本身需求選擇起始生長(zhǎng)階段的長(zhǎng)度。在起始培養(yǎng)期間可攪拌或搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)物，以提高充氧和細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分布。根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在起始生長(zhǎng)階段控制或調(diào)控生物反應(yīng)器的某些內(nèi)部條件(包括但不僅限于pH、溫度、充氧等)是有利的。例如，可以通過供以適量的酸或堿控制pH，而可通過本領(lǐng)域公知的噴射裝置控制充氧。改變培養(yǎng)條件根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，在起始生長(zhǎng)階段終末期至少可以改變ー種培養(yǎng)條件，以應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件并使培養(yǎng)物中發(fā)生代謝轉(zhuǎn)變。抑制性代謝物(最主要為乳酸鹽和氨)的蓄積會(huì)抑制生長(zhǎng)。通過如改變細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度、pH、重量摩爾滲透壓濃度或化學(xué)誘導(dǎo)物水平而完成的代謝轉(zhuǎn)變，其特征在于降低了特定乳酸鹽產(chǎn)生速率與特定葡萄糖消耗速率的比率。在非限制性實(shí)施方案中，通過轉(zhuǎn)變培養(yǎng)物的溫度轉(zhuǎn)變培養(yǎng)條件。然而，如本領(lǐng)域所公知，改變溫度不是完成合適代謝改變的唯一機(jī)制。例如，此類代謝轉(zhuǎn)變也可通過改變其他培養(yǎng)條件而完成，包括但不僅限于pH、重量摩爾滲透壓濃度或丁酸鈉水平。如上所述，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)變的時(shí)間由本發(fā)明實(shí)施者根據(jù)多肽或蛋白質(zhì)生產(chǎn)需要或細(xì)胞本身需求所確定。當(dāng)改變培養(yǎng)物溫度時(shí)，溫度的轉(zhuǎn)變可能相對(duì)漸變。例如，溫度改變的完成可能需要數(shù)小時(shí)至數(shù)天?；蛘邷囟绒D(zhuǎn)變可以相對(duì)突然。例如，溫度轉(zhuǎn)變可能在少于數(shù)小時(shí)內(nèi)完成。利用適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)和控制設(shè)施(如商業(yè)大規(guī)模多肽或蛋白質(zhì)生產(chǎn)中的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)施)，溫度改變甚至可以在I小時(shí)以內(nèi)完成。隨后生長(zhǎng)階段中細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度的選擇，主要是基于細(xì)胞培養(yǎng)物保持存活カ且能在商業(yè)滿足量水平上表達(dá)重組多肽或蛋白質(zhì)的溫度范圍。一般而言，大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞在約25° C至42° C的溫度范圍能保持存活力并且在商業(yè)滿足量水平上表達(dá)重組多肽或蛋白質(zhì)。優(yōu)選哺乳動(dòng)物細(xì)胞在約25° C至35° C的溫度范圍保持存活力且能在商業(yè)滿 足量水平上表達(dá)重組多肽或蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能根據(jù)細(xì)胞需求和實(shí)施者的生產(chǎn)需要，選擇生長(zhǎng)細(xì)胞的合適溫度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，維持隨后生長(zhǎng)階段的溫度為單一、恒定的溫度。在另一實(shí)施方案中，維持隨后生長(zhǎng)階段的溫度在一系列溫度范圍內(nèi)。例如可在隨后生長(zhǎng)階段穩(wěn)步提高或降低溫度?；蛘咭部稍陔S后生長(zhǎng)階段的多個(gè)時(shí)間點(diǎn)不連續(xù)地提高或降低溫度。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解該實(shí)施方案中包括多個(gè)不連續(xù)的溫度轉(zhuǎn)換。例如，溫度可能轉(zhuǎn)變一次，細(xì)胞在該溫度或溫度范圍內(nèi)維持一段時(shí)間，隨后可再次轉(zhuǎn)變溫度一一至更高或更低溫度。毎次不連續(xù)地轉(zhuǎn)變后，培養(yǎng)物溫度可為恒定，也可維持于某一溫度范圍內(nèi)。在實(shí)施例16中，顯示的數(shù)據(jù)證實(shí)應(yīng)用兩次連續(xù)溫度改變的有效性，然而本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在本發(fā)明中可以使用3次或更多次連續(xù)的溫度改變提高細(xì)胞的存活力或密度和/或提高重組多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)。毎次連續(xù)溫度轉(zhuǎn)變后細(xì)胞培養(yǎng)物的溫度或溫度范圍可能高于或低于轉(zhuǎn)變前的溫度或溫度范圍。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，每ー連續(xù)的溫度或溫度范圍都低于前ー溫度或溫度范圍。后續(xù)生產(chǎn)階段根據(jù)本發(fā)明，一旦如上述轉(zhuǎn)變了細(xì)胞培養(yǎng)物條件，將細(xì)胞培養(yǎng)物維持于第二組培養(yǎng)條件的后續(xù)生產(chǎn)階段，所述培養(yǎng)條件有利于細(xì)胞培養(yǎng)物的存活和存活力，且適于所需多肽或蛋白質(zhì)以商業(yè)滿足水平表達(dá)。如上所述，可以通過改變數(shù)種培養(yǎng)條件中的一種或多種來轉(zhuǎn)變培養(yǎng)物，包括但不僅限于溫度、pH、重量摩爾滲透壓濃度和丁酸鈉水平。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)變培養(yǎng)物的溫度。根據(jù)該實(shí)施方案，在后續(xù)生產(chǎn)階段，將培養(yǎng)物維持于低于起始生長(zhǎng)階段溫度或溫度范圍的溫度或溫度范圍內(nèi)。例如，在后續(xù)生產(chǎn)階段中，CHO細(xì)胞在25° C至35° C范圍內(nèi)良好表達(dá)重組多肽或蛋白質(zhì)。如上所述，可利用多重不連續(xù)的溫度轉(zhuǎn)變提高細(xì)胞密度或存活力，或提高重組多肽或蛋白質(zhì)的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，可維持細(xì)胞于后續(xù)生產(chǎn)階段直至達(dá)到所需的細(xì)胞密度或生產(chǎn)滴度。在一個(gè)實(shí)施方案中，維持細(xì)胞于后續(xù)生產(chǎn)階段直至重組多肽或蛋白質(zhì)的滴度達(dá)到最大。在其他實(shí)施方案中，可根據(jù)實(shí)施者的生產(chǎn)要求或細(xì)胞本身的需求，在此時(shí)間點(diǎn)前收集培養(yǎng)物。例如，可維持細(xì)胞一段時(shí)間，以足以達(dá)到活細(xì)胞密度為最大活細(xì)胞密度的百分之1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 99。在某些情況下，使活細(xì)胞
