專利名稱：制備重組LD78β蛋白的新工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組蛋白制備領域，具體公開了一種利用基因重組技術制備重組LD78P蛋白的新工藝。
背景技術：
細胞因子(cytokine)是一類由免疫細胞合成和分泌的小分子多肽物質(zhì),它不僅能參與機體免疫調(diào)節(jié)、免疫細胞增殖、分化，同時也廣泛存在于機體的整個系統(tǒng)中并發(fā)揮重要的生理作用。主要包括淋巴細胞產(chǎn)生的淋巴因子、單核巨噬細胞產(chǎn)生的單核因子、白細胞介素(interleukin, IL)、干擾素(interferon, IFN)、集落刺激因子(colony stimulatingfactor, CSF)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、趨化因子(chemokine)、轉(zhuǎn)化生長因子 P (transforming growth factor 0，TGF 0 )等。
趨化因子在正常的免疫系統(tǒng)中對淋巴細胞的遷移、歸巢、激活、分化發(fā)育及炎癥的發(fā)生、血管生成，腫瘤生長等過程起著非常重要的作用。它是一類控制免疫細胞做定向遷移的細胞因子，其功能的行使是由趨化因子受體介導而完成。趨化因子的相對分子質(zhì)量在一般在8 12KDa之間，根據(jù)N端保守的半胱氨酸的數(shù)量及排列方式可分為4個亞家族Cys-X-Cys (CXC), Cys-Cys (CO, Cys (C)、Cys-X3-Cys (CX3C)亞家族。早在1986年Obaru等人在人類基因組中成功克隆出LD78 ^基因(Obaru，F(xiàn)ukudaet al. (1986). Journal 99:885-894)，此基因位于人類17號染色體長臂，編碼93個氨基酸殘基的多肽，其中1-23個氨基酸殘基為信號肽，在蛋白成熟過程中被切除；24-93個氨基酸殘基為LD78P蛋白的功能序列。LD78P蛋白質(zhì)屬于趨化因子的CC亞家族，其系統(tǒng)名為CL3L1 (chemokine (C-C motif) ligand 3-like I)，是 CCR1、CCR3 和 CCR5 的配體，對淋巴細胞和單核細胞有趨化作用。人類免疫缺陷病毒(HIV)是能夠感染人類免疫系統(tǒng)的慢病毒。自1981年首次發(fā)現(xiàn)至今，此病毒造成的獲得性免疫缺陷綜合癥都是一種無法徹底治療的高傳染性、高破壞力的疾病。HIV主要分為HIV-I和HIV-2兩種亞型，其中前者是主要的病原體。此病毒通過與免疫細胞的CD4受體結合而感染宿主細胞。隨著研究發(fā)現(xiàn)，此病毒同時依賴輔助受體CCR5或 CXCR4 (Liu, Reid et al. (2007). Journal 9:120-130)。因此這些受體成為了新藥研發(fā)的靶點，并且?guī)追NCCR5抑制劑正處于臨床實驗階段。利用何種趨化因子受體侵入細胞決定了 HIV-I病毒株的嗜性。單核細胞/巨噬細胞嗜性的病毒株利用趨化因子受體CCR5侵入細胞，稱為R5嗜性；T細胞嗜性的病毒株利用趨化因子受體CXCR4侵入細胞，稱為X4嗜性；而既能利用CCR5，又能利用CXCR4侵入細胞的病毒株稱為R5/X4嗜性。HIV-lgpl20與何種輔助受體結合是隨著HIV-I侵入靶細胞的不同階段而有所變化的，通常在感染的初期是以CCR5為輔助受體；隨著感染程度的加深，HIV-I由R5嗜性轉(zhuǎn)化為R5/X4嗜性，而雙嗜性的HIV-I是以CXCR4為主要輔助受體。RANTES, MIP-I a 是 CCR5 的天然受體，而 LD78 ^ (CCL3L1)是 MIP-1 a 的同種型(即MIP-IP )，兩者的區(qū)別是僅有3個氨基酸殘基不同，但是誘導細胞內(nèi)Ca2+釋放及增強細胞趨化作用的能力遠強于RANTES和MIP-I a，它能特異性地與CCR5結合，并下調(diào)CCR5在人類單核細胞和巨噬細胞上的表達，抑制R5病毒株的感染(Meddows-Taylor，Donninger etal. (2006). Journal 87:2055-2065)。