一種甘草次酸的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種甘草次酸的制備方法，包括（1）將β-葡萄糖苷酶液固定在多孔陶瓷球中得到多孔陶瓷球固定化酶，最后用丙烯酸樹脂油性膠黏劑溶液對干燥后的多孔陶瓷球固定化酶進行包封；（2）將甘草用pH8～9的氨水滲漉提取制備甘草提取液；（3）將步固定化β-葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，裝入柱床，然后將甘草提取液流入柱床進行酶反應，然后經(jīng)沉淀、過濾、結晶得到甘草次酸。本發(fā)明所述的制備方法相比酸水解催化法，反應條件溫和，不污染環(huán)境，且多孔陶瓷球固定化酶與游離的細胞或者酶催化法制備甘草次酸相比，酶催化體系更穩(wěn)定，一次投入可以反復使用，生產(chǎn)效率大大提高，非常適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種甘草次酸的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甘草次酸的的制備方法，屬于化學制備方法【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 甘草次酸是甘草提取物的深加工系列產(chǎn)品之一。甘草（Glycyrrhiza Uralensis Fisch)屬于豆科植物。我國西部、俄羅斯及歐洲分布較多。自古以來，甘草在很多國家廣 為藥用，尤其在我國醫(yī)藥學中許多的配方中都有甘草和甘草浸膏。近年來，隨著藥理活性 實驗方法的發(fā)展和完善，發(fā)現(xiàn)甘草具有明顯的抗炎，抗?jié)冏饔煤涂棺儜B(tài)反應作用，上述 作用主要歸因于甘草的主要成分甘草甜素和甘草次酸及其衍生物。因此，甘草次酸及其衍 生物的研究開發(fā)，是近幾十年來各國科學家研究的熱點之一。1937年，Ruzicka確定了甘 草次酸屬于五環(huán)三燕類化合物，有不同的光學異構體如18 α-，18 β -甘草次酸。
[0003] 圖1為18 β -甘草次酸結構式。
[0004] 如圖1所示：18 β-甘草次酸，是甘草中所含三菇類化合物甘草甜素（即甘草酸 鹽GL)水解后脫去兩分子萄糖醛酸的產(chǎn)物。
[0005] 通?？梢圆捎盟岽呋兔复俅呋磻獜母什菟峄蛘吒什萏崛∥镏兄苽涓什荽嗡?。 眾所周知，酸催化水解法制備甘草次酸產(chǎn)生廢液不容易處理，對環(huán)境污染較重，而且副產(chǎn)物 多，收率低，因此該工藝的應用受到限制。微生物酶法轉化，是利用β_葡萄糖苷酶水解去 除掉甘草酸兩個糖醛酸側鏈，相對酸水解法，反應條件溫和、轉化率高，但存在使用次數(shù)有 限，每次需要重新發(fā)酵制備酶，周期較長。例如在專利201110336688. 7中發(fā)酵真菌，應用真 菌水解酶加入到甘草酸溶液中進行轉化制備甘草次酸。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了克服現(xiàn)有技術問題，本發(fā)明的目的在于提供一種縮短酶催化的生產(chǎn)周期，提 高生產(chǎn)效率的甘草次酸的制備方法。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為： 一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： β -葡萄糖苷酶的固定化：向多孔陶瓷球中加入β -葡萄糖苷酶液，所述的多孔陶瓷球 和β -葡萄糖苷酶液的質量比為100 :〇. 3?1. 5,所述的β -葡萄糖苷酶液中β -葡萄糖 苷酶的質量百分含量為0.2?0.9%，然后加入戊二醛至終濃度為0.3?0.8%，在120r/min 的轉速下室溫震蕩交聯(lián)2?6h后，在45飛5°C溫度條件下干燥8?10h得到多孔陶瓷球固定 化酶，最后用丙烯酸樹脂油性膠黏劑對干燥后的多孔陶瓷球固定化酶進行包封； (2) 制備甘草提取液：將甘草用pH= 8?9的氨水滲漉提取，且漉的流速為5?8ml/ min. kg,所述的甘草的質量和氨水的體積比為lg : (8?12)ml，然后用濃度為0. 2、. 8mol/ L的磷酸調節(jié)溶液的pH至6. 0,得到含有甘草酸的甘草提取液； (3) 制備甘草次酸：將步驟（1)制備得到的固定化β -葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，裝入 柱床，首先用濃度為50mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液淋洗，并控制柱床溫度32? 45°C，然后將甘草提取液流入柱床進行酶反應，流速為0. 5~1. 5BV/h，流出液重復上樣循環(huán) 3?4次，酶反應完畢，將反應液調節(jié)pH至2. 0,甘草次酸沉淀完全后過濾，最后用二氯甲烷 結晶2次，得到甘草次酸。
[0008] 進一步，步驟（1)中所述的多孔陶瓷球的孔徑為50?200 μ m，直徑3?5mm。