密度達(dá)到最大后再于收集培養(yǎng)物前使活細(xì)胞密度下降至某一水平可能是有利的。在極端實(shí)例中，在收集培養(yǎng)物前使活細(xì)胞密度接近或達(dá)到O可能有利。在本發(fā)明的另ー實(shí)施方案中，使細(xì)胞于后續(xù)生產(chǎn)階段中生長(zhǎng)指定的時(shí)間。例如，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)物在后續(xù)生產(chǎn)階段的起始濃度、細(xì)胞生長(zhǎng)的溫度以及細(xì)胞的內(nèi)在生長(zhǎng)速率，可使細(xì)胞生長(zhǎng) 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或更多天時(shí)間。在某些情況下，可使細(xì)胞生長(zhǎng)ー個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間。本發(fā)明實(shí)施者能夠根據(jù)多肽或蛋白質(zhì)生產(chǎn)需求和細(xì)胞本身需求選擇后續(xù)生長(zhǎng)階段的長(zhǎng)度。在某些情況下，于后續(xù)生產(chǎn)階段中向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加細(xì)胞消耗或代謝的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或其他培養(yǎng)基成分，可能為有利或必要的。例如，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加在細(xì)胞培養(yǎng)物監(jiān)測(cè)(見下文“監(jiān)測(cè)培養(yǎng)條件”章節(jié))中發(fā)現(xiàn)消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)或其他培養(yǎng)基成分是有利的。備選地或額外地，在后續(xù)生產(chǎn)階段前補(bǔ)充細(xì)胞培養(yǎng)物也是有利或必要的。在非限制性實(shí)例中，向 細(xì)胞培養(yǎng)物中添加激素和/或其他生長(zhǎng)因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機(jī)化合物)、氨基酸、脂質(zhì)或葡萄糖或其他能量來源，是有利或必要的?？蓪⑦@些增補(bǔ)成分全部一次加入細(xì)胞培養(yǎng)物中，或可以系列添加提供給細(xì)胞培養(yǎng)物。在本發(fā)明的某一實(shí)施方案中，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)按比例量向細(xì)胞培養(yǎng)物中提供增補(bǔ)成分。在另ー實(shí)施方案中，可于起始時(shí)僅提供某些增補(bǔ)成分，并于稍后提供其余成分。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，以這些增補(bǔ)成分持續(xù)向細(xì)胞培養(yǎng)物補(bǔ)料。根據(jù)本發(fā)明，最好應(yīng)將向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加的總量保持為最小。例如，向細(xì)胞培養(yǎng)物中添加的含有增補(bǔ)成分的培養(yǎng)基或溶液的總量可為提供增補(bǔ)成分之前細(xì)胞培養(yǎng)物體積的百分之 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45 或 50。在后續(xù)生產(chǎn)階段期間可攪拌或搖動(dòng)細(xì)胞培養(yǎng)物，以提高充氧和細(xì)胞中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分散。根據(jù)本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道，在后續(xù)生長(zhǎng)階段控制或調(diào)控生物反應(yīng)器的某些內(nèi)部條件(包括但不僅限于pH、溫度、充氧等)是有利的。例如，可以通過供以適量的酸或堿控制PH，而可通過本領(lǐng)域公知的噴射裝置控制充氧。監(jiān)測(cè)培養(yǎng)條件在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，實(shí)施者會(huì)發(fā)現(xiàn)周期性監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)的具體條件是有利或必要的。監(jiān)測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)條件使得實(shí)施者能確定細(xì)胞培養(yǎng)物是否在次佳水平上生產(chǎn)重組多肽或蛋白質(zhì)，或培養(yǎng)物將進(jìn)入次佳生產(chǎn)階段。為監(jiān)測(cè)某些細(xì)胞培養(yǎng)條件，有必要取出少量等份的培養(yǎng)物進(jìn)行分析。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解此類取出有可能會(huì)向細(xì)胞培養(yǎng)物中引入污染，并會(huì)適度注意以最小化此類污染的風(fēng)險(xiǎn)。作為非限制性實(shí)例，監(jiān)測(cè)溫度、pH、細(xì)胞密度、細(xì)胞存活力、綜合活細(xì)胞密度、乳酸鹽水平、銨鹽水平、摩爾滲透壓濃度或表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的滴度，是有利或必要的。本領(lǐng)域公知有多種技術(shù)可使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員測(cè)量這些條件。例如，可以利用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀、Coulter計(jì)數(shù)器或細(xì)胞密度檢查(CEDEX)測(cè)量細(xì)胞密度。可以通過臺(tái)盼藍(lán)染色培養(yǎng)物樣本確定活細(xì)胞密度。由于只有死細(xì)胞才攝取臺(tái)盼藍(lán)，通過計(jì)量細(xì)胞總數(shù)、用攝取染料的細(xì)胞數(shù)目除以細(xì)胞總數(shù)，取剰余值即可確定活細(xì)胞密度?？梢岳肏PLC確定乳酸鹽、銨鹽或表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的水平?；蛘撸部衫脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)例如SDS-PAGE凝膠的考馬斯染色、Western印跡、Bradford測(cè)定、勞里測(cè)定、雙縮脲測(cè)定和UV吸收確定表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的水平。監(jiān)測(cè)表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(包括磷酸化和糖基化)也是有利或必要的。表達(dá)多肽的分離一般而言，一般優(yōu)選分離和/或純化本發(fā)明中表達(dá)的蛋白質(zhì)或多肽。在優(yōu)選實(shí)施方案中，表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)分泌于培養(yǎng)基中，因此通過如離心或過濾去除細(xì)胞和其他固體是純化過程的第一歩。該實(shí)施方案在用于本發(fā)明時(shí)特別有用，因?yàn)榇颂幟枋龅姆椒ê徒M合物使細(xì)胞存活力増加。結(jié)果在培養(yǎng)過程中死亡的細(xì)胞減少，且釋放入培養(yǎng)基中能潛在降低表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)產(chǎn)量的蛋白水解酶減少?；蛘呖蓪⒈磉_(dá)的多肽或蛋白質(zhì)結(jié)合于宿主細(xì)胞的表面。在該實(shí)施方案中，去除培養(yǎng)基，并裂解表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞作為純化過程中的第一歩?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意方法裂解哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，包括利用玻璃珠物理破壞，以及暴露于高pH值條件。 