專利名稱：一株產(chǎn)甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株內(nèi)生真菌。
背景技術(shù)：
甘草為豆科(Leguminosae)甘草屬(Glycyrrhiza Linn)屬烏拉爾甘草(G. uralensis Fisch)，脹果甘草(G. inflate Bat)和光果甘草(G. glabra L)的干燥根和根莖，廣泛分布于我國東北、西北及華北等地。甘草性味甘平，為補氣類中藥，具有補中益氣、清熱解毒、潤肺止咳、緩急止痛、調(diào)和藥性等功效。中醫(yī)處方離不開甘草，自古至今，廣為藥用，兼有“國老”的尊號。近年來，野生甘草因過度采挖強度而瀕臨滅絕，甘草已被列入《野生藥材資源保護條例》的國家二級保護植物。、植物內(nèi)生真菌是產(chǎn)生活性物質(zhì)和新化學(xué)物質(zhì)的潛在資源，不但可以幫助維護人類健康，也可以維護動物和植物的健康。實驗研究表明，藥用植物與內(nèi)生真菌在相互作用的過程中，有的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與植物相同或相似的活性物質(zhì)，因此從藥用植物中分離能夠產(chǎn)生活性物質(zhì)的內(nèi)生真菌已成為當(dāng)今學(xué)者的研究趨勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一株產(chǎn)甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌。本發(fā)明產(chǎn)甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌，它為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M 2012046，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日；它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，菌落直徑為6 8cm，中心凸起，菌落為白色，后中央變?yōu)樯罴t色，菌絲密集，氈狀，基質(zhì)深紅棕色，產(chǎn)分生孢子，分生孢子頭呈長圓筒形，分生孢子著生于單生瓶梗上，在瓶梗頂端聚成球團，分生孢子單生，單細胞，卵形。本發(fā)明甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌,它為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,其ITS序列提交至NCBI網(wǎng)頁，應(yīng)用BLAST分析進行同源性比較，采用MEGA 4. I軟件中Alignment Explorer對菌株RE5與相關(guān)菌株進行同源性分析,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,在系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株RE5與Fusarium oxysporum strain CPRI15在同一個分支上，其18S rDNA序列相似性為97%，與菌株RE5在同一簇上的其它菌都屬于鐮孢霉屬，相似性都是97%，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，確定菌株RE5應(yīng)歸于尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的一個新菌株。本發(fā)明產(chǎn)甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌,它為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M 2012046，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本發(fā)明利用微生物制藥手段提取分離野生甘草健康植株的內(nèi)生真菌RE5同時以甘草次酸為對照，采用HPLC法分析檢測RE5的發(fā)酵液，結(jié)果從甘草內(nèi)生真菌RE5發(fā)酵液中檢測到甘草的主要活性成分甘草次酸，說明內(nèi)生真菌RE5能夠產(chǎn)生與宿主藥用植物甘草相同的活性成分——甘草次酸。將獲得的RE5菌株通過形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA序列分析鑒定其種屬。本發(fā)明產(chǎn)甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌,它為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,其代謝物具有較好的抑菌活性，同時從其代謝物中發(fā)現(xiàn)其含有甘草次酸，本發(fā)明對采用甘草內(nèi)生真菌RE5生產(chǎn)甘草次酸具有指導(dǎo)意義。


圖I為具體實施方式
一中尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)RE5的菌落形態(tài)圖；圖2為具體實施方式
一中尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的孢子顯微結(jié)構(gòu) 圖；圖3為具體實施方式
一中尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的18S rDNA提取后進行擴增，PCR檢測結(jié)果的電泳圖，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RE5 ；圖4為具體實施方式
一中尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的菌落PCR檢測結(jié)果的電泳圖，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RE5 ；圖5為具體實施方式
一中尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的系統(tǒng)進化樹；圖6為具體實施方式
一中甘草次酸對照品的HPLC色譜圖，其中a表示甘草次酸；圖7為具體實施方式
一中供試品RE5的HPLC色譜圖，其中a表示甘草次酸；圖8為具體實施方式
一中加入對照品后供試品RE5的HPLC色譜圖，其中a表示甘草次酸；圖9為具體實施方式
一中空白對照品的HPLC色譜圖。
具體實施例方式具體實施方式