[0009] 步驟（1)中所述的β -葡萄糖苷酶液為β -葡萄糖苷酶通過濃度為50mmol/L的 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配置而成，且所述的β-葡萄糖苷酶液中β-葡萄糖苷酶的質 量百分含量為0. 2?0. 9%。
[0010] 步驟（1)中所述的戊二醛溶液的濃度為〇· 2?0· 8%。
[0011] 且，步驟（1)中所述的丙烯酸樹脂油性膠黏劑溶液的溶劑為丙酮，所述的丙烯酸樹 脂油性膠黏劑溶液的終濃度為0. 2?0. 8%。
[0012] 多孔陶瓷材料是在材料成形與燒結的過程中通過控制孔徑大小和分布而形成的 一類陶瓷產(chǎn)品。多孔陶瓷一直倍受生物、環(huán)保領域科研人員的青睞，這是因為它作為生物催 化劑的載體具有無毒害作用、穩(wěn)定性優(yōu)異、傳質性能好、機械強度高、生物親合性好、操作簡 單、價廉易得等優(yōu)點。固定化酶技術就是用化學或物理的方法將活性酶定位于材料的限定 空間中，并使其保持生物活性且可反復利用的生物技術，多孔陶瓷對生物的固定作用力主 要有以下幾種：范德華力、靜電引力、共價鍵等，多孔陶瓷微球具有很好的機械強度和裝柱 后微球內(nèi)的固定化酶具有很好的重復使用活性。
[0013] 本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明所述的制備方法相比酸水解催化法，反應條件溫和， 不污染環(huán)境，且多孔陶瓷球固定化酶與游離的細胞或者酶催化法制備甘草次酸相比，酶催 化體系更穩(wěn)定，一次投入可以反復使用，生產(chǎn)效率大大提高，非常適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

【具體實施方式】
[0014] 下面結合具體實施例詳細說明本發(fā)明。
[0015] 在本發(fā)明所述的所有實施例中，應用到的β-葡萄糖苷酶液為β-葡萄糖苷酶通 過濃度為50mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配置而成；且所述的丙烯酸樹脂油性膠黏 劑溶液的溶劑為丙酮。
[0016] 實施例1 : 甘草次酸的制備方法包括以下步驟： (1) β -葡萄糖苷酶的固定化：向l〇g洗凈干燥后的多孔陶瓷球(孔徑為50 μ m，直徑 3mm)中加入100ml β -葡萄糖苷酶液(所述的β -葡萄糖苷酶液中β -葡萄糖苷酶的質量 百分含量為〇. 6%)，然后加入戊二醛至終濃度為0. 3%，在120r/min的轉速下室溫震蕩交聯(lián) 4h后，在55°C溫度條件下干燥8h得到多孔陶瓷球固定化酶，最后用終濃度為0. 2%的丙烯 酸樹脂油性膠黏劑對干燥后的多孔陶瓷球固定化酶進行包封； (2) 制備甘草提取液：將100g甘草用lOOOmlpH 8?9的氨水滲漉提取，且漉流速為 5ml/min. kg),然后用0. 2mol/L的磷酸調節(jié)溶液的pH至6. 0,得到含有甘草酸的甘草提取 液； (3) 制備甘草次酸：將步驟（1)制備得到的固定化β-葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，裝入 柱床，首先用濃度為50mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液淋洗，并控制柱床溫度32°C，然 后將甘草提取液流入柱床進行酶反應，流速為〇. 5BV/h，流出液重復上樣循環(huán)3?4次，酶反 應完畢，將反應液調節(jié)pH至2. 0,甘草次酸沉淀完全后過濾，最后用二氯甲烷結晶2次，得到 甘草次酸。
[0017] 經(jīng)HPLC測試，所得產(chǎn)物甘草次酸的純度> 98%。
[0018] 實施例2: 甘草次酸的制備方法包括以下步驟： (1) β-葡萄糖苷酶的固定化：向l〇g洗凈干燥后的多孔陶瓷球(孔徑為ΙΟμπι，直徑 4mm)中加入100ml β -葡萄糖苷酶液(所述的β -葡萄糖苷酶液中β -葡萄糖苷酶的質量 百分含量為〇. 8%)，然后加入戊二醛至終濃度為0. 6%，在120r/min的轉速下室溫震蕩交聯(lián) 5h后，在50°C溫度條件下干燥8h得到多孔陶瓷球固定化酶，最后用終濃度為0. 7%的丙烯 酸樹脂油性膠黏劑對干燥后的多孔陶瓷球固定化酶進行包封； (2) 制備甘草提取液：將100g甘草用1200mlpH 8?9的氨水滲漉提取，且漉流速為 6ml/min. kg,然后用0. 3mol/L的磷酸調節(jié)溶液的pH至6. 0,得到含有甘草酸的甘草提取 液； (3) 制備甘草次酸：將步驟（1)制備得到的固定化β-葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，裝入 柱床，首先用濃度為50mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液淋洗，并控制柱床溫度35°C，然 后將甘草提取液流入柱床進行酶反應，流速為1. 〇BV/h，流出液重復上樣循環(huán)3?4次，酶反 應完畢，將反應液調節(jié)pH至2. 0,甘草次酸沉淀完全后過濾，最后用二氯甲烷結晶2次，得到 甘草次酸。
