專利名稱：肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的方法。特別地，本發(fā)明涉及一種使用選擇性的培養(yǎng)基培養(yǎng)肌腱細(xì)胞以生成充分純的肌腱細(xì)胞培養(yǎng)物的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞培養(yǎng)是具有許多應(yīng)用的技術(shù)，但是，有些細(xì)胞(例如肌腱細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞和心肌細(xì)胞)很難培養(yǎng)和/或培養(yǎng)很慢和/或在培養(yǎng)中易于表現(xiàn)出不穩(wěn)定的表
型和去分化。培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞尤其可以用于修復(fù)損傷的肌腱和韌帶。肌腱損傷的一個(gè)常見的例子是肩袖撕裂(tear in the rotator cuff tendon)。這通常由過頭的行動(dòng)引起的，并且表現(xiàn)出高的臨床發(fā)病率。旋轉(zhuǎn)帶肌腱(rotator cufftendon)完整性的喪失導(dǎo)致強(qiáng)度測量減弱，運(yùn)動(dòng)和功能范圍降低。盡管肩袖撕裂的外科修復(fù)實(shí)現(xiàn)了高水平的功能改善，并且患者的滿意度也很高，但是，有些肌腱修復(fù)，特別是大的肌腱或收縮肌腱撕裂，不能治愈或者在外科手術(shù)后再被撕裂。和初次治療相比，對旋轉(zhuǎn)帶修復(fù)失敗后的再修復(fù)外科手術(shù)的成功率極低。肌腱修復(fù)的基本原理是防止肌腱細(xì)胞的凋亡和在受損的肌腱內(nèi)再生正常的肌腱細(xì)胞，但是這需要發(fā)展體外培養(yǎng)的表型穩(wěn)定的肌腱細(xì)胞。但是肌腱或韌帶的再生需要大量的肌腱細(xì)胞。此外，該肌腱細(xì)胞的表型應(yīng)該與機(jī)體內(nèi)的肌腱細(xì)胞的表型盡可能接近。理想情況下，培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞與需要肌腱修復(fù)的受試者的肌腱細(xì)胞是自體同源的。目前，沒有適當(dāng)方法來培養(yǎng)一致性程度足夠用于修復(fù)肌腱或韌帶損傷的肌腱細(xì)胞。文獻(xiàn)中描述的許多方法包括在生長因子(例如類胰島素生長因子I或II，即IGF-I或IGF-II)的存在下，培養(yǎng)完整的肌腱或者極細(xì)碎的肌腱(例如，參見Dahlgren，等 2001，A JVR, 62(10) : 1557-1562 ;Kang 和 Kang, 1999，Yonsei Med. J. , 40(1) :26-29 ；Abrahamsson, 1996, J. Ortho. Res. , 15:256-262 ；Abrahamsson 和 Lohmander, 1996, J.Ortho. Res. , 14:370-376 ；Abrahamsson 等,1991, Ortho. Res. Soc. , 9:495-502 和 503-515 ；以及Anitua等，2005, J. Ortho. Res.，23:281-286)。雖然這些方法顯示出促進(jìn)了“類肌腱”或“衍生自肌腱”細(xì)胞的生長，但是已經(jīng)充分確定的是，肌腱不僅僅含有肌腱細(xì)胞。實(shí)際上，肌腱中的大多數(shù)細(xì)胞為與內(nèi)皮細(xì)胞在一起的成纖維細(xì)胞、滑膜細(xì)胞和一些軟骨細(xì)胞。因此，已知的用于培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的方法不能產(chǎn)生純的肌腱細(xì)胞培養(yǎng)物，而是產(chǎn)生含有纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和少量肌腱細(xì)胞的混合細(xì)胞群。眾所周知，肌腱細(xì)胞是生長很慢的細(xì)胞，這樣經(jīng)常使培養(yǎng)過程中存在的其它細(xì)胞過度生長。這就意味著現(xiàn)有技術(shù)中的培養(yǎng)衍生自肌腱細(xì)胞的方法一般不能產(chǎn)生足夠用于組織修復(fù)過程的肌腱細(xì)胞。因此，需要一種能培養(yǎng)足以用于組織修復(fù)過程的肌腱細(xì)胞的方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基，該肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基含有胰島素或其功能性衍生物。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約O. 00005%重量/體積至O. 1%重量/體積的胰島素或其功能性衍生物。在其它的實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約0.0001%重量/體積至0.001%重量/體積的胰島素或其功能性衍生物。