LD78 ^ 具有比 RANTES 高 10 倍的抑制病毒侵入活性，因此可能是最有效的治療HIV的趨化因子類藥物(Nibbs，Yang et al. (1999). Journal274:17478-17483)。同時基因組中LD780基因拷貝數(shù)的多少于HIV和乙肝感染發(fā)病幾率呈負相關(Mamtani, Rovin et al. (2008). Journal 67:1076-1083)。鑒于LD78 ^ (CCL3L1)在臨床和科學研究上的前景及應用，以及天然產(chǎn)品表達量極底，在分離純化技術上存在很大難度，應用重組DNA技術即基因工程的方法制備重組人LD78P (CCL3L1)有著重要的意義。目前國際上還沒有一種高效生產(chǎn)LD78P的方法。實驗室中常用病毒轉(zhuǎn)染真核細胞或?qū)雖RNA進行蛋白表達和功能研究，但是真核細胞表達蛋白成本高，操作難且不易放大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種成本低、產(chǎn)量高，有利于大規(guī)模生產(chǎn)的利用基因重組技術制備重組人LD78 0蛋白(CCL3L1)的新工藝。本發(fā)明利用基因工程的方法，人工合成表達重組LD780蛋白的重組基因EK-LD78 ^，將該重組基因序列插入表達載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞，通過發(fā)酵，分離純化等步驟獲得重組LD78P蛋白。本發(fā)明的技術方案為一種重組LD78P蛋白的制備工藝，具體步驟如下I)人工合成表達重組LD78 P蛋白的重組基因EK-LD78 @，所述重組基因EK-LD78P的序列包括左右兩端的限制性酶切位點序列，以及兩端限制性酶切位點序列之間的、5’至3’方向依次排列的腸激酶識別位點序列和重組LD78P蛋白基因序列；2)重組質(zhì)粒的構建將上一步的重組基因EK-LD78P插入載體，獲得含有重組LD780蛋白基因序列的重組質(zhì)粒；3)基因工程菌的制備將上一步獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞制備基因工程菌；4)外源基因的表達基因工程菌發(fā)酵表達含有重組LD78P蛋白的融合蛋白；5)目的蛋白的純化裂解菌體，收集融合蛋白，通過融合蛋白的酶切、純化步驟獲得重組LD78P蛋白產(chǎn)品。所述腸激酶識別位點的氨基酸序列為DDDDK (SEQ ID NO: I);所述腸激酶識別位點的核苷酸序列為GACGACGACGACAAG (SEQ ID NO:2)所述重組LD78 3蛋白基因序列為5’ gcaccacttg ctgctgacac gccgaccgcc tgctgcttca gctacacctc ccggcagattccacagaatt tcatagctgactactttgag acgagcagcc agtgctccaa gcccagtgtc atcttcctaaccaagcgagg ccggcaggtc tgtgctgaccccagtgagga gtgggtccag aaatatgtca gcgacctagagctgagtgcc taa 3’ (SEQ ID NO:3)較優(yōu)的，所述重組基因EK-LD78 ^序列左右兩端的限制性酶切位點分別為Kpn I酶和Hind III酶的限制性酶切位點。更優(yōu)的，所述重組基因EK-LD78 ^序列5’至3’方向依次為Kpn I酶的限制性酶切位點序列、腸激酶識別位點序列、重組LD78 0蛋白基因序列和Hind III酶的限制性酶切位點序列。最優(yōu)的，所述人工合成的表達重組LD78 ^蛋白的重組基因EK-LD78 ^的序列為5’ ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag gcaccacttg ctgctgacac gccgaccgcctgctgcttca gctacacctcccggcagatt ccacagaatt tcatagctga ctactttgag acgagcagccagtgctccaa gcccagtgtc atcttcctaaccaagcgagg ccggcaggtc tgtgctgacc ccagtgaggagtgggtccag aaatatgtca gcgacctaga gctgagtgcctaaaagcttg egg 3’ (SEQ ID NO:4)較優(yōu)的，所述載體為含有17強啟動子的原核表達載體。