專利名稱：一種解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的方法。背景技干酪又稱奶酪，富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，又容易消化吸收，且不易致肥，被營(yíng)養(yǎng)學(xué)家譽(yù)為“乳業(yè)皇冠上的珍珠”，它是一種在牛奶或羊奶中加入適量乳酸菌發(fā)酵劑和凝乳酶制劑，使奶中的蛋白質(zhì)凝固，排除乳清，并經(jīng)一定時(shí)間的成熟而制成的食品，凝乳酶則是奶酪生產(chǎn)過程中使牛奶凝固的關(guān)鍵性酶。其傳統(tǒng)來源是從未斷奶的小牛皺胃中提取，是一種酸性蛋白酶，其主要的生物學(xué)功能是有限剪切Phel05-Metl06連接的k -酪蛋白，導(dǎo)致牛乳凝結(jié)，被廣泛用于乳酪業(yè)。隨著奶酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，動(dòng)物凝乳酶已經(jīng)無法滿足現(xiàn)代工業(yè)對(duì)凝乳酶的需求，而植物凝乳酶雖然來源廣泛，但是其蛋白水解力強(qiáng)，并且受時(shí)間地點(diǎn)等的限制難以發(fā)展，因此利用微生物凝乳酶是目前最有前途的發(fā)展方向。目前工業(yè)上微生物凝乳酶主要采用米黑毛霉、微小毛霉和粟疫霉等真菌發(fā)酵生產(chǎn)。細(xì)菌較絲狀真菌具有體積小、生長(zhǎng)周期短、成本低、發(fā)酵產(chǎn)物易于提取分離等特點(diǎn)，能在人工控制的條件下進(jìn)行生產(chǎn)，而高蛋白水解能力是細(xì)菌來源的凝乳酶成為商品凝乳酶的主要障礙，因此凝乳酶活力高，蛋白水解活力低的細(xì)菌凝乳酶作為小牛凝乳酶的代用品在工業(yè)化生產(chǎn)中具有廣闊的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的方法，本專利為了進(jìn)一步提高解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的活力,對(duì)影響解淀粉芽孢桿菌凝乳酶活力的培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始PH及發(fā)酵時(shí)間等主要因素進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件，在IOOmL三角瓶中裝25 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量3. 5%，培養(yǎng)溫度36°C，培養(yǎng)基最初pH為6.0，發(fā)酵時(shí)間為20 h，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min，凝乳酶活力可達(dá)最聞值。I. 一種解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的方法，其特征在于，在100 mL搖瓶中配制一定體積的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入一定量的解淀粉芽孢桿菌種子液，在恒溫振蕩器中培養(yǎng)溫度24 38°C，搖瓶轉(zhuǎn)速60-260 r/min，然后進(jìn)行凝乳活力和蛋白水解活力的測(cè)定。2.步驟I里的種子培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基馬鈴薯浸粉0. 5%，葡萄糖2%，蛋白胨 1%, NaCl 0. 5%, 121°C滅菌 20min。3.步驟I里的發(fā)酵培養(yǎng)基鈴薯浸粉0. 5%，葡萄糖I. 13%，酵母浸粉I. 76%，CaCO30. 32%，121°C 滅菌 20 min。4.步驟I所述的解淀粉芽孢桿菌接種量最佳為3. 5%。5.步驟I所述的培養(yǎng)溫度最佳為36°C。6.步驟I所述的搖床轉(zhuǎn)速最佳為120 r/min。7.步驟I所述的最佳裝液量為25 mL8.步驟I所述的培養(yǎng)基初始pH最佳為6. O9.步驟I所述的凝乳活性的測(cè)定方法為，取5mL IOOg /L的脫脂乳，40°C保溫5min后加入0. 5 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液混合，振蕩使它們混合均勻。準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳凝固的時(shí)間(s)。凝乳酶活力(milk — clotting activity, MCA )定義為40min凝固ImL 10%脫脂乳的酶量為I個(gè)酶活力單位(Soxhelt Unit, Su)。MCA =(2400 X 5 X D) / ( T X 0. 5)式中MCA為凝乳酶活力/ ( Su /mL) ；T為凝乳時(shí)間/s ；D為稀釋倍數(shù)。10.步驟I所述的蛋白水解活力的測(cè)定方法為底物是牛乳全酪蛋白，用pH 6. 5