在其它的實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約O. 0006%重量/體積的胰島素或其功能性衍生物。第一方面的培養(yǎng)基還可以含有糖皮質(zhì)激素，例如合成的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在一些實(shí)施方式中，該糖皮質(zhì)激素為倍他米松(betamethasone)。該培養(yǎng)基可以含有約O. 00001%重量/體積至O. 1%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約O. 0001%重量/體積至O. 001%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在其它的實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約O. 0002%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。本發(fā)明的第二方面提供了一種肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基，該肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基含有糖皮質(zhì)激 素或類糖皮質(zhì)激素分子。在一些實(shí)施方式中，該糖皮質(zhì)激素為合成的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在其它的實(shí)施方式中，該糖皮質(zhì)激素為倍他米松。該培養(yǎng)基可以含有約O. 00001%重量/體積至O. 1%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約0.0001%重量/體積至O. 001%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在其它的實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基含有約O. 0002%重量/體積的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基，該肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基主要由胰島素或其功能性衍生物組成。在其它的實(shí)施方式中，該肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基主要由胰島素和糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子組成。本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解的是，這些培養(yǎng)基的非必要成分包括血清、抗生素和本領(lǐng)域公知的任何其它常規(guī)培養(yǎng)補(bǔ)充物質(zhì)。因此，第一和第二方面的培養(yǎng)基還可以含有血清，例如胎牛血清(FBS)。該培養(yǎng)基可以含有約15%體積/體積的血清。第一和第二方面的培養(yǎng)基還可以含有抗生素。在一些實(shí)施方式中，該抗生素可以選自由氨芐青霉素、羧芐青霉素、青霉素、兩性霉素、制霉菌素、多粘菌素-B、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、鏈霉素、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯、里諾霉素(linomycin)、泰妙菌素(tiamutin)和氯霉素所組成的組中的一種或幾種。該培養(yǎng)基可以含有1%體積/體積的抗生素。第一和第二方面的培養(yǎng)基還可以含有L-脯氨酸。在一些實(shí)施方式中，第一和第二方面的培養(yǎng)基含有O. 0006%重量/體積的L-脯氨酸。本發(fā)明的第三個(gè)方面提供了一種培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的方法，該方法包括在本發(fā)明的第一和第二方面的培養(yǎng)基中培育肌腱細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施方式中，在10%的CO2下培養(yǎng)該肌腱細(xì)胞。在其它的實(shí)施方式中，該肌腱細(xì)胞在2維培養(yǎng)物中。在其它的實(shí)施方式中，通過胰蛋白酶和膠原酶從肌腱和/或韌帶組織中獲得肌腱細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的肌腱細(xì)胞培養(yǎng)方法產(chǎn)生充分純的肌腱細(xì)胞培養(yǎng)物(例如，所有存在的細(xì)胞中至少80%為肌腱細(xì)胞，優(yōu)選為至少90%，更優(yōu)選為至少95%)。