專利名稱：焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)egfr基因多態(tài)性的試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因多態(tài)性的試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
吉非替尼(Gefitinib)(商品名Iressa易瑞沙)是2003年美國(guó)FDA批準(zhǔn)的第二個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑，主要用于治療既往接受過(guò)化學(xué)治療或不適 于化療的局部晩期或轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) ο厄洛替尼(Erlotinib)(商品名Tareeva特羅凱)于2004年通過(guò)美國(guó)FDA審批在美國(guó)上市，作為ニ線或三線藥物用于治療晩期或其他方案無(wú)效的非小細(xì)胞肺癌患者。?？颂婺?Icotinib)(商品名Conmana,凱美鈉)是我國(guó)食品藥品監(jiān)瞀管理局(SFDA)于2011年6月8日批準(zhǔn)上市的小分子腫瘤靶向治療藥物，主要用于非小細(xì)胞肺癌的治療。三者為同類藥物，其作用祀點(diǎn)均為人類表皮生長(zhǎng)因子受體(印idermal growthfactor receptor family, EGFR)。在體內(nèi)主要是同三磷酸腺苷競(jìng)爭(zhēng)性地與EGFR細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)合域結(jié)合，選擇性抑制EGFR相關(guān)的活性及細(xì)胞內(nèi)磷酸化過(guò)程來(lái)發(fā)揮其抗腫瘤作用，通過(guò)對(duì)EGFR酪氨酸激酶活性的抑制，阻滯下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，拮抗血管生成、細(xì)胞遷移擴(kuò)散及増殖作用，阻斷腫瘤組織的生長(zhǎng)。上述三種EGFR酪氨酸激酶抑制藥，是目前NSCLC患者最有效的靶向藥物。但EGFR-TKI并非對(duì)所有患者都有效。EGFR外顯子18、19或21發(fā)生突變的患者，吉非替尼有效率可高達(dá)80%，而野生型患者基本無(wú)效。EGFR敏感突變是藥物有效的前提。但部分EGFR-TKI初始治療有效的患者后期會(huì)發(fā)生耐藥，與EGFR20號(hào)外顯子突變密切相關(guān)。以NSCLC為例，EGFR20號(hào)外顯子突變發(fā)生率為I. 6%,約占EGFR突變9%，50%的EGFR-TKI耐藥由EGFR20號(hào)外顯子的T790M點(diǎn)突變所致。由此可見，對(duì)EGFR基因18、19、20和21外顯子進(jìn)行分型檢測(cè)可預(yù)測(cè)患者對(duì)吉非替尼和埃羅替尼的反應(yīng)性，為臨床醫(yī)生給非小細(xì)胞肺癌初次治療制定藥物治療方案提供依據(jù)，也可以根據(jù)20號(hào)基因型判斷患者是否會(huì)產(chǎn)生繼發(fā)耐藥。綜上所述，對(duì)EGFR基因18、19、20和21外顯子進(jìn)行分型檢測(cè)可預(yù)測(cè)患者對(duì)吉非替尼和埃羅替尼的反應(yīng)性，為臨床醫(yī)生給非小細(xì)胞肺癌初次治療制定藥物治療方案提供依據(jù)，也可以根據(jù)20號(hào)基因型判斷患者是否會(huì)產(chǎn)生繼發(fā)耐藥。開發(fā)快速、高效、準(zhǔn)確、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)EGFR基因多態(tài)性的試劑盒將為酪氨酸激酶抑制藥的臨床個(gè)體化治療起到積極的推動(dòng)作用。焦磷酸測(cè)序(Pyro sequencing)技術(shù)是新一代DNA序列分析技術(shù),該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，DNA片段也無(wú)須熒光標(biāo)記，是ー種通用型技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低、所需樣品量小、快捷、準(zhǔn)確、高通量等特點(diǎn)，符合臨床大樣本檢測(cè)要求。

發(fā)明內(nèi)容
EGFR基因多態(tài)性是影響酪氨酸激酶抑制劑能否使用的最主要因素。本發(fā)明提供一種臨床檢測(cè)使用酪氨酸激酶抑制劑生物標(biāo)志物的用藥基因EGFR多態(tài)性的試劑盒及方法，以實(shí)現(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)酪氨酸激酶抑制劑個(gè)體化用藥相關(guān)基因SNP。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為
一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因多態(tài)性的試劑盒，包括如下引物 (1)擴(kuò)增引物
EGFR exonl8 (SEQ ID NO. I)上游引物5、GTG ACC CTT GTC TCT GTG TTC TTG_3,(SEQ ID NO. 5)；
EGFR exonl9 (SEQ ID NO. 2)上游引物5、AGA TCA CTG GGC AGC ATG -3, (SEQ IDNO. 6)；
EGFR exon20 (SEQ ID NO. 3)上游引物5、TCT GCC TCA CCT CCA CCG T -3^ (SEQID NO. 7)；
EGFR exon21 (SEQ ID NO. 4)上游引物5,- CCA GGA ACG TAC TGG TGA AA -3, (SEQID NO. 8)；
EGFR exonl8 下游引物5、TTA TAC ACC GTG CCG AAC GC~3r (SEQ ID NO. 9)；
EGFR exonl9 下游引物5,- CCA CAC AGC AAA GCA GAA AC -3, (SEQ ID NO. 10)；EGFR exon20下游引物5、CTC CTT ATC TCC CCT CCC CGT ATC -3乂SEQ ID NO. 11)；EGFR exon21 下游引物5、TGA CCT AAA GCC ACC TCC TT -3^ (SEQ ID NO. 12)；