0.IM磷酸鹽緩沖液配制2%酪蛋白溶液，ImL底物溶液加入0.1 mL酶液，在40°C孵育I h，立即加入I. ImL 0. 4 M TCA溶液終止反應(yīng)，渦旋混勻后在室溫下放置20 min，然后12000 r/min離心10 min,上清液中多肽含量用Lowry法測(cè)定。一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘生成100 u g多肽所需的酶的量。


圖I接種量對(duì)凝乳酶活力的影響。圖2不同培養(yǎng)溫度對(duì)凝乳酶活力的影響。圖3搖床轉(zhuǎn)速對(duì)凝乳酶活力的影響。圖4裝液量對(duì)凝乳酶活力的影響。圖5培養(yǎng)基初始pH對(duì)凝乳酶活力的影響。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說明，但對(duì)本發(fā)明沒有限制。本專利所用的菌株為解淀粉芽孢桿菌，購買于ATCC，編號(hào)為01855。實(shí)施例I
本實(shí)施例說明接種量對(duì)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基其他條件相同的情況下，將解淀粉芽孢桿菌分別按分別以1%、1. 5%、3. 5%、5. 5%、7. 5%、9. 5%、11. 5%的
接種量接種入發(fā)酵培養(yǎng)基中。由圖I可以看出，接種量對(duì)解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)酶影響不大，但接種量小于1%時(shí)明顯抑制菌株產(chǎn)酶，當(dāng)接種量為3. 5%時(shí)凝乳酶活力最大，隨著接種量的增加，凝乳酶活力緩慢降低，但變化不大，因此，接種量為3. 5%時(shí)較適宜。實(shí)施例2
本實(shí)施例說明不同培養(yǎng)溫度對(duì)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基其他條件相同的情況下，培養(yǎng)溫度分布控制在24-38 °C。由圖2可以看出，在28_36°C的范圍內(nèi)培養(yǎng)，該菌株都能進(jìn)行良好的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，且在36°C時(shí)凝乳酶活力、蛋白水解活力及二者比值均達(dá)到最大值，當(dāng)培養(yǎng)溫度超過36°C時(shí)，凝乳酶活力和蛋白水解活力都在下降，但凝乳酶活力影響更大些，因此，選定36V為最佳培養(yǎng)溫度。實(shí)施例3
本實(shí)施例說明搖床轉(zhuǎn)速對(duì)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基其他條件相同的情況下，搖床轉(zhuǎn)速依次采用60 r/min> 100 r/min> 120 r/min、140r /min、180 r/min、220 r/min、260 r/min。由圖3可以看出，搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí)，凝乳活力與蛋白水解活力均達(dá)到最大值，且二者比值最大，其后隨著搖床轉(zhuǎn)速的增大，凝乳活力和蛋白水解活力緩慢下降，變化不大，因此選擇搖床轉(zhuǎn)速為120 r/min較適宜。實(shí)施例4
本實(shí)施例說明裝液量對(duì)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基其他條件相同的情況下，100 mL三角瓶中的裝液量依次采用5 mL、15 mL、25 mL、35 mL、45 mL、55 mL
進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
由圖4可以看出，裝液量為25 mL時(shí),凝乳活力和蛋白水解活力都達(dá)到最大值，隨著裝液量的增加，蛋白水解活力稍有下降，而蛋白水解活力降低得更為明顯。因此，選擇裝液量為25 mL較適宜。實(shí)施例5
本實(shí)施例說明培養(yǎng)基初始pH對(duì)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的影響，在發(fā)酵培養(yǎng)基其他條件相同的情況下，培養(yǎng)基初始pH依次采用3、4、5、6、7、8，以自然pH (6. 8)為對(duì)照進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。由圖5可以看出，培養(yǎng)基的初始pH不同，所產(chǎn)酶的凝乳活力和蛋白水解活力差別較大，培養(yǎng)基在酸性3. 0-6. 0的范圍內(nèi)，凝乳活力與蛋白水解活力變化較大，當(dāng)初始pH為6.0時(shí),凝乳酶活力與蛋白水解活力均達(dá)到最大值,培養(yǎng)基在中性至堿性7. 0-8. 0的范圍內(nèi)，凝乳酶活力與蛋白水解活力均比較穩(wěn)定，因此，將培養(yǎng)基的初始PH控制在6.0較好。