使用含有17強啟動子的原核表達載體可以利用IPTG進行誘導，顯著提高目的蛋白的表達水平。最優(yōu)的,所述載體為pET32a(+)。pET32a(+)載體含有Trx-Tag以及多個酶切位點，可以將本發(fā)明所述重組基因EK-LD78 ^插入到pET32a(+)的Kpn I酶和Hind III酶的酶切位點之間，與硫氧還蛋白(TrxA)融合表達，表達包含標簽蛋白、腸激酶識別位點和重組LD78P蛋白的融合蛋白，便于目的蛋白的分離純化。較優(yōu)的，所述宿主細胞為大腸桿菌。更優(yōu)的，所述宿主細胞為大腸桿菌BL21 (DE3)。BL21 (DE3)能高效表達控制于17啟動子和核糖體結合位點的外源基因，它不表達ompT和Ion (I)蛋白酶，因此表達產(chǎn)物比較穩(wěn)定，不會被菌株內(nèi)源性的蛋白酶所降解。較優(yōu)的，所述融合蛋白的酶切、純化步驟采用四步純化法，該四步純化法依次為親和層析、酶解融合蛋白、親和層析和離子交換層析。更優(yōu)的，所述四步純化法具體步驟為A.第一步親和層析Chelating Sepharose F. F.層析柱初步分離融合蛋白；B.酶解融合蛋白用腸激酶酶切步驟A分離的融合蛋白，獲得酶解液；C.第二步親和層析第二次采用Chelating Sepharose F. F.層析柱,純化步驟B所得的酶解液，分離得到初步純化的重組LD78P蛋白；D.離子交換層析離子交換柱進一步純化步驟C獲得的重組LD78P蛋白，得到進一步純化的重組LD78P蛋白產(chǎn)品。較佳的，所述步驟A第一步親和層析具體為用平衡液平衡填充有ChelatingSepharoseF. F.的親和柱；向菌體裂解處理后得到的上清液中加入咪唑、NaCI及磷酸鹽配置含有10 70禮咪唑、300 700mM NaCl，10 50禮磷酸鹽，pH值6. 0 9. 0的上樣溶液；將上樣溶液上柱，用平衡液清洗親和柱，最后用洗脫液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。較優(yōu)的，向菌體裂解處理后得到的上清液中加入咪唑、NaCI及磷酸鹽配置含有10 30禮咪唑、400 500mM NaCl，10 20禮磷酸鹽，pH值7. 5±0. 5的上樣溶液。更佳的，步驟A中所述平衡液為含10 70禮咪唑、300 700mM NaCl，pH值6. 0 9. 0，10"50mM的磷酸鹽緩沖液；洗脫液為含10(T300mM咪唑、300 700mM NaCl，pH值6. 0 9. 0，l(T50mM的磷酸鹽緩沖液。上樣溶液的流速為10mL/min，上樣結束后用4飛倍柱床體積的平衡液清洗親和柱。最佳的，步驟A中所述平衡液為含10 30mM咪唑、400 500mM NaCl，pH值7. 5±0. 5，10 20mM的磷酸鹽緩沖液；洗脫液為含250 300mM咪唑、400 500mM NaCl,pH值7. 5 ±0. 5，10 20mM的磷酸鹽緩沖液。較佳的，所述步驟B酶解融合蛋白具體為將第一步收集的活性蛋白峰流出液稀釋5 10倍后，用腸激酶進行處理，獲得酶解液；加入的腸激酶與融合蛋白的質(zhì)量比為I :500 2000，酶解反應溫度為4 40°C，酶切5 20小時。最佳的，所述步驟B酶解融合蛋白具體為將第一步收集的活性蛋白峰流出液稀釋5 10倍后，用腸激酶進行處理，獲得酶解液；加入的腸激酶與融合蛋白的質(zhì)量比為I :500 2000，酶解反應溫度12 16°C， 酶切16 20小時。融合蛋白的重量可通過考馬氏亮藍染色法(Bradford法)測定流出液的濃度來進行換算。較佳的，所述步驟C第二步親和層析具體為用平衡液I平衡填充有ChelatingSepharose F. F.的親和柱，將上一步得到的酶解液上柱后，用平衡液II清洗親和柱，收集流穿組分。更佳的，步驟C中所述平衡液I為pH值6. 0 9. 0，濃度10 50mM的磷酸鹽緩沖液；平衡液II為含10 70禮咪唑、300 800mM NaCl，pH值6. 0 9. 0，10 50禮磷酸鹽緩沖液。酶解液上柱的流速為10mL/min，上柱結束后用4飛倍柱床體積的平衡液淋洗親和柱。最佳的，步驟C中所述平衡液I為pH值7. 5±0. 