專(zhuān)利名稱(chēng)：冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢合成代謝黃嘌呤的酶、基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー個(gè)來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢的參與鳥(niǎo)嘌呤出發(fā)合成代謝黃嘌呤的鳥(niǎo)嘌呤脫氨酶，編碼這個(gè)酶的基因及其應(yīng)用。
(ニ)
背景技術(shù)：
冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲(chóng)夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)(Hepialus a rmoricanus Oberthur)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲(chóng)體)。冬蟲(chóng)夏草是ー類(lèi)珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲(chóng)夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推祟。中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲(chóng)夏草入肺腎ニ經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽(yáng)，主治腎虛，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的ー種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)，冬蟲(chóng)夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲(chóng)夏草菌是ー種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無(wú)性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實(shí)際生產(chǎn)中使用的是無(wú)性階段的冬蟲(chóng)夏草菌，因而冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型的鑒定非常重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在冬蟲(chóng)夏草資源調(diào)查、無(wú)性型確證、活性成分分離分析和作用機(jī)理、開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢已被證明是冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型存在形式，具有與天然冬蟲(chóng)夏草相同的活性成分和藥效。天然蟲(chóng)草具有嚴(yán)格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產(chǎn)量很低，價(jià)格高昂。野生冬蟲(chóng)夏草由于受生長(zhǎng)環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進(jìn)展不大，野生冬蟲(chóng)夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液，是解決冬蟲(chóng)夏草藥源的一種有效途徑。蟲(chóng)草發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草替代品，既可有效保護(hù)蟲(chóng)草這ー珍貴資源，又不受氣候、地理環(huán)境和蟲(chóng)草寄生條件嚴(yán)格的限制，適合于エ業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲(chóng)草相似，因而國(guó)內(nèi)外一直致カ于蟲(chóng)草菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢得到的菌絲，經(jīng)毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲(chóng)草化學(xué)組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲(chóng)草生產(chǎn)蟲(chóng)草制品，以彌補(bǔ)自然資源的短缺，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌絲體生物量和代謝產(chǎn)物的量均有明顯提尚。近年來(lái)，隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和現(xiàn)代色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，在對(duì)蟲(chóng)草產(chǎn)品研發(fā)中已逐步由蟲(chóng)草原料或粗提物的直接利用轉(zhuǎn)向更深層次的功能性代謝產(chǎn)物研究。國(guó)內(nèi)外已對(duì)蟲(chóng)草代謝產(chǎn)物做了大量的研究，代謝產(chǎn)物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類(lèi)化合物，其中嘌呤類(lèi)核苷、蟲(chóng)草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產(chǎn)物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見(jiàn)成效。核苷類(lèi)是蟲(chóng)草最主要的活性物質(zhì)之一，其中嘌呤類(lèi)核苷包括腺苷和鳥(niǎo)苷及它們的前體類(lèi)物質(zhì)次黃嘌呤核苷(肌苷)和黃嘌呤核苷等。