本發(fā)明的第四個(gè)方面提供了由本發(fā)明的第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞在肌腱和/或韌帶疾病治療中的應(yīng)用。在一些實(shí)施方式中，該肌腱疾病為肌腱變性(tendinosis)。在其它的實(shí)施方式中，肌腱疾病為肌腱撕裂。本發(fā)明的第五個(gè)方面提供了由本發(fā)明的第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞在肌腱和/或韌帶再生中的應(yīng)用。本發(fā)明的第六個(gè)方面提供了由本發(fā)明的第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞在肌腱和/或韌帶重建中的應(yīng)用。本發(fā)明的第七個(gè)方面提供了治療肌腱和/或韌帶疾病的方法，該方法包括向動(dòng)物施用由本發(fā)明第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞的步驟。在一些實(shí)施方式中，該肌腱疾病為肌腱變性。在其它的實(shí)施方式中，該肌腱疾病為肌腱撕裂。本發(fā)明的第八個(gè)方面提供了再生肌腱和/或韌帶的方法，該方法包括向有需要的動(dòng)物施用由本發(fā)明第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞的步驟。 本發(fā)明的第九個(gè)方面提供了重建肌腱和/或韌帶的方法，該方法包括向有需要的動(dòng)物施用由本發(fā)明第三個(gè)方面的方法培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞的步驟。


圖I表示了逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增的結(jié)果，由于檢測到了膠原的I和III條帶，這表明肌腱細(xì)胞在體外保持它們的表型。條帶1、3和5為肌腱組織，而條帶2、4和6來自體外培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞。條帶I和2代表I型膠原的mRNA。
具體實(shí)施例方式在詳細(xì)描述優(yōu)選的實(shí)施方式之前，應(yīng)該理解的是，此處所用的術(shù)語僅僅是為了描述本發(fā)明的特殊的實(shí)施方式，而不是為了限定本發(fā)明的范圍。此處所引用的所有出版物、專利和專利申請，不管在上文還是在下文中，引入它們的全文作為參考。但是，引用此處所提及的出版物僅僅是為了描述和公開該出版物中報(bào)道的可能在本發(fā)明中使用的方案和試劑。此處不應(yīng)理解為承認(rèn)本發(fā)明沒有權(quán)利通過在先發(fā)明使這種公開內(nèi)容的日期提前。除非有另外的說明，本發(fā)明的實(shí)施將使用本技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)的組織離解、細(xì)胞生物學(xué)和細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有描述。例如，參見《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology))) (Mayer 和Walker 主編，Academic Press, London, 1987);《細(xì)胞的分子生物學(xué)(Molecular Biology ofthe Cell))) (Alberts 等，Garland Science, New York, 2000) ;Kruse 和 Patterson 主編的《組織培養(yǎng)(Tissue Culture))) (Academic Press, 1977)和《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(Culture OfAnimal Cells)》(R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc.，1987)。必須注意的是，此處和隨附的權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式“一個(gè)”和“該”包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確地表明相反。因而，例如提到的“一個(gè)細(xì)胞”包括多個(gè)細(xì)胞，“一個(gè)分子”指的是多個(gè)分子，等等。除非有相反的定義，此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語的意義與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所理解的通常意義相同。在下面的描述中，如果沒有說明，應(yīng)當(dāng)了解的是，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域公知的技術(shù)，并且可以采用任何這樣的技術(shù)。