5，濃度10 20mM的磷酸鹽緩沖液；平衡液II為含10 30mM咪唑、400 500mM NaCl, pH值7. 5±0. 5，10 20mM磷酸鹽緩沖液。所述第二步親和層析目的是將硫氧還蛋白與親和柱結合，而使目的蛋白即酶切后獲得的重組LD783蛋白穿透Ni2+Chelating Sepharose F. F.親和柱；較佳的，所述步驟D離子交換層析具體為用平衡液平衡填充有Q SepharoseF.F.或DEAE Sepharose F. F.的離子交換柱后，將上一步收集的流穿組分上柱，淋洗離子交換柱后，用洗脫液洗脫獲得目的蛋白。更佳的，步驟D中所述平衡液為pH值5. 0 8. 0，10^50mM的磷酸鹽緩沖液；洗脫液為含有100 400mM NaCl，pH值5. 0 8. 0，10^50mM的磷酸鹽緩沖液。流穿組分上柱的流速為10mL/min，上柱后用4飛倍柱床體積的平衡液淋洗離子交換柱。離子交換層析目的是進一步純化目的蛋白。最佳的，步驟D中所述平衡液為pH值7. 5±0. 2，10 20mM的磷酸鹽緩沖液；洗脫液為含有300 400mM NaCl，pH值7. 5 ±0. 2，10 20mM的磷酸鹽緩沖液。最佳的，所述離子交換柱的填料為Q Sepharose F. F.。對本發(fā)明構建獲得的重組質(zhì)粒，以17 terminator primer為引物,對該重組質(zhì)粒中的重組LD78P基因進行序列分析，測序結果如SEQ ID NO: 5所示，結果表明以此DNA序列推導的重組LD78P蛋白的氨基酸序列與文獻報道及實驗設計完全一致。本發(fā)明基因工程的方法制備的重組LD78P蛋白配合本發(fā)明的四步純化法，最終獲得的重組人LD78 P蛋白純度可達98%，純化后的重組蛋白產(chǎn)量可達35mg/L。本發(fā)明的有益效果為采用大腸桿菌作為宿主，表達Trx標簽融合的LD78P蛋白，經(jīng)腸激酶切除標簽以及一系列純化，最終得到HPLC純度高達98%的重組人LD78P蛋白，并且制備獲得的重組人LD78 3蛋白活性好，產(chǎn)量高。本發(fā)明技術方案簡單、安全，填補了LD78 0蛋白生產(chǎn)工藝的欠缺，利于重組人LD78P蛋白的工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。


圖I :pET_32a(+)載體物理圖譜圖2 :融合蛋白在工程菌E. coli內(nèi)表達的SDS-PAGE電泳分析(M :標準蛋白質(zhì)分子量；I :誘導前；2:誘導4小時)圖3 :30升發(fā)酵罐發(fā)酵融合蛋白在工程菌內(nèi)表達的SDS-PAGE電泳分析(M :標準蛋白質(zhì)分子量；1 :誘導前；2 :誘導4小時) 圖4 :融合蛋白Trx-LD78 ^經(jīng)腸激酶酶切后的SDS-PAGE電泳分析(M :標準蛋白質(zhì)分子量；1 :酶切如;2 :腸激酶酶切16小時后；3 :融合蛋白；4 Trx標簽蛋白；5 :重組LD78P蛋白)圖5 :純化后的重組LD78 P蛋白的SDS-PAGE電泳分析(M :標準蛋白質(zhì)分子量；I 純化后的重組LD78P蛋白)圖6 :純化后的重組LD78 P蛋白的HPLC的檢測結果圖譜注標準蛋白質(zhì)分子量大小(從上至下)99KDa，66KDa，45KDa，31KDa，20KDa，
14.4KDa
具體實施例方式本發(fā)明利用基因工程的方法，人工合成表達重組LD783蛋白的重組基因EK-LD78 ^，將該重組基因序列插入表達載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞，通過發(fā)酵，分離純化等步驟獲得重組LD78P蛋白。具體可在重組基因EK-LD78 ^序列兩端引入Kpn I酶和Hind III酶的限制性酶切位點，并通過酶切、連接的方法將重組基因EK-LD78P插入到pET32a(+)載體上Kpn I酶和Hind III酶的酶切位點之間，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，表達含有硫氧還蛋白、腸激酶識別位點和重組LD78P蛋白的融合蛋白。最后，通過四步純化法分離純化融合蛋白，獲得重組LD783蛋白。