專利名稱：轉(zhuǎn)基因水稻bt63及其衍生品種的lamp檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及轉(zhuǎn)基因植物品種的檢測方法，具體涉及轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織近期發(fā)表的《2010年全球生物技術(shù)/轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢》報告顯示，由于轉(zhuǎn)基因作物帶來的巨大益處，過去15年內(nèi)大約有I億人 次的農(nóng)民做出種植決定。自轉(zhuǎn)基因作物投入商業(yè)化種植15年來,全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積累計已經(jīng)超過10億公頃。2010年,全球29個國家的1540萬農(nóng)民種植了共I. 48億公頃的轉(zhuǎn)基因作物。自1996年至2010年，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積增加了 87倍。種植轉(zhuǎn)基因作物排名前十位的國家種植面積首次均超過了 100萬公頃。這些國家按照作物種植面積的大小排列分別是美國(6680萬公頃)、巴西(2540萬公頃)、阿根廷(2290萬公頃)、印度(940萬公頃)、加拿大(880萬公頃)、中國(350萬公頃)、巴拉圭(260萬公頃)、巴基斯坦(240萬公頃)、南非(220萬公頃)和烏拉圭(110萬公頃)。目前，世界各國已進(jìn)行田間試驗的轉(zhuǎn)基因作物超過5000種，批準(zhǔn)商品化的轉(zhuǎn)基因作物有160多種，包括玉米、大豆、油菜、番茄、馬鈴薯、甜椒、木瓜、甜菜、煙草、水稻等。水稻sativa Z.)是世界上最重要的糧食作物之一，全球約三分之一以上的人口以水稻為主食。同時，水稻也是受害蟲侵襲最為嚴(yán)重的糧食作物之一.據(jù)不完全統(tǒng)計，全世界每年因蟲害造成的損失占水稻總產(chǎn)量的5%以上，約為IXlO6 t。特別是近年來，二化螟等蛀莖害蟲的發(fā)生逐年加重，對水稻生產(chǎn)造成嚴(yán)重威脅。傳統(tǒng)化學(xué)防治方法的長期使用，不但增加生產(chǎn)成本，造成環(huán)境污染，而且破壞了生態(tài)平衡，因此選育抗蟲水稻是防治害蟲最經(jīng)濟(jì)、有效的方法，隨著植物細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程將外源抗蟲基因?qū)胨?，使水稻自身產(chǎn)生抗蟲蛋白從而達(dá)到防治害蟲的目的已成為現(xiàn)實。目前，國內(nèi)外已培育出多個高抗水稻螟蟲locrocis medinalis')飽輯紙蟲基因材料，如轉(zhuǎn)Bt基因水稻。Bt基因是一種革蘭氏陽性芽抱細(xì)菌蘇云菌桿菌(Bacillusthuringiertsis Bt)殺蟲晶體蛋白基因的簡稱，目前Bt基因已成為植物基因工程及轉(zhuǎn)基因育種應(yīng)用中最廣泛的抗蟲基因。但是由于轉(zhuǎn)入的外源基因并非來自傳統(tǒng)的基因庫，轉(zhuǎn)抗蟲基因植物可能帶來生態(tài)效應(yīng)和環(huán)境風(fēng)險問題已成為國際社會關(guān)注的焦點。1993年，聯(lián)合國經(jīng)濟(jì)發(fā)展與合作組織(OECO)提出了食品安全性評估的“實質(zhì)等同性”原則。如果準(zhǔn)基因作物生產(chǎn)的產(chǎn)品與傳統(tǒng)產(chǎn)品具有實質(zhì)等同性，則可以認(rèn)為是安全的。最早提出對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行標(biāo)識管理的是歐盟，1998年，歐盟在世界上簽署第一個法案，要求對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行標(biāo)簽說明；1999年，要求出口到歐盟的非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品不得含有1%的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品污染；2002年，歐盟將標(biāo)識的最低限量降低到O. 9%。日本，澳大利亞，新西蘭對轉(zhuǎn)基因成分的最低含量做了不同規(guī)定，域值從I 5%不等。我國于2001年5月9日公布并實施《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理條例》，于2002年I月5日公布了農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評價，標(biāo)識和進(jìn)口安全管理三個配套管理辦法，確定了第一批實施標(biāo)識管理的農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物目錄，并于2002年3月20日起正式實施。為了能 夠?qū)D(zhuǎn)基因作物及其產(chǎn)品做出綜合評價，除了需要各國政府和國際機構(gòu)制定科學(xué)的安全評價體系以及嚴(yán)格的管理法規(guī)外，建立有效的方法體系對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行檢測也很重要，這是對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行安全性評價和實施監(jiān)管的基礎(chǔ)，也是農(nóng)產(chǎn)品國際貿(mào)易健康發(fā)展的重要保障。轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測要求方法要快速，準(zhǔn)確，靈敏，并且還得考慮適應(yīng)大樣品量，目標(biāo)基因種類多等特點。因此，目前轉(zhuǎn)基因作物的檢測主要是檢測樣品是否含有外源蛋白質(zhì)(基因表達(dá)產(chǎn)物)和是否含有外源基因(DNA)。轉(zhuǎn)基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試紙條檢測、Western雜交等方法檢測，主要從待測樣品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基質(zhì)，利用與目的蛋白(抗原)特異性結(jié)合的特性，通過偶聯(lián)抗體與抗原抗體復(fù)合物的作用產(chǎn)生可檢測的信號，但是這種方法要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，只能作為輔助檢測手段。轉(zhuǎn)基因作物的核酸檢測方法主要有兩種核酸分子雜交技術(shù)(Sourthernblot) ,PCR檢測技術(shù)。其中PCR檢測方法是最主要,最準(zhǔn)確地檢測轉(zhuǎn)基因作物的方法，包括定性PCR方法，符合PCR方法，巢式PCR方法，競爭性定量PCR方法，熒光定量PCR方法等等。目前，國內(nèi)外推廣使用的是定性PCR和實時定量PCR檢測方法PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。通過聚合酶的作用，在體外快速特異地擴(kuò)增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在幾小時內(nèi)迅速擴(kuò)增到百萬倍，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后很容易觀察，因而具有快速靈敏等優(yōu)點。然而，PCR方法反應(yīng)體系和操作過程比較復(fù)雜，需要專業(yè)人員；所需PCR儀價格在5萬元左右，擴(kuò)增時間2 3小時，擴(kuò)增結(jié)果的電泳時間需要I小時左右；電泳常用染料EB為強致癌物質(zhì)，有較強毒性，且難以實行現(xiàn)場檢測。所以，在科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐中均需要一種快速簡便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠且適用于現(xiàn)場操作的轉(zhuǎn)基因作物檢測方法。環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(Loop-MediatedIsothermal Amplification,以下簡稱LAMP法)是日本榮研化學(xué)株式會社于2000年前后開發(fā)出的基因擴(kuò)增技術(shù)，其具有快速簡便、操作準(zhǔn)確、容易普及、安全可靠的優(yōu)點，目前尚未有將LAMP法應(yīng)用于快速檢測轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測引物組。本發(fā)明的另目的在于提供一種轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒。本發(fā)明的另一個目的在于提供一種基于上述檢測引物組及檢測試劑盒的轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的恒溫基因擴(kuò)增檢測方法。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下
轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測引物組，包括外引物I和外引物2、內(nèi)引物I和內(nèi)引物2，其核苷酸序列分別如下所示
外引物 I TCTTGCCCGGCGTCAAT (SEQ ID No :1);
外引物 2 TTCGTAGCCCCACCACTAC (SEQ ID No :2);
內(nèi)引物 I :TTGACTGGAGCGAGGCGATGGGATAATACCGCGCCACAT (SEQ ID No :3);
內(nèi)引物 2 :GACCGCTGTTATGCGGCCATTCCTCTAGAGTCGACCTGC (SEQ ID No :4)。轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，包括以下成分 (1)引物液含有上述的檢測引物組，濃度分別為4 6μ M外引物I、4 6 μ M外引物2，32 48 μ M內(nèi)引物1、32 48 μ M內(nèi)引物2 ;
(2)反應(yīng)液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是7 9 :4 6 :2 ;
(3)DNA聚合酶濃度為7 9υ/μ I ;