盡管可以使用與此處描述的材料和方法相似或者等價(jià)的材料和方法實(shí)施或試驗(yàn)本發(fā)明，但是此處描述的是優(yōu)選的材料和方法。在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基。此處使用的術(shù)語“肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基”和“培養(yǎng)基”可交換使用，并且指的是用于有選擇地使肌腱細(xì)胞生長的營養(yǎng)液。本發(fā)明的培養(yǎng)基含有如上文和下文中所述的特定的成分，還含有其它非必要成分，這些主要取決于該肌腱細(xì)胞的動(dòng)物源或含有肌腱細(xì)胞的組織和使用的培養(yǎng)環(huán)境，例如，細(xì)胞密度和/或最終用途。該肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基通常含有有機(jī)和無機(jī)材料的混合物，并且典型地含有如下種類的一種或幾種成分中的至少一種I)能源，通常以碳水化合物的形式，例如葡萄糖；2)全部的必需氨基酸，通常，20種氨基酸加上半胱氨酸構(gòu)成基本的氨基酸組；3)維生素和/或其它以低濃度需要的有機(jī)化合物；
·
4)游離的脂肪酸；和5)痕量元素，其中，痕量元素定義為典型地以極低的濃度需要的無機(jī)化合物或天然存在的元素，一般以微摩爾級的量使用。該培養(yǎng)基可以選擇性地添加如下的任意種類中的一種或多種成分I)激素和其它生長因子，例如轉(zhuǎn)鐵蛋白和表皮生長因子；2)鹽和緩沖劑，例如鈣、鎂和磷酸鹽；3)核苷和堿基，例如腺苷和胸腺嘧啶核苷、次黃嘌呤；和
4 )蛋白質(zhì)和組織水解產(chǎn)物。該培養(yǎng)基典型地含有可商購得到的培養(yǎng)基，例如伊格基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Basal MediaEagle) (BME)、BGJb Medium、布瑞士特氏 BM0C-3 培養(yǎng)基(Brinster，s BM0C_3Medium)、CMRL培養(yǎng)基(CMRL Medium)、不依賴CO2的培養(yǎng)基、杜比科氏改進(jìn)的伊格培養(yǎng)基(Dulbecco’ sModified Eagle Medium) (D-MEM)、F-10營養(yǎng)素混合物、F-12營養(yǎng)素混合物、格拉斯哥最低極限培養(yǎng)基(Glasgow Minimum Essentia Medium)、改進(jìn)的Zn++選擇性MEM (里克特氏改進(jìn))(Improved MEM Zn++0ption (Richter’s Modification))、伊斯蘧伍氏改進(jìn)培養(yǎng)基(Iscove’s Modified Dulbecco's Medium)、萊波維特氏 L-15 培養(yǎng)基(Leibovitz，sL-15Medium)、麥蔻伊氏 5A 培養(yǎng)基(McCoy’s 5A Medium)(改進(jìn)的)、MCDB 131 培養(yǎng)基(MCDB131Medium)、培養(yǎng)基 NCTC-109 (Medium NCTC-109)、最低極限培養(yǎng)基(Minimum EssentialMedia) (MEM)、改進(jìn)的伊格培養(yǎng)基(Modified Eagle Medium) (MEM)、Opti-MEM I 還原的血清培養(yǎng)基(Opli-MEM I Reduced Serum Media)、RPMI 培養(yǎng)基 1640 (RPMIMedium
1640)、維伊冒斯氏MB 752/1培養(yǎng)基(Waymouth，s MB 752/lMedia)、威廉斯培養(yǎng)基E. (Williams Media E.)和培養(yǎng)基 199 (Medium 199)。本發(fā)明的肌腱細(xì)胞培養(yǎng)基含有胰島素或胰島素功能性衍生物。胰島素是一種激素，天然存在形式的胰島素由胰臟產(chǎn)生。但是，本發(fā)明使用的胰島素可以是合成的，例如，重組胰島素，或者是天然胰島素。胰島素的“功能性衍生物”是如Chan等,2000, ^Insulin-through theages:Phylogeny of a growth promoting and metabolic regulatory hormone，，(美國動(dòng)物學(xué)家；可以在 http://www.findarticles.eom/p/articles/mi qa3746/is 200004/ain8899929中得到)中所述的分子，該分子具有胰島素活性，即培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的能力；該分子包括胰島素的生物活性片段、胰島素的變體和胰島素的衍生物。