可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法分離和純化多肽或蛋白質(zhì)，包括但不限于色譜法(例如離子交換、親和力、尺寸排阻和羥基磷灰石層析)、凝膠過濾、離心或差異溶解度、こ醇沉淀或任何其他可用的純化蛋白質(zhì)技術(shù)(見如Scopes, Protein PurificationPrinciples and Practice 果 ニ 版，Springer-Verlag, New York, 1987 ；Higgins, S.J.和 Hames, B. D.(編輯),Protein Expression:APractical Approach, Oxford UnivPress, 1999 ；以及 Deutscher, Μ· Ρ·，Simon, Μ· I.，Abelson, J. N.(編輯)，Guide toProtein Purification:Methods in Enzymology(Methods in Enzymology Series,Vol182), Academic Press, 1997,均在此處引用作為參考)。具體對(duì)于免疫親和層析而言,通過將蛋白質(zhì)結(jié)合于含有抗體的親和柱可以分離蛋白質(zhì)，所述抗體為針對(duì)該蛋白質(zhì)所產(chǎn)生并固定于固態(tài)支持物上?；蛘呖衫脴?biāo)準(zhǔn)重組技術(shù)將親和標(biāo)記如流感外殼序列、多聚組氨酸、谷胱甘肽一 S —轉(zhuǎn)移酶連接于蛋白質(zhì)，以使得可通過合適的親和柱進(jìn)行簡(jiǎn)單純化?？稍谌我饣蛩须A段加入蛋白酶抑制劑如苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑蛋白酶肽、胃蛋白酶抑制劑或抑酶肽，以減少或消除純化過程中多肽或蛋白質(zhì)的降解。當(dāng)必須裂解細(xì)胞以分離和純化表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)時(shí)，尤其需要蛋白酶抑制剤。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到根據(jù)待純化多肽或蛋白質(zhì)的特性、表達(dá)多肽或蛋白質(zhì)的細(xì)胞特性，以及細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基組成，具體純化技術(shù)有所不同。藥物配方在本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案中，生產(chǎn)的多肽或蛋白質(zhì)具有藥理學(xué)活性并可用于藥物制備。上述的發(fā)明組合物可施用于受試者或可先配制以通過任何可用的途徑遞送，所述途徑包括但不限于胃腸道外(如靜脈內(nèi))、皮內(nèi)、皮下、ロ服、經(jīng)鼻、經(jīng)氣管、經(jīng)眼(opthalmic)、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜、經(jīng)直腸以及經(jīng)陰道途徑。發(fā)明性藥物組合物一般包括表達(dá)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的純化的多肽或蛋白質(zhì)、遞送物質(zhì)(即陽(yáng)離子聚合物、肽分子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、表面活性物質(zhì)等，如上文所述)，與可藥用載體的組合。此處所用的詞語(yǔ)“可藥用載體”包括溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等與藥物施用相容的物質(zhì)。組合物中也可含有增補(bǔ)的活性化合物。配制藥物組合物以使之與其預(yù)期的施用途徑相客。應(yīng)用于胃腸道外、皮內(nèi)或皮下的溶液或懸浮液包括以下成分無菌稀釋劑如注射用水、鹽溶液、非揮發(fā)性油、聚こニ醇、甘油、丙ニ醇或其他合成溶劑；抗細(xì)菌劑如苯甲醇或?qū)αu苯甲酸甲酯；抗氧化劑如維生素C或亞硫酸氫鈉；螯合劑如こニ胺四こ酸；緩沖液如醋酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽以及調(diào)節(jié)張力物質(zhì)如氯化鈉或右旋糖?？捎盟峄驂A(如鹽酸或氫氧化鈉)調(diào)節(jié)pH?？砂b胃腸道外制品于安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多劑小瓶。適于注射用的藥物組合物一般包括無菌水溶液(其中可溶于水)或分散體，以及無菌散劑，用以制備無菌注射溶液或分散系的臨時(shí)制品。可用于經(jīng)靜脈施用的合適載體包括生理鹽水、制菌水、聚氧こ烯醚(CremophorEL ) (BASF, Parsippany, NJ)或磷酸緩沖鹽水(PBS)。在所有情況下，組合物都必須無菌且為可易于注射的液態(tài)。優(yōu)選的藥物制劑在生產(chǎn)和貯存條件下穩(wěn)定，且必須貯存以避免微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。一般而言，相關(guān)載體可為溶劑或分散介質(zhì)，其中含有如水、こ醇、多元醇(例如甘油、丙ニ醇以及液態(tài)聚こニ醇等)及其合適混合物。通過如利用如卵磷脂包衣、維持分散系中所需顆粒的尺寸以及通過利用表面活性剤，能夠維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？衫枚喾N抗細(xì)菌和抗真菌劑來防止微生物作用，例如對(duì)羥基苯甲酸酯類、氯代丁醇、苯酚、抗壞血酸、こ基汞硫代水楊酸鈉等。在許多情況下，優(yōu)選向組合物中加入等滲劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉?？梢酝ㄟ^ 向組合物中加入延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鋁和明膠，延長(zhǎng)注射組合物的吸收。根據(jù)需求，向含有上述成分的一種或數(shù)種組合的合適溶劑中摻入所需量的純化多肽或蛋白質(zhì)，然后過濾滅菌，可制備無菌注射用溶液。一般而言，向含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)以及所需上述列舉中的其他成分的無菌載體中摻入純化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)，可制備分散系。對(duì)于用于制備無菌注射溶液的無菌散劑而言，優(yōu)選制備方法為真空干燥以及冷凍干燥，可產(chǎn)生具有活性成分以及來自以前無菌過濾溶液的任意其他所需成分的散齊 。ロ服組合物一般包括惰性稀釋劑或可食用載體。為進(jìn)行ロ服治療施用，可將純化多肽或蛋白質(zhì)混合于賦形劑，并以片劑、錠劑或膠囊如明膠膠囊的形式使用。也可利用液態(tài)載體制備ロ服組合物，用如漱ロ液。藥物相容性粘合劑和/或佐劑材料可作為組合物的組成部分。片劑、丸剤、膠囊、錠劑等可含有任意以下成分，或具有相似性質(zhì)的化合物粘合劑如微晶纖維素、西黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉或乳糖；崩解劑如藻酸、Primogel或玉米淀粉；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或Sterotes ;助流劑如膠體ニ氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；或增味劑如胡椒薄荷、水楊酸甲酯或桔子香精。ロ服遞送制劑可以有利地?fù)饺肽芴岣呶改c道內(nèi)穩(wěn)定性和/或增強(qiáng)吸收的物質(zhì)。為吸入施用，優(yōu)選從含有合適推進(jìn)劑(如氣體如ニ氧化碳)或霧化器的加壓容器或分散器以氣溶膠噴霧的形式遞送含有表達(dá)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的純化的多肽或蛋白質(zhì)和遞送劑的本發(fā)明組合物。本發(fā)明特別涉及利用鼻噴霧、吸入或其他直接遞送方式將組合物遞送至上和/或下呼吸道。經(jīng)鼻施用針對(duì)流感病毒的DNA疫苗已經(jīng)顯示能夠引發(fā)⑶8Τ細(xì)胞應(yīng)答，提示至少呼吸道內(nèi)的某些細(xì)胞能攝取經(jīng)此途徑遞送的DNA，且本發(fā)明的遞送劑會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞攝取。