權(quán)利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的方法，其特征在于，在100 mL搖瓶中配制一定體積的發(fā)酵培養(yǎng)基，接入一定量的解淀粉芽孢桿菌種子液，在恒溫振蕩器中培養(yǎng)溫度24 38°C，搖瓶轉(zhuǎn)速60-260 r/min，然后進(jìn)行凝乳活力和蛋白水解活力的測(cè)定。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，種子培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基馬鈴薯浸粉O. 5%,葡萄糖2%，蛋白胨1%，NaCl O. 5%, 121°C滅菌20 min。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，發(fā)酵培養(yǎng)基馬鈴薯浸粉O.5%，葡萄糖I.13%，酵母浸粉 I. 76%, CaCO3 O. 32%, 121°C滅菌 20 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于解淀粉芽孢桿菌接種量為3.5%。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于培養(yǎng)溫度為36°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于搖床轉(zhuǎn)速為120r/min。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于最佳裝液量為25mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于培養(yǎng)基初始pH為6.O。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于凝乳活性的測(cè)定方法為，取5mL 100 g/L的脫脂乳，40°C保溫5 min后加入O. 5 mL經(jīng)適當(dāng)稀釋的發(fā)酵液混合，振蕩使它們混合均勻；準(zhǔn)確記錄從加入酶液到乳凝固的時(shí)間(s);凝乳酶活力(milk-clotting activity,MCA )定義為40 min凝固I mL 10%脫脂乳的酶量為I個(gè)酶活力單位(Soxhelt Unit,Su) ；MCA = ( 2400X5XD) / ( TXO. 5)式中MCA 為凝乳酶活力 / ( Su/mL) ；T 為凝乳時(shí)間/s ；D為稀釋倍數(shù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于蛋白水解活力的測(cè)定方法為底物是牛乳全酪蛋白，用PH 6. 5 O. IM磷酸鹽緩沖液配制2%酪蛋白溶液，I mL底物溶液加入O. I mL酶液，在40°C孵育I h，立即加入I. I mL O. 4 M TCA溶液終止反應(yīng)，渦旋混勻后在室溫下放置20 min,然后12000 r/min離心10 min,上清液中多肽含量用Lowry法測(cè)定；一個(gè)酶活力單位定義為每分鐘生成100 μ g多肽所需的酶的量。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵的方法，本發(fā)明為了進(jìn)一步提高解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的活力，對(duì)影響解淀粉芽孢桿菌凝乳酶活力的培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速、培養(yǎng)基初始pH及發(fā)酵時(shí)間等主要因素進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵條件，在100mL三角瓶中裝25mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量3.5%，培養(yǎng)溫度36℃，培養(yǎng)基最初pH為6.0，發(fā)酵時(shí)間為20h，搖床轉(zhuǎn)速為120r/min，凝乳酶活力可達(dá)最高值。
文檔編號(hào)C12R1/07GK102634501SQ201210135058
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者張斌 申請(qǐng)人:蘇州百趣食品有限公司