在一些實(shí)施方式中，胰島素的“功能性衍生物”或胰島素的片段或胰島素的變體具有一個(gè)或幾個(gè)被20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的天然存在或合成的氨基酸同系物取代的氨基酸殘基。這樣的同系物的例子有4-羥基脯氨酸、5-羥基賴氨酸、3-甲基組氨酸、高絲氨酸、鳥氨酸、β-丙氨酸和4-氨基丁酸(butanoic acid)、β -丙氨酸、正亮氨酸、正纈氨酸、羧基脯氨酸、甲狀腺氨酸、Y-氨基丁酸、高絲氨酸、瓜氨酸等等。可以根據(jù)Sehon及其同事(Wie等，同上)的制備與聚乙二醇(PEG)分子共軛的胰島素的方法，用PEG制備胰島素的功能性衍生物。此外，可以在胰島素的化學(xué)合成過程中加入PEG。制備胰島素衍生物或其片段的其它方法包括還原/烷基化(Tarr，Methods of ProteinMicro-characterisation, J. E. Silver ed. , Humana Press, Clifton N. J. 155-194，1986)、酸化(Tarr,同上)、與適當(dāng)?shù)妮d體化學(xué)I禹合(Mishell和Shiigi, eds, Selected Methods in Cellular Immunology, W H Freeman, San Francisco, Calif. (1980),美國專利No. 4，939，239)、或適度的甲醒水處理(Marsh, 1971，Int. Arch, of Allergy and AppI.Tmmunol · , 41:199-215)。應(yīng)該注意的是，術(shù)語“功能性衍生物”不包括像類胰島素生長因子I或II這樣的分子。可以在向培養(yǎng)基中加入待培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞之前將胰島素或功能性衍生物加入到培養(yǎng)基中。可選擇地，可以在培養(yǎng)的整個(gè)過程中向培養(yǎng)基中加入胰島素或功能性衍生物，例如，在細(xì)胞飼養(yǎng)層存在下培養(yǎng)細(xì)胞，該細(xì)胞飼養(yǎng)層如由分泌胰島素或功能性衍生物的β細(xì)胞形成的層。此處所用的“片段”是保持胰島素的功能的胰島素蛋白的一部分，特別是能夠支持培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞的生長。胰島素的片段的長度可以為至少約10個(gè)氨基酸殘基，優(yōu)選約10-16個(gè)氨基酸殘基，更優(yōu)選約10-20個(gè)氨基酸殘基。胰島素的“變體”是具有一處或多處取代的胰島素分子，因此其二級構(gòu)象保持不變。這樣的保守性的取代包括與原有的氨基酸殘基具有基本上相同的疏水性、尺寸和電荷的氨基酸。這樣的取代為蛋白或肽化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的。例如，保守性的取代包括用脯氨酸代替甘氨酸或者相反；用丙氨酸或纈氨酸代替甘氨酸或者相反；用異亮氨酸代替亮氨酸或者相反；用組氨酸代替賴氨酸或者相反；用蘇氨酸代替半胱氨酸或者相反；用谷氨酰胺代替天冬酰胺或者相反；以及用精氨酸代替谷氨酸或者相反。胰島素的變體的另一個(gè)例子為其中的半胱氨酸殘基被取代以使由二硫鍵導(dǎo)致的二聚作用最小化。優(yōu)選地，半胱氨酸殘基被丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸或谷氨酸殘基取代。此外，胰島素或胰島素片段或胰島素衍生物的氨基酸側(cè)鏈可以被化學(xué)修飾。另一種改性方式是胰島素的環(huán)化。本發(fā)明的培養(yǎng)基中的胰島素或功能性衍生物的量一般為約0. 00005%重量/體積至0. 1%重量/體積。在一些實(shí)施方式中，胰島素或功能性衍生物的含量為約0. 0005%重量/體積至0. 01%重量/體積。在其它的實(shí)施方式中，胰島素或功能性衍生物的含量為約
0.0001%重量/體積至0. 001%重量/體積。在其它的實(shí)施方式中，胰島素或功能性衍生物的含量為約0. 0006%重量/體積。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基含有糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。糖皮質(zhì)激素是類固醇激素的一類，其特征在于能夠與皮質(zhì)醇受體結(jié)合并引發(fā)相似的作用，例如影響代謝或消炎或抑制免疫的作用。糖皮質(zhì)激素可以為天然存在的激素或合成的藥物。適用于本發(fā)明的合成的糖皮質(zhì)激素的例子包括氫化可的松、醋酸可的松(cortisone acetate)、強(qiáng)的松(predisone)、強(qiáng)的松龍、甲基強(qiáng)的松龍、地塞米松、倍他米松、氟輕脫氫皮留醇、氯地米松、醋酸氟氫可的松(fludrocortisone sacetate)、醋酸脫氧皮質(zhì)酮(DOCA)和醛基甾酮?！邦愄瞧べ|(zhì)激素”分子可以為具有糖皮質(zhì)激素活性(即具有培養(yǎng)肌腱細(xì)胞的能力)的任何分子。適用于本發(fā)明的類糖皮質(zhì)激素分子的例子包括抗肝癌物、魚藤酮(Youssef等,2003, J. Carcinogenesis 2:2)、利福平(Calleja 等，1998，Nat. Med.，4:92-96)、甘草阜苷(甘草的一種成分)(Kuroyanagi 和 Sato, 1966, Allergy, 15:67-75)、以及醉爺內(nèi)酯(來自草藥睡爺(herb withanthia somnifera)) (Grandhi 等，1994，J.EthnopharmacoI. , 44:131-135)。