根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，含有表達(dá)自哺乳動(dòng)物細(xì)胞系的純化多肽和遞送劑的組合物，被配制為大的多孔顆粒用于氣溶膠施用。也可通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮方法全身施用。為進(jìn)行經(jīng)粘膜或經(jīng)皮施用，制劑中使用適合于待穿透屏障的滲透劑。此類滲透劑一般為本領(lǐng)域公知，包括如用于經(jīng)粘膜施用的去污齊U、膽汁鹽和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜施用可通過使用鼻噴霧或栓劑而實(shí)現(xiàn)。對(duì)于經(jīng)皮施用而言，將純化的多肽或蛋白質(zhì)以及遞送劑配制為本領(lǐng)域公知的軟膏、油膏、凝膠或霜?jiǎng)┲?。組合物也可制備為栓劑(例如使用如可可油或其他甘油酯的常規(guī)栓劑基質(zhì))或用于直腸遞送的留置灌腸劑形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，制備的組合物中含有可保護(hù)多肽或蛋白質(zhì)以避免體內(nèi)迅速消除的載體，例如控釋制劑(包括埋植和微囊遞送系統(tǒng))?？墒褂蒙锟山到獾暮蜕锵嗳菪跃酆衔铮绀诚─乘幛诚?、聚酐、聚羥基こ酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備此類制劑的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見。這些材料也可購(gòu)自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals, Inc0脂質(zhì)體懸浮液(包括含有針對(duì)病毒抗原單克隆抗體的祀定感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可用作可藥用載體。這些均可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備，例如美國(guó)專利號(hào)4，522，811中所述。最好可將ロ服或胃腸道外組合物配制為單劑形式以便于劑量的使用和均一性。此處所用的單劑形式是指適合待治療受試者的單位劑量的物理分離單位；其中每ー單位含有經(jīng)計(jì)算能與所需藥物載體一同產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量的活性多肽或蛋白質(zhì)。 根據(jù)本發(fā)明表達(dá)的多肽或蛋白質(zhì)可按需以多個(gè)間隔、持續(xù)不同時(shí)期施用，例如每周一次，持續(xù)約I至10周、2至8周、約3至7周、約4、5或6周等。技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到某些因素會(huì)影響有效治療受試者所需的劑量和時(shí)間選擇，包括但不僅限于疾病或紊亂的嚴(yán)重性、既往治療、受試者的一般健康狀況和/或年齡，以及存在的其他疾病。一般而言，用此處所述的多肽或蛋白質(zhì)治療受試者可包括單次治療，或在多種情況下可包括一系列治療。進(jìn)ー步認(rèn)識(shí)到合適的劑量將取決于多肽或蛋白質(zhì)的效力，且可任選根據(jù)具體受者調(diào)整，例如通過施用遞增的劑量直至出現(xiàn)預(yù)選的期望反應(yīng)。對(duì)于任何具體動(dòng)物受試者的特定劑量水平可能取決于多種因素，包括所用特定多肽或蛋白質(zhì)的活性、受試者的年齡、體重、一般健康、性別和飲食、施用時(shí)間、施用途徑、排泄速率、任何藥物組合以及被調(diào)節(jié)的表達(dá)水平或活性。本發(fā)明包括利用發(fā)明組合物治療非人類動(dòng)物。因此，可根據(jù)已知的獸醫(yī)藥理學(xué)和醫(yī)學(xué)原則選擇施用的劑量和方法。指南可見于如Adams，R.(編車耳),Veterinary Pharmacology and Therapeutics,弟 8 版，Iowa State UniversityPress;ISBN:0813817439;2001o發(fā)明藥物組合物可與施用說明一起含于容器、包裹或分散器中。應(yīng)該理解，前述說明僅為代表而非限制。實(shí)施本發(fā)明的其他方法和材料以及額外的應(yīng)用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見，并包括于所附權(quán)利要求中。
實(shí)施例實(shí)施例I :用于抗⑶F-8補(bǔ)料分批方法的增強(qiáng)型培養(yǎng)基I常規(guī)用于細(xì)胞系培養(yǎng)的補(bǔ)料分批方法有ー些缺點(diǎn)，包括補(bǔ)料所必需的時(shí)間及精力，以及大規(guī)模生物反應(yīng)器所需要的特別設(shè)施。本實(shí)施例的目的是開發(fā)ー種需要最小補(bǔ)料的在大規(guī)模生物反應(yīng)器中生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的分批培養(yǎng)基。材料與方法株系和培養(yǎng)基設(shè)計(jì)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巣(CHO)細(xì)胞表達(dá)針對(duì)生長(zhǎng)分化因子8的單克隆抗體(抗 GDF-8 細(xì)胞)(見 Veldman 等人,NeutralizinR Antibodies ARainst GDF-8 andUses Therefor. US20040142382A1)?？耿荈_8細(xì)胞用于測(cè)試新的分批培養(yǎng)基。比較培養(yǎng)基I和培養(yǎng)基2支持高細(xì)胞密度和存活力的能力。表I中列出了這些培養(yǎng)基和培養(yǎng)基3的成分。加入除FeS04*7H20以外的所有成分配制培養(yǎng)基。然后將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至pH 7. 25，記錄摩爾滲透壓濃度，然后加入FeSO4 · 7H20。培養(yǎng)條件對(duì)于燒瓶實(shí)驗(yàn)，使抗GDF-8細(xì)胞在振蕩的燒瓶中生長(zhǎng)并傳代三次。對(duì)于生物反應(yīng)器實(shí)驗(yàn)，抗⑶F-8細(xì)胞在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)12天，第5天后每日補(bǔ)充2%體積的20 X培養(yǎng)基4的補(bǔ)料培養(yǎng)基(表3)或3%體積的16 X培養(yǎng)基4 (表4)。對(duì)于頭4天而言，于37° C培養(yǎng)細(xì)胞。在第5天時(shí)將細(xì)胞移至31° C。樣品分析每天從培養(yǎng)物中取出樣品，分析氨基酸、維生素、鉄、磷酸鹽、葡萄糖和谷氨酰胺的水平。表I.培養(yǎng)基I、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3的成分
培養(yǎng)基I培養(yǎng)基2培養(yǎng)基3
氣基酸mg/L mM mg/L uiM ing/L ηιΜ
丙氨貌96,m ___1,08 _ 17.80 _ 0.20 __ 24.87 _ 0.28 __
_ 精氨酸1186.99 一 6,82 347.97 2J0 42.143 2.43
天冬胺一水+合物713.59 4.76 75.00 OJO ^_173.90 _ 1,16 __
_天冬氨酸 318.53 __ 2.39 — 26.20 — 0.20 _ 52.72 — 0.40 _
—半胱.+氣酸It酸益一水合-物 70.01 — 0.40__70.19 — 0.40 _ 70.01__0.40 _
_ 胱氨酸ニ&酸.It 297.09 — 0.95_ 62.25 __0.20__62.09_ 0,20 _
_谷氣酸 158.59 — 1.08 — 29.40 __0.20 __41.08 — 0.28 _
_ 答氨Λ按 1892.40 — 12.96_ i 163.95— 7.97 _ 1162.40 —7.96 _