一本實施方式產(chǎn)甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌，它為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) RE5,已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號為CCTCC No M2012046，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本實施方式中尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) RE5,它在PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d后，菌落直徑為6 8cm，中心凸起，菌落為白色，后中央變?yōu)樯罴t色，菌絲密集，氈狀，基質(zhì)深紅棕色，產(chǎn)分生孢子，分生孢子頭呈長圓筒形，分生孢子著生于單生瓶梗上，在瓶梗頂端聚成球團，分生孢子單生，單細胞，卵形。本實施方式中尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) RE5,其生長溫度為28°C,生長pH值自然。本實施方式中產(chǎn)甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌，它為尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum) RE5,該菌株分離自健康的野生甘草的根莖，采自大慶地區(qū),植株年齡3年,植株健壯，無病蟲害，其樣本現(xiàn)存于黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物制藥專業(yè)實驗室；它按以下步驟進行分離培養(yǎng)選取健康的野生甘草的根莖用自來水沖洗干凈后以無菌濾紙吸干水分，切成Icm小段，然后于無菌超凈臺內(nèi)將甘草的根莖按下述方法進行表面消毒75%酒精浸泡lmin-2%次氯酸鈉浸泡15min-無菌水沖洗3次；用無菌手術(shù)刀將野生甘草的根莖從中間切開，分別置于5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基和5%甘草提取液馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基中，于28°C恒溫水浴搖床和恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3 5d,待實驗材料周圍長出菌體，挑取菌體轉(zhuǎn)入平板多次劃線分離純化，將純化后的菌株置于斜面固體培養(yǎng)基中，4°C保存?zhèn)溆?；其?%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖、20g的瓊脂和余量的5%甘草提取液組成，pH值為7. 0 7. 2，121°C下高壓滅菌30min ；5%甘草提取液馬鈴薯液體分離培養(yǎng)基每L由200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖和余量的5%甘草提取液組成，pH值為7. 0 7. 2，121 °C下高壓滅菌30min ；’斜面固體培養(yǎng)基為取5mL5%甘草提取液馬鈴薯固體分離培養(yǎng)基裝于試管中，121°C高壓滅菌30min后，鋪成斜面冷卻，以備保存菌種。結(jié)果從野生甘草的根莖中分離出內(nèi)生真菌RE5，并且陰性對照中對照平板和對照液體培養(yǎng)基內(nèi)均無任何菌長出，多次重復(fù)均如此，證明所分到的菌是植物內(nèi)生真菌，而不是表面的附生菌。篩選出的內(nèi)生真菌RE5根據(jù)《真菌分類學(xué)》、《真菌鑒定手冊》和《半知菌屬圖解》進行形態(tài)學(xué)鑒定，其菌株的形態(tài)學(xué)特征與鐮孢霉屬菌特征極為相近，菌落形態(tài)如圖I所示，孢子顯微結(jié)構(gòu)如圖2所示；分子鑒定內(nèi)生真菌RE5發(fā)酵液抽濾得菌絲體用25 %乙醇漂洗2次，滅菌的去離子水沖洗2次，吸干殘余液體，使沉淀盡可能干燥，然后在液氮中迅速研磨成粉末，提取總DNA后進行目的片段的PCR擴增，將含有目標(biāo)條帶的PCR產(chǎn)物全部進行再一次的點樣，用2%的瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下用解剖刀將目的條帶切下，用上海生工UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收，制備大腸桿菌感受態(tài)細胞，將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體進行連接后，連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細胞中，進行菌落PCR驗證；挑取單菌落進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化子的PCR檢測，證明目的片段已成功轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)細胞中后，將克隆陽性菌株送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序；所測定的核苷酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用BLAST分析進行同源性比較，并根據(jù)分子系統(tǒng)學(xué)研究的基本原理選擇相應(yīng)種屬代表菌株的18S rDNA序列應(yīng)用軟件CLUSTALX 1.83和1^6八4. I以近鄰結(jié)合法(Neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap檢驗值> 50% (1000重復(fù))，確定目標(biāo)菌株的分類地位；內(nèi)生真菌RE5菌株18S rDNA提取后進行擴增，PCR檢測結(jié)果見圖3，結(jié)果顯示菌株的18S rDNA大小約為500kb，可直接用于連接T載體。菌落PCR檢測結(jié)果(如圖4所示)表明目的片段已經(jīng)轉(zhuǎn)入T載體，并成功在大腸桿菌中擴增，可將陽性克隆菌株送往上海英駿生物技術(shù)有限公司測序,結(jié)果甘草內(nèi)生真菌RE5測出序列總長為544bp，喊基序列見SEQ ID NO 1 ； 測序結(jié)果應(yīng)用BLAST分析進行同源性比較，采用MEGA4. I軟件中Al ignmentExplorer對菌株RE5與相關(guān)菌株進行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖5所示)，在系統(tǒng)發(fā)育樹中，菌株RE5與Fusarium oxysporum strain CPRI15在同一個分支上，其18S rDNA序列相似性為97%，與菌株RE5在同一簇上的其它菌都屬于鐮孢霉屬，相似性都是97%，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果，確定菌株RE5應(yīng)歸于尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的一個新菌株。