在一些實(shí)施例中，該糖皮質(zhì)激素為倍他米松。倍他米松是一種合成的糖皮質(zhì)激素，其化學(xué)式為C22H29FO50本發(fā)明的培養(yǎng)基中的糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子的含量一般為約O. 00001%重量/體積至O. 1%重量/體積。在一些實(shí)施方式中，糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子的含量為約O. 0001%重量/體積至O. 001%重量/體積。在其它的實(shí)施方式中，糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子的含量為約O. 0002%重量/體積至O. 001%重量/體積。該培養(yǎng)基還可以含有血清。該血清可以來自任何動(dòng)物，但是一般為牛血清。在一些實(shí)施方式中，該血清為胎牛血清。該培養(yǎng)基中的血清的含量可以為約1%%體積/體積至30%體積。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基中的血清的含量為約5%體積/體積至20%體積/體積。在其它的實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基中的血清的含量為約10%體積/體積至15%體積/體積。該培養(yǎng)基還可以含有一種或多種抗生素。該抗生素為天然的或合成的物質(zhì)，能殺滅或抑制微生物的生長。適用于本發(fā)明的培養(yǎng)基的抗生素的例子包括氨芐青霉素、羧芐青霉素、青霉素、兩性霉素、制霉圃素、多粘圃素-B、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、鏈霉素、四環(huán)素、大環(huán)內(nèi)酯、里諾霉素(linomycin)、泰妙菌素(tiamutin)和氯霉素。該培養(yǎng)基可以含有約0. 001%體積/體積至5%體積/體積的抗生素。在一些實(shí)施方式中，抗生素的含量為約0. 01%體積/體積至0. 05%體積/體積。在其它的實(shí)施方式中，抗生素的含量為約1%體積/體積。L-脯氨酸為脯氨酸的L-型立體異構(gòu)體，是動(dòng)物蛋白中常見的20種氨基酸之一。只有L-型立體異構(gòu)體出現(xiàn)在哺乳動(dòng)物蛋白中。該培養(yǎng)基的pH值可以為待培養(yǎng)的細(xì)胞能夠生長的任何pH值。在一些實(shí)施方式中，該培養(yǎng)基的pH值為約9. O至約3. O。在其它的實(shí)施方式中，該pH值為約5. O至8. O。在其它的實(shí)施方式中，該P(yáng)H值為約7. O至7. 5。在其它的實(shí)施方式中，該pH值為約7. 2。本發(fā)明的培養(yǎng)基可以通過本領(lǐng)域公知的任何方法制備。例如，可以通過將干成分溶解在水中，并調(diào)節(jié)液體的pH值到適當(dāng)?shù)闹刀苽洹？梢杂帽姸喾椒ㄖ械囊环N進(jìn)行滅菌，例如過濾或輻射。然后可以向該培養(yǎng)基中加入任何無菌的流態(tài)成分。然后，可以將待培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞或含有肌腱細(xì)胞的組織加入到該培養(yǎng)基中。此處所用的術(shù)語“肌腱細(xì)胞”指的是在動(dòng)物的肌腱中可見的紡錘狀成纖維樣細(xì)胞。肌腱細(xì)胞一般具有伸長的細(xì)胞核和薄的細(xì)胞質(zhì)，常見于肌腱的膠原纖維上。通?？梢愿鶕?jù)產(chǎn)生I型膠原和表達(dá)標(biāo)記“軟骨發(fā)生早期特異性轉(zhuǎn)錄因子(scleraxis)”鑒定肌腱細(xì)胞?？梢杂酶鞣N方法從任何含肌腱細(xì)胞的組織中分離肌腱細(xì)胞，這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。在一些實(shí)施方式中，可以通過常規(guī)方法從活組織檢查材料中分離肌腱細(xì)胞。例如，可以從需要肌腱治療或再生的動(dòng)物的機(jī)體的任何肌腱中提取活體組織。這樣的肌腱包括但不限于，屈肌腕燒骨(flexor carpi radialis)肌腱和跟骨肌腱。