_甘氨3使95M _ 1.28 _ 30.00 0.40 35.92 048 __
組Il酸Ik酸益一.參合物_369.10 —Pも _ 46.00 — 0.22 75.27 — 0.36
異殼氨酸623.63 4.76 104.99 OJO 151.90 1.16
_______ 亮氨酸故2JI__ 6.51104.99 _ OJO __ 172.69 __],32 __
盞酸賴氨酸_945.96 _ 5.20 _ 145. _ OJO __ 218.38 _ 1.20
甲硫氨酸291.82 _ 1.96 _ 29.80 0.20 53.55 0,36 __
笨?jī)?nèi)氨酸42S.62 2.60 65.99 0.40 98.81 0,60
權(quán)利要求
1.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括； 含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的培養(yǎng)基，其具有選自以下的培養(yǎng)基特征及其組合(i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iv)累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約O. 4至1，(V)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM ；將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件； 將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
2.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括； 含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及 每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM的培養(yǎng)基且 所述培養(yǎng)基含有谷氨酰胺；且 所述培養(yǎng)基具有選自以下的兩項(xiàng)培養(yǎng)基特征及其組合(i)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(ii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iii)累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM ； 將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件； 將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
3.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括； 含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及 累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2的培養(yǎng)基；且 所述培養(yǎng)基含有谷氨酰胺；且 所述培養(yǎng)基具有選自以下的兩項(xiàng)培養(yǎng)基特征及其組合(i)每單位體積培養(yǎng)基中含有累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iii)累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM ； 將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件；將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
4.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括； 含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及 累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2的培養(yǎng)基；且 所述培養(yǎng)基含有谷氨酰胺；且 所述培養(yǎng)基具有選自以下的兩項(xiàng)培養(yǎng)基特征及其組合(i)每單位體積培養(yǎng)基中含有累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約O. 4至1，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM ； 將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件； 將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
5.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括； 含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及 累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約O. 4至I的培養(yǎng)基，且 所述培養(yǎng)基含有谷氨酰胺；且 所述培養(yǎng)基具有選自以下的兩項(xiàng)培養(yǎng)基特征及其組合(i)每單位體積培養(yǎng)基中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM ； 將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件； 將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
6.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括； 含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及 每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM的培養(yǎng)基；且 所述培養(yǎng)基含有谷氨酰胺；且 所述培養(yǎng)基具有選自以下的兩項(xiàng)培養(yǎng)基特征及其組合(i)每單位體積培養(yǎng)基中累積氨基酸量大于約70mM，(ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iv)累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約O. 4至I ; 將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件； 將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
7.權(quán)利要求I的方法，其中所述改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件步驟中的所述細(xì)胞培養(yǎng)條件選自(i)溫度，(ii)pH，(iii)重量摩爾滲透壓濃度，(iv)化學(xué)誘導(dǎo)物水平，及其組合。
8.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于13mM。
9.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于10mM。
10.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于7mM。
11.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基的起始谷氨酰胺濃度小于或等于4mM。
12.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于 13mM。
13.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于 10mM。