采用瓊脂塊法測定甘草內(nèi)生真菌的抑菌活性將已分離到的內(nèi)生真菌RE5接種于PDA培養(yǎng)基(200g的馬鈴薯、20g的葡萄糖、20g的瓊脂和IOOOmL的水組成，pH自然，121°C滅菌20min)上，28 °C培養(yǎng)4_7天，待培養(yǎng)基內(nèi)有明顯的顏色變化后，用直徑為6mm的打孔器打取菌餅，放在含菌平板上，每株真菌做3個重復(fù)，用PDA培養(yǎng)基做陰性對照，用含鏈霉素和制霉素PDA培養(yǎng)基做陽性對照，制備好的平板在37°C恒溫培養(yǎng)24h后觀察，十字交叉法測量抑菌圈直徑(Φ)。甘草內(nèi)生真菌RE5對12種試驗菌的抑菌活性實驗結(jié)果見表I。表I

試驗菌株:A :金黃色葡萄球菌；B :短小芽孢桿菌；C :枯草芽孢桿菌；D :單增李斯特菌；E :釀膿鏈球菌；F :糞腸球菌；G :屎腸球菌；H :大腸桿菌；1 :肺炎克雷伯菌J :鮑曼不動桿菌；K :銅綠假單孢菌；L 白假絲酵母；Str :鏈霉素；Nys :制霉素。-無活性；+活性較弱，抑菌圈直徑< IImm ;++活性中等，抑菌圈直徑Il-15mm ；+++活性較強，抑菌圈直徑>15mm。甘草內(nèi)生真菌RE5的抑菌活性實驗結(jié)果表明，內(nèi)生真菌RE5具有抑制細菌生長的潛在活性物質(zhì)。甘草內(nèi)生真菌RE5發(fā)酵液的抑菌活性甘草內(nèi)生真菌RE5的發(fā)酵液對12種試驗菌的抑菌活性實驗結(jié)果見表2，結(jié)果表明甘草內(nèi)生真菌RE5的發(fā)酵液具有一定的抑菌活性。表 2
樣品"|A B 「C Γ D I E F Γ G 「H l' I J [K 「L
發(fā)酵液 +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ +++ 一一-一 Str+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 一
Nys- -- -- -- -- -- +++試驗菌株:A :金黃色葡萄球菌；B :短小芽孢桿菌；C :枯草芽孢桿菌；D :單增李斯特菌；E :釀膿鏈球菌；F :糞腸球菌；G :屎腸球菌；H :大腸桿菌；1 :肺炎克雷伯菌J :鮑曼不動桿菌；K :銅綠假單孢菌；L 白假絲酵母；Str :鏈霉素；Nys :制霉素。-無活性；+活性較弱，抑菌圈直徑< IImm ;++活性中等，抑菌圈直徑Il-15mm ；+++活性較強，抑菌圈直徑>15mm。甘草內(nèi)生真菌RE5的活性代謝物檢測I色譜條件色譜柱VenusiLXBP-C18 柱(4. 6mmX 250mm，5 μ m);流動相甲醇-水-冰醋酸(85 14 I)；
流速ImL· mirf1 ；檢測波長254nm；柱溫25°C；進樣量10 μし2對照品溶液的制備精密稱取甘草次酸對照品適量，以甲醇制成lmg/mL的對照品儲備液，精確量取對照品儲備液O. 5mL,置于ImL量瓶中以甲醇稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為O. 5mg/mL甘草次酸對照品溶液，保存于4°C冰箱備用。
3空白對照品溶液的制備將含有50mL PDA液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶，置于28°C 120r/min空氣浴搖床中，培養(yǎng)15天取出，過濾后得到的濾液，40°C減壓蒸懼，真空抽干后，加入ImL無菌水溶解，即為空白對照品溶液，保存于4°C冰箱備用。4供試品溶液的制備分別挑取已活化的甘草內(nèi)生真菌RE5接種于含50mL PDA液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，作10個重復(fù)，置于28°C 120r/min空氣浴搖床中，培養(yǎng)15天取出，過濾后得到的濾液，40°C減壓蒸餾，真空抽干后，加入ImL無菌水溶解，保存于4°C冰箱備用。供試品中甘草次酸的鑒別采用對照品加入法。5高效液相色譜檢測結(jié)果甘草內(nèi)生真菌RE5發(fā)酵液中含有甘草次酸，在色譜條件下，供試品與甘草次酸對照品相應(yīng)位置的色譜峰一致，而且色譜峰經(jīng)過對照品加入法得到了較好的確認(rèn)，結(jié)果見圖6，圖7，圖8及圖9?？瞻讓φ諢o干擾。結(jié)論甘草內(nèi)生真菌RE5為尖孢錸刀菌Fusarium oxysporum,其代謝物具有較好的抑菌活性，同時從其代謝物中發(fā)現(xiàn)其含有甘草次酸，說明甘草內(nèi)生真菌RE5能夠產(chǎn)生甘草次酸。本發(fā)明對采用甘草內(nèi)生真菌RE5生產(chǎn)甘草次酸具有指導(dǎo)意義。
權(quán)利要求
1. 一株產(chǎn)甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌，其特征在于它為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)RE5，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC No M 2012046，保 藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。
全文摘要
一株產(chǎn)甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌，它涉及一株內(nèi)生真菌。產(chǎn)甘草次酸的甘草內(nèi)生真菌，它為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)RE5，已在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號為CCTCC NoM 2012046，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2012年2月29日。本發(fā)明中尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)RE5，其代謝物具有較好的抑菌活性，同時從其代謝物中發(fā)現(xiàn)其含有甘草次酸，本發(fā)明對采用甘草內(nèi)生真菌RE5生產(chǎn)甘草次酸具有指導(dǎo)意義。
文檔編號C12P33/00GK102660467SQ20121017115
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月29日
發(fā)明者孔德崴, 孫雅北, 白長勝, 譚佳音, 鄭春英 申請人:黑龍江大學(xué)