在一些實(shí)施方式中，該肌腱細(xì)胞或含肌腱細(xì)胞組織為“自體同源的細(xì)胞或組織”，即來自于待接受治療的動(dòng)物機(jī)體的肌腱細(xì)胞或組織。此處所用的“動(dòng)物”指的是任何動(dòng)物，例如人類或?qū)θ祟愑薪?jīng)濟(jì)價(jià)值和/或社會價(jià)值的哺乳動(dòng)物，例如，除人類之外的食肉動(dòng)物(例如，貓和狗)、豬科動(dòng)物(豬、大食用豬和野豬)、反芻動(dòng)物(如畜牛、牛、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛(bison)和駱駝)、以及馬。因?yàn)轼B類對人類也具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，因此，本發(fā)明還提供了對鳥類的治療，包括治療瀕臨滅絕的、動(dòng)物園的和家養(yǎng)的鳥類，特別是馴養(yǎng)的禽類，例如，家禽，如火雞、小雞、鴨子、鵝、珍珠雞等。因此，本發(fā)明提供了對家畜的治療，包括但不限于，馴養(yǎng)的豬科動(dòng)物(豬和大食用豬)、反芻動(dòng) 物、馬、家禽等等。該術(shù)語不表示特殊的年齡。因此，包括成年的和初生的受試者。可以從任何含肌腱細(xì)胞的組織中(如，肌腱)獲得或分離肌腱細(xì)胞。肌腱是動(dòng)物體內(nèi)連接肌肉與骨胳的組織。該肌腱可以來自動(dòng)物的任何解剖部分，可以為旋轉(zhuǎn)帶肌腱、岡上肌腱、肩胛下肌腱、胸大肌肌腱、腓骨肌腱、跟肌腱(achille’ s tendon)、前脛肌肌腱(tibialis anterior)、膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶、膝關(guān)節(jié)后交叉韌帶、后腿肌腱、外側(cè)韌帶(lateral ligament)、內(nèi)側(cè)韌帶(medial ligament)、館骨肌腱(patella tendon)、二頭肌腱和三頭肌腱。在一些實(shí)施方式中，將由活組織檢查分離出來的肌腱組織清洗并切碎成外植塊，該外植塊能夠在細(xì)胞培養(yǎng)中生長產(chǎn)生自由肌腱細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，將切碎的組織進(jìn)行酶消化和/或與能和Ca2+連接或螯合的試劑(例如乙二胺四乙酸(EDTA))作用，細(xì)胞和細(xì)胞之間的粘接依賴于Ca2+。適用的酶的例子包括膠原酶、胰蛋白酶和蛋白酶中的一種或幾種。在一種優(yōu)選的方法中，在含有2. 5%重量/體積的胰蛋白酶和5. 5%重量/體積的膠原酶的不含苯酚紅的標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)不大于Imm的切碎的肌腱組織，在5%的CO2中37°C下培養(yǎng)至少3小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，在酶消化后，活組織檢查材料中的細(xì)胞通過將活體組織溶液離心并用細(xì)胞生長培養(yǎng)基將得到的沉淀清洗分離。可選擇地，然后可以通過過濾將肌腱細(xì)胞從該肌腱的其它成分中分離出來，例如使用篩網(wǎng)，如150微米的無菌尼龍篩網(wǎng)。另一種途徑是基于一些細(xì)胞類型易于強(qiáng)烈地吸附在塑料或玻璃上，從而將它們與吸附不強(qiáng)烈的肌腱的成分分離開?？蛇x擇地，可以使用與細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體將細(xì)胞從肌腱的其它成分中分離出來，例如，使用與基體結(jié)合的或與熒光染料耦合的抗體，然后可以通過具有熒光活性的細(xì)胞分選(FACS)技術(shù)分離該抗體。然后可以將細(xì)胞加入到本發(fā)明的培養(yǎng)基中，在適當(dāng)?shù)臈l件下孵育。在一些實(shí)施方式中，分離后，在5%的CO2氣氛中于37°C下將細(xì)胞培養(yǎng)約3天至5周。當(dāng)然，培養(yǎng)細(xì)胞的時(shí)間周期可以改變。如上所述，本發(fā)明的培養(yǎng)基含有胰島素或功能性衍生物和/或糖皮質(zhì)激素或類糖皮質(zhì)激素分子。肌腱細(xì)胞一般很難在細(xì)胞培養(yǎng)中生長，并且易于變得不穩(wěn)定和去分化。但是，本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)胰島素尤其能夠使肌腱細(xì)胞更穩(wěn)定地生長，甚至在包括軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等其它細(xì)胞的存在下的培養(yǎng)中也能夠生長。因此，只要本發(fā)明的培養(yǎng)基中存在胰島素，那么肌腱細(xì)胞就可以選擇性地生長。如在其它地方所描述的，可以將胰島素由外界加入到該培養(yǎng)基中。可選擇地，可以通過將肌腱細(xì)胞和能夠向培養(yǎng)基中分泌胰島素的飼養(yǎng)細(xì)胞共同培養(yǎng)來天然地產(chǎn)生胰島素。