14.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于 7mM。
15.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中谷氨酰胺的每單位體積總累積量小于或等于 4mM。
16.權(quán)利要求I的方法，其中僅在細(xì)胞培養(yǎng)初始向起始培養(yǎng)基提供谷氨酰胺。
17.權(quán)利要求I的方法，其中培養(yǎng)基中可溶性鐵的濃度大于5μ M。
18.權(quán)利要求I的方法，其中周期性測(cè)量所述培養(yǎng)物中的活細(xì)胞密度。
19.權(quán)利要求I的方法，其中周期性測(cè)量所述培養(yǎng)物的存活力。
20.權(quán)利要求I的方法，其中周期性測(cè)量所述培養(yǎng)物中的乳酸鹽水平。
21.權(quán)利要求I的方法，其中周期性測(cè)量所述培養(yǎng)物中的銨鹽水平。
22.權(quán)利要求I的方法，其中周期性測(cè)量所述培養(yǎng)物的滴度。
23.權(quán)利要求I的方法，其中周期性測(cè)量所述培養(yǎng)物的摩爾滲透壓濃度。
24.權(quán)利要求18-23的方法，其中所述測(cè)量每日進(jìn)行。
25.權(quán)利要求I的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的起始密度至少為2X IO2細(xì)胞/mL。
26.權(quán)利要求I的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的起始密度至少為2X IO3細(xì)胞/mL。
27.權(quán)利要求I的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的起始密度至少為2X IO4細(xì)胞/mL。
28.權(quán)利要求I的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的起始密度至少為2X IO5細(xì)胞/mL。
29.權(quán)利要求I的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的起始密度至少為2X IO6細(xì)胞/mL。
30.權(quán)利要求I的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的起始密度至少為5X IO6細(xì)胞/mL。
31.權(quán)利要求I的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞的起始密度至少為IOXIO6細(xì)胞/mL。
32.權(quán)利要求I的方法，其中提供的步驟包括提供至少約1000L培養(yǎng)物。
33.權(quán)利要求I的方法，其中提供的步驟包括提供至少約2500L培養(yǎng)物。
34.權(quán)利要求I的方法，其中提供的步驟包括提供至少約5000L培養(yǎng)物。
35.權(quán)利要求I的方法，其中提供的步驟包括提供至少約8000L培養(yǎng)物。
36.權(quán)利要求I的方法，其中提供的步驟包括提供至少約10，OOOL培養(yǎng)物。
37.權(quán)利要求I的方法，其中提供的步驟包括提供至少約12，OOOL培養(yǎng)物。
38.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一組條件包括約為30至42攝氏度的第一溫度范圍。
39.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一組條件包括約為32至40攝氏度的第一溫度范圍。
40.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一組條件包括約為34至38攝氏度的第一溫度范圍。
41.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一組條件包括約為36至37攝氏度的第一溫度范圍。
42.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一組條件包括約為37攝氏度的第一溫度范圍。
43.權(quán)利要求I的方法，其中所述第二組條件包括約為25至41攝氏度的第二溫度范圍。
44.權(quán)利要求I的方法，其中所述第二組條件包括約為27至38攝氏度的第二溫度范圍。
45.權(quán)利要求I的方法，其中所述第二組條件包括約為29至35攝氏度的第二溫度范圍。
46.權(quán)利要求I的方法，其中所述第二組條件包括約為29至33攝氏度的第二溫度范圍。
47.權(quán)利要求I的方法，其中所述第二組條件包括約為30至32攝氏度的第二溫度范圍。
48.權(quán)利要求I的方法，其中所述第二組條件包括約為31攝氏度的第二溫度范圍。
49.權(quán)利要求I的方法，還包括繼第一次改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件后的第二次改變步驟，包括改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而向培養(yǎng)物應(yīng)用第三組條件。
50.權(quán)利要求49的方法，其中第二次改變步驟包括改變選自以下的至少一個(gè)培養(yǎng)條件及其組合(i)溫度，(ii)pH，(iii)重量摩爾滲透壓濃度，(iv)化學(xué)誘導(dǎo)物水平。
51.權(quán)利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為25至40攝氏度的第三溫度范圍。
52.權(quán)利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為27至37攝氏度的第三溫度范圍。
53.權(quán)利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為29至34攝氏度的第三溫度范圍。
54.權(quán)利要求49的方法，其中所述第三組條件包括約為30至32攝氏度的第三溫度范圍。
55.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一段時(shí)間為0-8天。
56.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一段時(shí)間為1-7天。
57.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一段時(shí)間為2-6天。
58.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一段時(shí)間為3-5天。
59.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一段時(shí)間為約4天。
60.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一段時(shí)間為約5天。
61.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一段時(shí)間為約6天。
62.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一段時(shí)間和所述第二段時(shí)間的總長(zhǎng)度為至少5天。
63.權(quán)利要求I的方法，其中在維持所述培養(yǎng)物的第二段時(shí)間的步驟中，乳酸鹽水平繼培養(yǎng)物中乳酸鹽水平達(dá)到最大水平后下降。
64.權(quán)利要求I的方法，其中在維持所述培養(yǎng)物的第二段時(shí)間的步驟中，銨鹽水平繼培養(yǎng)物中銨鹽水平達(dá)到最大水平后下降。
65.權(quán)利要求I的方法，其中所述產(chǎn)生多肽的總量比在除了缺少所述培養(yǎng)基特征外的相同培養(yǎng)基相同條件下生產(chǎn)多肽總量高至少I. 5倍。
66.權(quán)利要求I的方法，其中所述產(chǎn)生多肽的總量比在除了缺少所述培養(yǎng)基特征外的相同培養(yǎng)基相同條件下生產(chǎn)多肽總量高至少2倍。
67.權(quán)利要求I的方法，其中還向所述細(xì)胞培養(yǎng)物提供增補(bǔ)成分。
68.權(quán)利要求67的方法,其中所述增補(bǔ)成分于多個(gè)時(shí)間間隔加入。