以下實施例將有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明的保護范圍。實施例I基因工程菌的制備I.重組基因EK-LD78P的人工合成重組基因EK-LD78 3全序列由上海生工生物工程公司合成，所述重組基因EK-LD78 ^的基因序列包括靠近5’端的腸激酶(EK)識別位點序列(SEQ ID N0:2)、靠近3’端的重組LD78P蛋白基因序列(SEQ ID NO: 3)以及重組基因EK-LD78 P序列兩端的Kpn I酶和Hind III酶的酶切位點序列。Kpn I和Hind III酶切位點用于重組質(zhì)粒的構建；人工合成的重組基因EK-LD78P序列如SEQ ID N0:4所示。2.重組質(zhì)粒的構建I)表達載體的構建將人工合成的重組基因EK-LD78P片段經(jīng)Kpn I/Hind III雙酶切后克隆于經(jīng)Kpn I/Hind III雙酶切的pET32a⑴載體中，進行連接反應，連接反應條件為T4 DNA連接酶(Promega公司)，2 16°C，I 30小時，構建得到重組質(zhì)粒pET32a(+)-LD78 3。2)表達載體的鑒定將上一步獲得的重組質(zhì)粒通過CaCl2法(分子克隆實驗指南，第二版，科學出版社)轉(zhuǎn)化DH5a菌，Amp抗性篩選陽性克隆，再經(jīng)Kpn I和Hind III雙酶切鑒定得到重組質(zhì)粒pET32a(+)-LD78 ^，結果表明已獲得正確插入重組LD78 ^基因融合表達載體。然后，以17 terminator primer為引物，以含有重組LD78 0蛋白基因序列的重組質(zhì)粒pET32a(+)-LD78P為模板，對該重組質(zhì)粒中的基因進行序列分析，結果表明以此DNA序列推導的人重組LD78 P蛋白(CCL3L1)的氨基酸序列與文獻報道及實驗設計完全一致，證明重組質(zhì)粒pET32a(+)-LD78 0構建成功；重組質(zhì)粒用17 terminator引物測序的序列結果見SEQ ID NO:5。3.基因工程菌的制備 I)構建基因工程菌將構建成功的重組質(zhì)粒pET32a(+)_LD78P以CaCl2法(分子克隆實驗指南，第二版，科學出版社)轉(zhuǎn)化受體菌BL21 (DE3)，篩選陽性克隆。選擇表達相對最高的一株作為融合蛋白表達的工程菌{pET32a (+) -LD78 ^ /BL21 (DE3)}。2)鑒定表達產(chǎn)物將經(jīng)篩選的重組工程菌pET32a(+)-LD78 ^ /BL21 (DE3)劃線在含100ul/ml氨芐青酶素的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)16小時。挑選生長良好的單菌落，接種于LB培養(yǎng)液(含Ampl00ug/ml)，37°C培養(yǎng)過夜。將過夜菌以I :50接種于20ml LB培養(yǎng)液中(含Amp IOOug/ml)，37°C振蕩培養(yǎng)。當OD6tltl達0. 6-0. 8時，加IPTG至終濃度0. 5mM，誘導4小時。菌液經(jīng)5000rpm, 5min離心，去培養(yǎng)基上清，沉淀菌體加入上樣緩沖液，10(TC水浴3min，離心后上SDS-PAGE電泳(積層膠5%，分離膠15% )，染色，脫色，掃描分析，電泳結果見圖2。由于Trx_LD78P融合基因長609bp，融合蛋白含203個氨基酸，理論分子量約為22. 1KD。SDS-PAGE結果表明在22KD和30KD之間有明顯表達條帶，與預期相符，融合蛋白占囷體總蛋白的25 左右。實施例2發(fā)酵表達融合蛋白種子活化將斜面保存的本發(fā)明制備的大腸桿菌工程菌pET32a (+) -LD78 ^ /BL21 (DE3)取一環(huán)菌種接入30ml LB培養(yǎng)液中(含100ug/ml氨芐青酶素)，37°C，200rpm搖瓶培養(yǎng)15小時。種子液制備取活化種子，按10%接種量接于2000ml M9+LB培養(yǎng)液中(含IOOug/ml氨芐青酶素)，37°C，250rpm搖瓶培養(yǎng)6小時。30升發(fā)酵罐發(fā)酵將種子液按6%接種量加入裝有M9+LB培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，370C，控制pH值在7. 