其中，下游引物的5,進(jìn)行生物素標(biāo)記；
(2)測(cè)序引物
EGFR exonl8 測(cè)序引物5Λ- AAA AAG ATC AAA GTG CTG -3^ (SEQ ID NO. 13)；
EGFR exonl9 測(cè)序引物5、TCC CGT CGC TAT CAA -3, (SEQ ID NO. 14)；
EGFR exon20 測(cè)序引物5、CCG TGC AGC TCA TCA -3^ (SEQ ID NO. 15)；
EGFR exon21 測(cè)序引物5、TTC TCT TCC GCA CCC -3^ (SEQ ID NO. 16)；
試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測(cè)序的常規(guī)試劑。一種應(yīng)用上述試劑盒檢測(cè)EGFR基因多態(tài)性的方法，包括如下步驟
(O DNA提取；
(2)聚合酶鏈反應(yīng)
配制 50 μ I PCR 擴(kuò)增體系，包含10XPCR buffer O. 5μ I, dNTP 3·0μ1，上游引物
O.5 μ 1，下游引物O. 5 μ 1，rTaqO. 5μ 1，水38. 5μ 1，模板2. Ομ I ;按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置擴(kuò)增儀95 0C 5min預(yù)變性；然后依次在95°C 30S, 52°C 30S, 60°C 30S,進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；再在72°C保持7min，最終保持在4 °C，得擴(kuò)增產(chǎn)物；
(3)焦磷酸測(cè)序單鏈樣本純化；
(4)焦磷酸測(cè)序及結(jié)果分析。由于設(shè)計(jì)了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發(fā)明的試劑盒適用于對(duì)酪氨酸抑制劑個(gè)體化用藥基因進(jìn)行快速檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于臨床上酪氨酸激酶抑制劑個(gè)體化用藥方案制定的基因檢測(cè)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，其應(yīng)用焦磷酸測(cè)序技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行短DNA序列分析，便于構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化操作流程；具有高通量、低成本等特點(diǎn)；PCR產(chǎn)物即可直接用于測(cè)序，不需進(jìn)行產(chǎn)物純化等二次處理，操作極為簡(jiǎn)便，所需樣品量小。


圖I為本發(fā)明EGFR exonl8野生型焦磷酸測(cè)序結(jié)果；
圖2為本發(fā)明EGFR exonl8突變型焦磷酸測(cè)序結(jié)果；
圖3為本發(fā)明EGFR exonl9野生型焦磷酸測(cè)序結(jié)果；
圖4為本發(fā)明EGFR exonl9突變型焦磷酸測(cè)序結(jié)果；
圖5為本發(fā)明EGFR exon20野生型焦磷酸測(cè)序結(jié)果；
圖6為本發(fā)明EGFR exon21野生型型焦磷酸測(cè)序結(jié)果； 圖7為本發(fā)明EGFR exon21突變型焦磷酸測(cè)序結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)上述試劑盒及檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)描述。實(shí)施例I :
EGFR exonl8 上游引物5、GTG ACC CTT GTC TCT GTG TTC TTG_3, (SEQ ID NO. 5)； EGFR exonl9 上游引物5,- AGA TCA CTG GGC AGC ATG -3, (SEQ ID NO. 6)；
EGFR exon20 上游引物5、TCT GCC TCA CCT CCA CCG T -3, (SEQ ID NO. 7)；
EGFR exon21 上游引物5、CCA GGA ACG TAC TGG TGA AA -3^ (SEQ ID NO. 8)； EGFR exonl8 下游引物5、TTA TAC ACC GTG CCG AAC GC~3r (SEQ ID NO. 9)；
EGFR exonl9 下游引物5,- CCA CAC AGC AAA GCA GAA AC -3, (SEQ ID NO. 10)；EGFR exon20下游引物5、CTC CTT ATC TCC CCT CCC CGT ATC -3乂SEQ ID NO. 11)；EGFR exon21 下游引物5、TGA CCT AAA GCC ACC TCC TT -3^ (SEQ ID NO. 12)；
其中，下游引物的5,進(jìn)行生物素標(biāo)記；
EGFR exonl8 測(cè)序引物5Λ- AAA AAG ATC AAA GTG CTG -3^ (SEQ ID NO. 13)；
EGFR exonl9 測(cè)序引物5、TCC CGT CGC TAT CAA -3, (SEQ ID NO. 14)；
EGFR exon20 測(cè)序引物5、CCG TGC AGC TCA TCA -3^ (SEQ ID NO. 15)；
EGFR exon21 測(cè)序引物5、TTC TCT TCC GCA CCC -3^ (SEQ ID NO. 16)；
I. DNA提取
I. I實(shí)驗(yàn)前試劑材料準(zhǔn)備與檢查工作如下
(I)檢查試劑盒保質(zhì)期以及確保Wash Buffer I和2中已添加こ醇，并在瓶上相應(yīng)標(biāo)識(shí)處打勾V; (2)異丙醇(如無(wú)，可用無(wú)水こ醇替代)和75%こ醇；(3)高壓滅菌有效期內(nèi)的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管對(duì)應(yīng)標(biāo)本卩隹一性標(biāo)識(shí)做好標(biāo)記；