研究表明腺苷可作為心臟病治療藥物，還可用于診斷冠心病，其類(lèi)似物具有抗病毒活性和抗腫瘤作用；肌苷可用于心臟病、肝病、白血球減少癥、血小板減少癥、視神經(jīng)萎縮和中心性視網(wǎng)膜炎等疾病的治療，能預(yù)防及解除由血防藥物引起的對(duì)心臟或肝臟的副作用；鳥(niǎo)苷則可作為三氮唑核苷、無(wú)環(huán)鳥(niǎo)苷等許多抗病毒藥物的合成原料。由于嘌呤核苷及其類(lèi)似物的重要生理作用，國(guó)內(nèi)外有關(guān)微生物生產(chǎn)嘌呤類(lèi)核苷已有很多石開(kāi)Matsui 等(Matsui, Sato et al. Mutation of an inosine-producingstrain of Bacillus subtilis to DL—metnionine sulfoxide resistance for guanosineproduction[J]. Applied and Environmental Microbiology,1997, 34(4):337-341.)對(duì)肌苷生產(chǎn)菌B. subtilisl411進(jìn)行誘變處理得到鳥(niǎo)苷高產(chǎn)菌AG169。為了進(jìn)一步提高生產(chǎn)水平，國(guó)內(nèi)有研究人員對(duì)生產(chǎn)菌中嘌呤核苷合成途徑的遺傳 背景進(jìn)行了研究(Qian，Caiet al. Analysis of three nucieotiae sequences involved m purine nucieotiaesbiosynthesis in inosine and guanosine-producing bacilus subtilis.ActaMicrobiologica Sinica, 2003,43(2) :200-205.)。該研究從分子水平掲示了生產(chǎn)菌的部分遺傳特性，有助于在基因水平理解產(chǎn)物在生產(chǎn)菌中的積累。目前，所應(yīng)用的嘌呤類(lèi)核苷生產(chǎn)菌以枯草芽孢桿菌為主，而作為重要合成代謝嘌呤類(lèi)核苷的冬蟲(chóng)夏草菌，還只停留在代謝產(chǎn)物成分分析和功效的研究上，對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌嘌呤類(lèi)核苷合成代謝途徑中相關(guān)基因和蛋白的研究還很少見(jiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對(duì)以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問(wèn)題，對(duì)“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢合成代謝黃嘌呤的酶及其編碼基因進(jìn)行深入研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與鳥(niǎo)嘌呤出發(fā)合成代謝黃嘌呤的酶、編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是ー個(gè)來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與鳥(niǎo)嘌呤出發(fā)合成代謝黃嘌呤的鳥(niǎo)嘌呤脫氨酶序列為SEQ ID No. I的punGl蛋白和序列為SEQ ID No. 2的punG2蛋白；該酶可催化鳥(niǎo)嘌呤制備黃嘌呤。由鳥(niǎo)嘌呤合成代謝獲得黃嘌呤的路徑如下
權(quán)利要求
1.ー個(gè)來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢的參與鳥(niǎo)嘌呤合成代謝黃嘌呤的鳥(niǎo)嘌呤脫氨酶序列為SEQ ID No. I的punGl蛋白和序列為SEQ ID No. 2的punG2蛋白。
2.如權(quán)利要求I所述的鳥(niǎo)嘌呤脫氨酶在生物催化鳥(niǎo)嘌呤制備黃嘌呤中的應(yīng)用。
3.編碼權(quán)利要求I所述鳥(niǎo)嘌呤脫氨酶的基因。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述基因?yàn)樾蛄袨镾EQID No. 3的punGl基因和序列為SEQ ID No. 4的punG2基因。
5.如權(quán)利要求3或4所述的基因在構(gòu)建能夠生物催化鳥(niǎo)嘌呤制備黃嘌呤的基因工程菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與鳥(niǎo)嘌呤出發(fā)合成代謝黃嘌呤的鳥(niǎo)嘌呤脫氨酶，編碼這個(gè)酶的基因及其應(yīng)用。所述鳥(niǎo)嘌呤脫氨酶，包括SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的蛋白，其編碼基因分別對(duì)應(yīng)為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。本發(fā)明從原理上對(duì)鳥(niǎo)嘌呤合成黃嘌呤的代謝途徑進(jìn)行了詳細(xì)研究，包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來(lái)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過(guò)調(diào)節(jié)黃嘌呤生物合成基因的表達(dá)，賦予宿主黃嘌呤的高表達(dá)性，為擴(kuò)大黃嘌呤的產(chǎn)量提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N1/15GK102690800SQ20121017374
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月28日
發(fā)明者吳暉, 李邦良, 柳志強(qiáng), 王鴻艷, 薛亞平, 袁水金, 許峰, 許靜, 鄭裕國(guó), 陳麗芳 申請(qǐng)人:杭州中美華東制藥有限公司, 浙江工業(yè)大學(xué)