0左右，由通氣及攪拌速度控制溶氧在30%以上。OD6tltl為20 30時，加入IPTG至終濃度為0. 5mM，誘導4. 0小時收菌。SDS-PAGE測蛋白表達量(積層膠3%，分離膠10%)，電泳結果見圖3，電泳結果顯示目的蛋白分子量約為22. 1KD，約占菌體總蛋白的20%左右。實施例3目的蛋白的純化I.菌體處理將發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體4 V，9000rpm離心25分鐘，棄上清液。用10倍菌體重量的磷酸鹽緩沖液(PH6. 0 9. 0)懸浮菌體，然后APV-1000勻漿機(Invensys公司)循環(huán)破菌3次。4°C，9000rpm離心30分鐘，取上清液，于4°C靜止3小時后，再4°C，9000rpm離心30
分鐘，取上清液。2.四步純化法分離純化本純化步驟所用設備為通用電氣公司(GE)AKTA Purifier 100或者AKTA Primer,所有填料均為該公司產(chǎn)品。方法一(I)Chelating Sepharose F. F.親和層析法先用含 30mM 咪唑、500mM NaCl,pH 值7. 5±0. 5, 20mM的磷酸鹽緩沖液平衡填充有Chelating Sepharose F. F.的親和柱；向菌體裂解處理后得到的上清液中加入I. OM咪唑、NaCI固體及磷酸鹽緩沖溶液，配置含有30mM咪唑、500mM NaCl，20mM磷酸鹽，pH值7. 5±0. 5的上樣溶液；上柱上樣溶液流速為10mL/min(柱床體積200mL)，用5倍柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用含250mM咪唑、500mMNaCl，pH值7. 5±0. 5，濃度為20mM的磷酸鹽緩沖液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。(2)酶解融合蛋白將第一步所收集活性蛋白峰流出液用考馬氏亮藍染色法(Bradford法)測定濃度后稀釋5倍，以腸激酶融合蛋白質(zhì)量比為I :1000，向融合蛋白中加入腸激酶進行酶解酶切溫度為16°C，酶切16小時獲得酶解液；并對酶切16小時獲得的酶解液進行SDS-PAGE，電泳結果見圖4。(3)Chelating Sepharose F. F.層析法將 Ni2+Chelating Sepharose F. F.柱用pH值7. 5±0. 5，濃度20mM的磷酸鹽緩沖液平衡，將上一步得到的酶解液上柱，流速為IOmL/min，用含30mM咪唑、500mM NaCl, pH值7. 5±0. 5,20mM的磷酸鹽平衡緩沖液清洗，收集流
穿組分。(4) Q Sepharose F. F離子交換法進一步純化目的蛋白，具體方法為用pH值
7.5±0. 2，濃度20mM磷酸鹽緩沖液平衡填充有Q Sepharose F. F的離子交換柱后，將上一步收集的流穿組分上柱，上柱的流速為lOmL/min (柱床體積200mL)，清洗后以含有300mMNaCl，pH值7. 5±0. 2，20mM磷酸鹽緩沖液洗脫，得到目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳和HPLC檢測重組LD78P蛋白純度達98%以上，SDS-PAGE結果見圖5，HPLC結果見圖6。方法二(I) Chelating Sepharose F. F.親和層析法先用含 70mM 咪唑、300mM NaCl, pH值6.0，50mM的磷酸鹽緩沖液平衡填充有Chelating Sepharose F. F.的親和柱；向菌體裂解處理后得到的上清液中加入I. OM咪唑、NaCI固體及磷酸鹽緩沖溶液，配置含有70mM咪唑、300mMNaCl，50mM磷酸鹽，pH值6. 0的上樣溶液；上柱上樣溶液流速為10mL/min (柱床體積200mL)，用5倍柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用含300mM咪唑、300mM NaCl, pH值6. 0，濃度為50mM的磷酸鹽緩沖液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。