I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血轉(zhuǎn)移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I.6蓋上Eppendorf管蓋，室溫孵育IOmin ；
I.713, OOOrpm室溫離心20秒；
I.8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；
I.9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管ロ?xiàng)壢ゲ糠旨t色上清，盡量將紅色上清吸盡；
I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；
1.11移取30011しNuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛倒數(shù)次混勻；
I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；
I. 13移取上清轉(zhuǎn)移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數(shù)次混勻，可見白色絮狀gDNA析
出； I. 15 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I. 16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管ロ?xiàng)壢ド锨澹?br> I. 17移取300uL 75%こ醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；
I. 18 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I.19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管ロ?xiàng)壢ド锨澹?br> I.20在實(shí)驗(yàn)臺(tái)上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側(cè)放風(fēng)干；
I.21目測(cè)沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22過(guò)夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計(jì)進(jìn)行核酸濃度測(cè)定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入こ醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標(biāo)清樣本唯一性編號(hào)，并用透明膠帶纏繞保護(hù)；
1.24保存核酸標(biāo)本至4°C冰箱；
2.聚合酶鏈反應(yīng)
2.I在試劑準(zhǔn)備區(qū)配制50 μ I PCR擴(kuò)增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
權(quán)利要求
1.一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)EGFR基因多態(tài)性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物 (1)擴(kuò)增引物 上游引物GTG ACC CTT GTC TCT GTG TTC TTG -3^ ； 5r~ AGA TCA CTG GGC AGC ATG -3^ ； 5,- TCT GCC TCA CCT CCA CCG T -3,; 5r~ CCA GGA ACG TAC TGG TGA AA -3^ ； 下游引物5TTA TAC ACC GTG CCG AAC GC-3,； 5、CCA CAC AGC AAA GCA GAA AC -3,; 5r~ CTC CTT ATC TCC CCT CCC CGT ATC -3^ ； 5,- TGA CCT AAA GCC ACC TCC TT -3,;其中，下游引物的5,進(jìn)行生物素標(biāo)記； (2)測(cè)序引物5、AAAAAG ATC AAA GTG CTG -3^ ； 5,- TCC CGT CGC TAT CAA -3,； 5,- CCG TGC AGC TCA TCA -3,； 5,- TTC TCT TCC GCA CCC -3,。
2.ー種應(yīng)用權(quán)利要求I所述的試劑盒檢測(cè)EGFR基因多態(tài)性多態(tài)性的方法，包括如下步驟 (O DNA提取； (2)聚合酶鏈反應(yīng) 配制 50 μ I PCR 擴(kuò)增體系，包含10XPCR buffer O. 5μ I, dNTP 3·0μ1，上游引物O.5 μ I，下游引物O. 5 μ I，rTaqO. 5 μ I，水38. 5 μ I，模板2. O μ I ;按照下面的循環(huán)參數(shù)設(shè)置擴(kuò)增儀95 0C 5min預(yù)變性；然后依次在95°C 30S, 52°C 30S, 60°C 30S,進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；再在72°C保持7min，最終保持在4 °C，得擴(kuò)增產(chǎn)物； (3)焦磷酸測(cè)序單鏈樣本純化； (4)焦磷酸測(cè)序及結(jié)果分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)酪氨酸激酶抑制劑個(gè)體化用藥基因多態(tài)性試劑盒及方法。具體是指EGFR外顯子18、19、20、21多態(tài)性。試劑盒包含如SEQIDNO.3—16所示的引物。本發(fā)明的試劑盒，可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快捷、高通量對(duì)EGFR突變進(jìn)行檢測(cè)，從而達(dá)到對(duì)酪氨酸激酶抑制劑用藥實(shí)現(xiàn)安全合理有效的個(gè)體化給藥。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102676668SQ20121013536
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者周宏灝 申請(qǐng)人:周宏灝