[0019] 經(jīng)HPLC測試，所得產(chǎn)物甘草次酸的純度> 98%。
[0020] 實施例3 : 甘草次酸的制備方法包括以下步驟： (1) β -葡萄糖苷酶的固定化：向l〇g洗凈干燥后的多孔陶瓷球(孔徑為200 μ m，直徑 5mm)中加入100ml β-葡萄糖苷酶液(所述的β-葡萄糖苷酶液中β-葡萄糖苷酶的質量 百分含量為〇. 7%)，然后加入戊二醛至終濃度為0. 8%，在120r/min的轉速下室溫震蕩交聯(lián) 6h后，在50°C溫度條件下干燥9h得到多孔陶瓷球固定化酶，最后用終濃度為0. 8%的丙烯 酸樹脂油性膠黏劑對干燥后的多孔陶瓷球固定化酶進行包封； (2) 制備甘草提取液：將100g甘草用lOOOmlpH 8?9的氨水滲漉提取，且漉流速為 86ml/min. kg),然后用0. 6mol/L的磷酸調節(jié)溶液的pH至6. 0,得到含有甘草酸的甘草提取 液； (3) 制備甘草次酸：將步驟（1)制備得到的固定化β-葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，裝入 柱床，首先用濃度為50mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液淋洗，并控制柱床溫度38°C，然 后將甘草提取液流入柱床進行酶反應，流速為1. 2BV/h，流出液重復上樣循環(huán)3?4次，酶反 應完畢，將反應液調節(jié)pH至2. 0,甘草次酸沉淀完全后過濾，最后用二氯甲烷結晶2次，得到 甘草次酸。
[0021] 經(jīng)HPLC測試，所得產(chǎn)物甘草次酸的純度> 98%。
[0022] 此外，上述實施例1-3中所述的反應柱上的多孔陶瓷球固定化酶，均可以連續(xù)使 用90天，酶活力任然在90%以上。
[0023] 本發(fā)明按照上述實施例進行了說明應當理解，上述實施例不以任何形式限定本發(fā) 明，凡采用等同替換或等效變換方式所獲得的技術方案，均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1. 一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) β-葡萄糖苷酶的固定化：向多孔陶瓷球中加入β-葡萄糖苷酶液，所述的多孔陶 瓷球和β -葡萄糖苷酶液的質量比為100 :〇. 3?1. 5,所述的β -葡萄糖苷酶液中β -葡萄 糖苷酶的質量百分含量為〇. 2?0. 9%，然后加入戊二醛至終濃度為0. 3?0. 8%，在120r/ min的轉速下室溫震蕩交聯(lián)2?6h后，在45飛5°C溫度條件下干燥8?10h得到多孔陶瓷球 固定化酶，最后用丙烯酸樹脂油性膠黏劑對干燥后的多孔陶瓷球固定化酶進行包封； (2) 制備甘草提取液：將甘草用pH= 8?9的氨水滲漉提取，且漉的流速為5?8ml/ min. kg,所述的甘草的質量和氨水的體積比為lg : (8?12)ml，然后用濃度為0. 2、. 8mol/ L的磷酸調節(jié)溶液的pH至6. 0,得到含有甘草酸的甘草提取液； (3) 制備甘草次酸：將步驟（1)制備得到的固定化β-葡萄糖苷酶的多孔陶瓷球，裝入 柱床，首先用濃度為50mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液淋洗，并控制柱床溫度32? 45°C，然后將甘草提取液流入柱床進行酶反應，流速為0. 5~1. 5BV/h，流出液重復上樣循環(huán) 3?4次，酶反應完畢，將反應液調節(jié)pH至2. 0,甘草次酸沉淀完全后過濾，最后用二氯甲烷 結晶2次，得到甘草次酸。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的多 孔陶瓷球的孔徑為50?200 μ m，直徑3?5mm。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的 β -葡萄糖苷酶液為β -葡萄糖苷酶通過濃度為50mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配 置而成，且所述的β -葡萄糖苷酶液中β -葡萄糖苷酶的質量百分含量為0. 2?0. 9%。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的戊 二醛溶液的質量濃度為2?6%。
5. 根據(jù)權利要求1所述的一種甘草次酸的制備方法，其特征在于，步驟（1)中所述的丙 烯酸樹脂油性膠黏劑溶液的溶劑為丙酮，且所述的丙烯酸樹脂油性膠黏劑溶液的終濃度為 0· 2 ?0· 8%。
【文檔編號】C12P33/06GK104087646SQ201410347000
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權日:2014年7月21日
【發(fā)明者】魏元剛, 楊永安, 鐘慧 申請人:江蘇天晟藥業(yè)有限公司