(2)酶解融合蛋白將第一步所收集活性蛋白峰流出液用考馬氏亮藍染色法(Bradford法)測定濃度后稀釋10倍，以腸激酶融合蛋白質(zhì)量比為I :2000，向融合蛋白中加入腸激酶進行酶解酶切溫度為12°C，酶切20小時獲得酶解液。(3)Chelating Sepharose F. F.層析法將 Ni2+Chelating Sepharose F. F.柱用pH值6. 0，濃度50mM的磷酸鹽緩沖液平衡，將上一步得到的酶解液上柱，流速為10mL/min，用含70mM咪唑、300mM NaCl, pH值6. 0，50mM的磷酸鹽平衡緩沖液清洗，收集流穿組分。(4)DEAE Sepharose F. F.離子交換法進一步純化目的蛋白，具體方法為用pH值、5. O，濃度50mM磷酸鹽緩沖液平衡填充有DEAE Sepharose F. F.的離子交換柱后，將上一步收集的流穿組分上柱，上柱的流速為lOmL/min (柱床體積200mL)，清洗后以含有IOOmMNaCl, pH值5.0，50mM磷酸鹽緩沖液洗脫，得到目的蛋白。經(jīng)檢測，純化前融合蛋白的表達量為300-400mg/L，純化后的重組蛋白產(chǎn)量可達35mg/L。方法三(I) Chelating Sepharose F. F.親和層析法先用含 IOmM 咪唑、700mM NaCl, pH值9. 0, IOmM的磷酸鹽緩沖液平衡填充有Chelating Sepharose F. F.的親和柱；向菌體裂解處理后得到的上清液中加入I. OM咪唑、NaCI固體及磷酸鹽緩沖溶液，配置含有IOmM咪唑、700mMNaCl，IOmM磷酸鹽，pH值9. O的上樣溶液；上柱上樣溶液流速為10mL/min (柱床體積200mL)，用5倍柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用含IOOmM咪唑、700mM NaCl, pH值9. O，濃度為IOmM的磷酸鹽緩沖液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。(2)酶解融合蛋白將第一步所收集活性蛋白峰流出液用考馬氏亮藍染色法(Bradford法)測定濃度后稀釋10倍，以腸激酶融合蛋白質(zhì)量比為I :500，向融合蛋白中 加入腸激酶進行酶解酶切溫度為40°C，酶切5小時獲得酶解液。(3)Chelating Sepharose F. F.層析法將 Ni2+Chelating Sepharose F. F.柱用pH值9. 0，濃度IOmM的磷酸鹽緩沖液平衡，將上一步得到的酶解液上柱，流速為10mL/min，用含IOmM咪唑、700mM NaCl, pH值9. 0，IOmM的磷酸鹽平衡緩沖液清洗，收集流穿組分。(4)Q Sepharose F. F離子交換法進一步純化目的蛋白，具體方法為用pH值8. 0,濃度IOmM磷酸鹽緩沖液平衡填充有Q Sepharose F. F的離子交換柱后，將上一步收集的流穿組分上柱，上柱的流速為lOmL/min (柱床體積200mL)，清洗后以含有400mMNaCl，pH值
8.0，IOmM磷酸鹽緩沖液洗脫，得到目的蛋白。方法四(I)Chelating Sepharose F. F.親和層析法先用含 30mM 咪唑、400mM NaCl,pH 值7. 5±0. 5, 20mM的磷酸鹽緩沖液平衡填充有Chelating Sepharose F. F.的親和柱；向菌體裂解處理后得到的上清液中加入I. OM咪唑、NaCI固體及磷酸鹽緩沖溶液，配置含有30mM咪唑、400mM NaCl，20mM磷酸鹽，pH值7. 5±0. 5的上樣溶液；上柱上樣溶液流速為10mL/min(柱床體積200mL)，用5倍柱床體積的平衡液清洗親和柱，再用含250mM咪唑、400mMNaCl，pH值7. 5±0. 5，濃度為20mM的磷酸鹽緩沖液洗脫目的蛋白，收集活性蛋白峰流出液。(2)酶解融合蛋白將第一步所收集活性蛋白峰流出液用考馬氏亮藍染色法(Bradford法)測定濃度后稀釋5倍，以腸激酶融合蛋白質(zhì)量比為I :500,向融合蛋白中加入腸激酶進行酶解酶切溫度為4°C，酶切20小時獲得酶解液。(3)Chelating Sepharose F. F.層析法將 Ni2+Chelating Sepharose F. F.柱用pH值7. 5±0. 5，濃度20mM的磷酸鹽緩沖液平衡，將上一步得到的酶解液上柱，流速為IOmL/min，用含30mM咪唑、400mM NaCl, pH值7. 5±0. 5,20mM的磷酸鹽平衡緩沖液清洗，收集流