69.權(quán)利要求67的方法，其中所述增補(bǔ)成分選自激素和/或其他生長(zhǎng)因子、特定離子(如鈉、氯、鈣、鎂和磷)、緩沖液、維生素、核苷或核苷酸、微量元素(通常以極低終濃度存在的無機(jī)化合物)、氨基酸、脂質(zhì)或葡萄糖或其他能源。
70.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括；含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基具有至少兩項(xiàng)選自以下的培養(yǎng)基特征(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iv)無機(jī)離子與總氨基酸的摩爾比率為約O. 4至1，以及(V)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM ； 將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件； 將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
71.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括； 含有目的多肽編碼基因且該基因在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基具有至少三項(xiàng)選自以下的培養(yǎng)基特征(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iv)無機(jī)離子與總氨基酸的摩爾比率為約O. 4至1，以及(V)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM ； 將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件； 將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
72.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括； 含有目的多肽編碼基因且該基因在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基具有至少四項(xiàng)選自以下的培養(yǎng)基特征(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iv)無機(jī)離子與總氨基酸的摩爾比率為約O. 4至1，以及(V)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM ； 將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件； 將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
73.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括； 含有目的多肽編碼基因且該基因在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養(yǎng)基，其特征在于(i)起始氨基酸濃度大于約70mM，(ii)谷氨酰胺與天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)谷氨酰胺與總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iv)無機(jī)離子與總氨基酸的摩爾比率為約O. 4至1，以及(V)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合濃度大于約16mM ； 將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件； 將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
74.在大規(guī)模生產(chǎn)細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)多肽的方法，包括步驟 提供細(xì)胞培養(yǎng)物，其包括； 含有目的多肽編碼基因且該基因可在細(xì)胞培養(yǎng)條件下表達(dá)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞；以及含有谷氨酰胺的限定培養(yǎng)基，且其每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約 16mM ； 將所述培養(yǎng)物在起始生長(zhǎng)階段的第一組培養(yǎng)條件下維持足夠長(zhǎng)的第一段時(shí)間，以使所述細(xì)胞增殖至活細(xì)胞密度達(dá)到所述培養(yǎng)物在此第一組培養(yǎng)條件下可達(dá)到的最大可能活細(xì)胞密度的20%-80%范圍； 改變至少一個(gè)培養(yǎng)條件，從而應(yīng)用第二組培養(yǎng)條件； 將所述培養(yǎng)物在第二組培養(yǎng)條件下維持第二段時(shí)間，使多肽在細(xì)胞培養(yǎng)物中累積。
75.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基包括含有谷氨酰胺的培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基具有選自以下的培養(yǎng)基特征及其組合 (i)起始氨基酸濃度大于約70mM, (ii)起始谷氨酰胺與起始天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)起始谷氨酰胺與起始總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iv)起始無機(jī)離子與起始總氨基酸的摩爾比率為約O. 4至1，(V)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合起始濃度大于約16mM0
76.權(quán)利要求1-6或70-75中任一項(xiàng)的方法，其中 乳酸鹽水平低于除了缺少所述培養(yǎng)基特征外的相同培養(yǎng)基相同條件下的觀測(cè)水平； 銨鹽水平低于除了缺少所述培養(yǎng)基特征外的相同培養(yǎng)基相同條件下的觀測(cè)水平；且 產(chǎn)生多肽的總量至少與除了缺少所述培養(yǎng)基特征外的相同培養(yǎng)基相同條件下所觀測(cè)的一樣高。
77.權(quán)利要求I的方法，其中在生產(chǎn)所述多肽的過程中不向所述培養(yǎng)物中添加額外成分。
78.權(quán)利要求I的方法，其中在生產(chǎn)所述多肽的過程中不向所述培養(yǎng)物中添加額外的谷氨酰胺。
79.權(quán)利要求I的方法，其中在轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙M培養(yǎng)條件的所述步驟前，所述培養(yǎng)物中谷氨酰胺濃度基本耗盡。
80.權(quán)利要求I的方法，其中大約在轉(zhuǎn)變?yōu)榈诙M培養(yǎng)條件的所述步驟的同時(shí)，所述培養(yǎng)物中谷氨酰胺濃度基本耗盡。
81.權(quán)利要求I的方法，其中用甘氨酰谷氨酰胺替代所述培養(yǎng)物中的谷氨酰胺。
82.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基含有(i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM, (ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2，(iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iv)累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1，以及(V)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM。