因此，在本發(fā)明的上下文中，“飼養(yǎng)細(xì)胞”或“供食者(feeders)”是能夠分泌胰島素的細(xì)胞，這樣，共培養(yǎng)的肌腱細(xì)胞就能夠像本發(fā)明要求的那樣生長。不管肌腱細(xì)胞實(shí)際上是在無飼養(yǎng)細(xì)胞存在下生長還是在飼養(yǎng)細(xì)胞的存在下生長，在一些實(shí)施方式中，肌腱細(xì)胞達(dá)到了需要分離成一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞密度。每一輪的傳代培養(yǎng)稱作傳代。當(dāng)將肌腱細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)時(shí)，稱為將肌腱細(xì)胞傳代。肌腱細(xì)胞的特異性種群有時(shí)稱作，或者特征在于，其傳代的次數(shù)。例如，傳代了十次的培養(yǎng)的細(xì)胞種群被稱作PlO培養(yǎng)。初級培養(yǎng)，即 細(xì)胞從組織中分離后的首次培養(yǎng)，記作PO。首次傳代培養(yǎng)之后，該細(xì)胞被稱為二級培養(yǎng)(Pl或傳代I)。第二次傳代培養(yǎng)之后，該細(xì)胞成為三級培養(yǎng)(P2或傳代2)，依此類推。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，在傳代過程中可能有許多種群翻倍；因此培養(yǎng)的種群翻倍數(shù)大于傳代數(shù)。傳代期間的細(xì)胞的增殖(即種群翻倍數(shù))取決于許多因素，包括但不限于，接種密度、基質(zhì)、培養(yǎng)基、生長條件和傳代間隔。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法制備了培養(yǎng)或傳代培養(yǎng)的充分純的肌腱細(xì)胞。此處所用的術(shù)語“充分純的”指的是在培養(yǎng)物中，肌腱細(xì)胞是主要的細(xì)胞，其它污染性細(xì)胞(例如成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等等)的數(shù)目很少。優(yōu)選地，培養(yǎng)物中存在的細(xì)胞的至少80%為肌腱細(xì)胞，更優(yōu)選為至少90%，最優(yōu)選為所有細(xì)胞中的至少95%為肌腱細(xì)胞。當(dāng)?shù)玫匠渥銛?shù)量或體積的肌腱細(xì)胞后，可以用標(biāo)準(zhǔn)方法將其存庫或儲存。例如，可以通過在_180°C下深低溫保藏將肌腱細(xì)胞常規(guī)地儲存。本發(fā)明的肌腱細(xì)胞可以在各種條件下深低溫保藏,例如本領(lǐng)域公知的條件。重要地，優(yōu)選情況下，在培養(yǎng)階段或者傳代后或者深低溫保藏后對肌腱細(xì)胞的表型進(jìn)行評定。有許多種方法評定進(jìn)行了細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞的表型。一種方法是評定培養(yǎng)的細(xì)胞的形態(tài)。例如，肌腱細(xì)胞是具有伸長的細(xì)胞核和薄的細(xì)胞質(zhì)的紡錘狀細(xì)胞。對肌腱細(xì)胞的表型進(jìn)行評定的另一種方法是確定該細(xì)胞的表達(dá)標(biāo)記是否對該細(xì)胞類型具有特異性。例如，肌腱細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，軟骨發(fā)生早期特異性轉(zhuǎn)錄因子，軟骨發(fā)生早期特異性轉(zhuǎn)錄因子是所有介導(dǎo)肌肉與骨骼連接的連接組織的高度特異性標(biāo)記。肌腱細(xì)胞還表達(dá)分化標(biāo)記,如I型膠原、III型膠原和飾膠蛋白聚糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，可以根據(jù)肌腱細(xì)胞最終用途對本發(fā)明的肌腱細(xì)胞進(jìn)行單層或3-維培養(yǎng)?！皢螌印笔侵挥幸粚蛹?xì)胞(2-維)。3-維培養(yǎng)指的是具有深度、寬度和高度的培養(yǎng)，例如在基質(zhì)或支架上培養(yǎng)生長。因此，本發(fā)明還關(guān)注包括接種到基質(zhì)或支架上的用于組織修復(fù)和/或再生的肌腱細(xì)胞的組合物，該肌腱細(xì)胞優(yōu)選為自體同源的肌腱細(xì)胞。“接種”指的是使肌腱細(xì)胞與支持基質(zhì)或支架接觸，在移植前粘附(用粘合劑或不用粘合劑)在支持基質(zhì)上一段時(shí)間。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，細(xì)胞只保持在支持基質(zhì)的一個(gè)表面或邊緣，或到特定的深度(如此處所述的)，即，細(xì)胞附著在支持基質(zhì)的一個(gè)表面或與支持基質(zhì)相鄰，如美國
發(fā)明者鄭銘豪 申請人:西澳大利亞大學(xué)