穿組分。(4)DEAE Sepharose F. F.離子交換法進一步純化目的蛋白，具體方法為用pH值7. 5，濃度50mM磷酸鹽緩沖液平衡填充有DEAE Sepharose F. F.的離子交換柱后，將上一步收集的流穿組分上柱，上柱的流速為lOmL/min (柱床體積200mL)，清洗后以含有300mMNaCl，pH值7. 5，20mM磷酸鹽緩沖液洗脫，得到目的蛋白。
權利要求
1.一種重組LD78 0蛋白的制備工藝，具體步驟如下 1)人工合成表達重組LD78^蛋白的重組基因EK-LD78 ^，所述重組基因EK-LD78 ^的序列包括左右兩端的限制性酶切位點序列，以及兩端限制性酶切位點序列之間的、5’至3’方向依次排列的腸激酶識別位點序列和重組LD78P蛋白基因序列； 2)重組質(zhì)粒的構建將上一步的重組基因EK-LD78^插入載體，獲得含有重組LD78 ^蛋白基因序列的重組質(zhì)粒； 3)基因工程菌的制備將上一步獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主細胞制備基因工程菌； 4)外源基因的表達基因工程菌發(fā)酵表達含有重組LD78P蛋白的融合蛋白； 5)目的蛋白的純化裂解菌體，收集融合蛋白，通過融合蛋白的酶切、純化步驟獲得重組LD78P蛋白產(chǎn)品。
2.如權利要求I所述的制備工藝，其特征在于，所述重組LD78P蛋白基因序列如SEQIDNO: 3 所示。
3.如權利要求I所述的制備工藝，其特征在于，所述重組基因EK-LD78P序列左右兩端的限制性酶切位點分別為Kpn I酶和HindIII酶的限制性酶切位點。
4.如權利要求3所述的制備工藝，其特征在于，所述重組基因EK-LD78P序列5’至3’方向依次為Kpn I酶的限制性酶切位點序列、腸激酶識別位點序列、重組LD78P蛋白基因序列和Hind III酶的限制性酶切位點序列。
5.如權利要求4所述的制備工藝，其特征在于，所述重組基因EK-LD78P的序列如SEQIDNO: 4 所示。
6.如權利要求I所述的制備工藝，其特征在于，所述載體為含有T7強啟動子的原核表達 載體。
7.如權利要求I或6任一權利要求所述的制備工藝，其特征在于，所述載體為pET32a(+)。
8.如權利要求I所述的制備工藝，其特征在于，所述宿主細胞為大腸桿菌。
9.如權利要求I所述的制備工藝，其特征在于，所述融合蛋白的酶切、純化步驟采用四步純化法，該四步純化法依次為親和層析、酶解融合蛋白、親和層析和離子交換層析。
10.如權利要求9所述的制備工藝，其特征在于，所述四步純化法具體步驟為 A.第一步親和層析ChelatingSepharose F. F.層析柱初步分離融合蛋白； B.酶解融合蛋白用腸激酶酶切步驟A分離的融合蛋白，獲得酶解液； C.第二步親和層析第二次采用ChelatingSepharose F. F.層析柱,純化步驟B所得的酶解液，分離得到初步純化的重組LD78P蛋白； D.離子交換層析離子交換柱進一步純化步驟C獲得的重組LD783蛋白，得到進一步純化的重組LD78P蛋白產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及重組蛋白制備領域，具體公開了一種重組LD78β蛋白的制備工藝，利用基因工程的方法，人工合成表達重組LD78β蛋白的重組基因EK-LD78β，將該重組基因序列插入載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞，通過發(fā)酵，分離、酶切、純化等步驟獲得重組LD78β蛋白。本發(fā)明的制備方法操作安全、簡單、產(chǎn)品特異性高，有利于LD78β蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12N15/19GK102703460SQ20121016263
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權日2012年5月21日
發(fā)明者劉振青, 周靜, 張琳嵐, 樊敏娣, 王惠生, 肖齊世 申請人:上海普欣生物技術有限公司