83.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基含有(i)每單位體積中累積氨基酸量大于約70mM, (ii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約O. 2，(iii)累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約O. 4至1，以及(iv)每單位體積谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積量大于約16mM。
84.權(quán)利要求I的方法，其中每單位體積所述培養(yǎng)基中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的累積總量大于約25mM。
85.權(quán)利要求I的方法，其中每單位體積所述培養(yǎng)基中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的累積總量大于約35mM。
86.權(quán)利要求I的方法，其中每單位體積所述培養(yǎng)基中組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的起始總量大于約25mM。
87.權(quán)利要求I的方法，其中每單位體積所述培養(yǎng)基內(nèi)組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸和脯氨酸的起始總量大于約35mM。
88.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基具有選自以下的培養(yǎng)基特征 (i)每單位體積中組氨酸累積總量大于約I.7mM ； (ii)每單位體積中異亮氨酸累積總量大于約3.5mM ； (iii)每單位體積中亮氨酸累積總量大于約5.5mM ； (iv)每單位體積中甲硫氨酸累積總量大于約2.OmM ； (V)每單位體積中苯丙氨酸累積總量大于約2. 5mM ； (vi)每單位體積中脯氨酸累積總量大于約2.5mM ； (vii)每單位體積中色氨酸累積總量大于約I.OmM ；(Viii)每單位體積中酪氨酸累積總量大于約2. OmM ;和 (ix)每單位體積中脯氨酸累積總量大于約2. 5mM。
89.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基具有選自以下的培養(yǎng)基特征 (i)每單位體積中組氨酸起始量大于約I.7mM ； (ii)每單位體積中異亮氨酸起始量大于約3.5mM ； (iii)每單位體積中亮氨酸起始量大于約5.5mM ； (iv)每單位體積中甲硫氨酸起始量大于約2.OmM ； (V)每單位體積中苯丙氨酸起始量大于約2. 5mM ； (vi)每單位體積中脯氨酸起始量大于約2.5mM ； (vii)每單位體積中色氨酸起始量大于約I.OmM ； (viii)每單位體積中酪氨酸起始量大于約2.OmM ;和 (ix)每單位體積中脯氨酸起始量大于約2.5mM。
90.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積絲氨酸累積總量大于約7mM。
91.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積絲氨酸累積總量大于約10mM。
92.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積天冬酰胺累積總量大于約8mM。
93.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積天冬酰胺累積總量大于約12mM。
94.權(quán)利要求I的方法,其中所述培養(yǎng)基中每單位體積天冬酰胺起始總量大于約8mM。
95.權(quán)利要求I的方法,其中所述培養(yǎng)基中每單位體積天冬酰胺起始總量大于約12mM。
96.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積磷的累積總量大于約2.5mM。
97.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積磷的累積總量大于約5mM。
98.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積谷氨酸的累積總量小于約ImM。
99.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積泛酸鈣的累積總量大于約8mg/L0
100.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積泛酸鈣的累積總量大于約20mg/L。
101.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積煙酰胺的累積總量大于約7mg/L0
102.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積煙酰胺的累積總量大于約25mg/L。
103.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積吡哆醇和吡哆醛的累積總量大于約5mg/L。
104.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積吡哆醇和吡哆醛的累積總量大于約 35mg/L。
105.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積核黃素的累積總量大于約1.0mg/Lo
106.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積核黃素的累積總量大于約2.Omg/Lo
107.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積鹽酸硫胺素的累積總量大于約7mg/L。
108.權(quán)利要求I的方法，其中所述培養(yǎng)基中每單位體積鹽酸硫胺素的累積總量大于約35mg/L。
109.權(quán)利要求1-23或權(quán)利要求25-75或權(quán)利要求77-108中任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽為抗⑶F-8。
110.權(quán)利要求1-23或權(quán)利要求25-75或權(quán)利要求77-108中任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽為抗LewY。
111.權(quán)利要求24的方法，其中所述多肽為抗GDF-8。
112.權(quán)利要求24的方法，其中所述多肽為抗LewY。
113.權(quán)利要求76的方法，其中所述多肽為抗GDF-8。
114.權(quán)利要求76的方法，其中所述多肽為抗LewY。
全文摘要
本發(fā)明提供在細(xì)胞培養(yǎng)物中大規(guī)模生產(chǎn)蛋白質(zhì)和/或多肽的改良系統(tǒng)，特別是在具有下列一項(xiàng)或多項(xiàng)特征的培養(yǎng)基中i)累積氨基酸濃度大于約70mM；ii)累積谷氨酰胺與累積天冬酰胺的摩爾比率小于約2；iii)累積谷氨酰胺與累積總氨基酸的摩爾比率小于約0.2；iv)累積無機(jī)離子與累積總氨基酸的摩爾比率為約0.4至1；或v)谷氨酰胺與天冬酰胺的組合累積濃度在約16mM和36mM之間。此類系統(tǒng)的應(yīng)用使能夠產(chǎn)生高水平的蛋白質(zhì)，并減少某些不良因子如銨鹽和/或乳酸鹽的蓄積。此外，(本發(fā)明)還提供了包括溫度改變的培養(yǎng)方法，通常包括當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到其最大細(xì)胞密度約20-80%時(shí)降低溫度。備選地或額外地，本發(fā)明提供了使培養(yǎng)物中乳酸鹽和/或銨鹽水平達(dá)到峰值后降低的方法。
文檔編號(hào)C12P21/02GK102827905SQ20121018972
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2005年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月27日
發(fā)明者D·德拉波, Y-T·盧安, J·R·梅瑟, W·王, D·R·拉斯科 申請(qǐng)人:輝瑞愛爾蘭藥品合伙公司