(4)對照陽性對照為轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。優(yōu)選的，所述引物液中含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40μΜ內(nèi)引物1、40μΜ內(nèi)引物2。優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μ I。優(yōu)選的，所述反應(yīng)液中，IOmM dNTP : 10XThermoPol反應(yīng)緩沖液150mM MgS04 =8 5 2體積比。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒中還可以含有顯色齊U，所述顯色劑為熒光染料SYBRGreen I。利用以上所述的試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的方法，包括如下步驟
(1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化樣品DNA；
(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 5 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設(shè)置陽性對照反應(yīng)時，用轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于63 65°C反應(yīng)60 90min，并在80°C持續(xù)2min ；
(3)結(jié)果判斷通過觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來判斷擴(kuò)增結(jié)果。在試劑盒中含有顯色劑的情況下，在(2)得到的產(chǎn)物中加入I 2μ I顯色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來判斷擴(kuò)增結(jié)果。其中，CTAB法提取轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63 DNA的方法為
(1)取轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63約IOOmg,放入研缽中，加入少量液氮迅速磨碎,液氮反復(fù)加入3 4次，磨碎成粉末為止；
(2)加入I.5ml預(yù)熱至65°C的CTAB提取緩沖液，充分混合、懸浮試樣，65°C保育30min，期間不停顛倒混勻；
(3)約12000g離心lOmin。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管,加入I倍體積的苯酹氯仿異戍醇(25:24:1)，充分混合，約12000g離心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；
(4)加入I倍體積的氯仿異戊醇(24:1)，充分混合，約12000g離心15min。轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中；
(5)加入2倍體積的CTAB沉淀緩沖液，室溫靜置保育60min；12000g離心15min，棄上清；加入350 μ I氯化鈉溶液溶解沉淀；12000g離心lOmin，轉(zhuǎn)移上清至一新離心管； (6)加入O.6倍體積異丙醇，倒置離心管輕柔混合，室溫放置20min，12000g離心15min，棄上清，加入500 μ 170%乙醇溶液，并顛倒離心管數(shù)次，12000g離心lOmin，棄上清；
(7)干燥DNA沉淀，加100μ ITE緩沖液溶解DNA。本發(fā)明基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(LAMP法)，根據(jù)靶基因設(shè)計的四條引物能特異性識別靶基因序列上的六個獨立區(qū)域，啟動循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動互補鏈合成，結(jié)果在同一鏈上周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖一環(huán)DNA混合物。采用4條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63 65°C對核酸進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)需在恒溫條件下進(jìn)行，反應(yīng)時間依據(jù)模板DNA質(zhì)量變化,一般為90min或更少,在60 90min的短時間內(nèi)擴(kuò)增效率可以達(dá)到IO9 101°個拷貝數(shù)。加入模板DNA，在63 65°C經(jīng)60 90min反應(yīng)后,在80°C持續(xù)2min后終止。這項技術(shù)的優(yōu)點是不需要熱循環(huán),且由于擴(kuò)增是在恒溫條件下進(jìn)行，因此不需要PCR儀等昂貴儀器。在反應(yīng)中，在核酸大量合成時，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中Mg離子結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鎂的白色沉淀。本發(fā)明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡便、適合現(xiàn)場檢測等有益效果
(1)快速高效整個擴(kuò)增只用60 90min即可完成，擴(kuò)增產(chǎn)量可達(dá)IO9 101°個拷貝；
(2)操作簡便不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，不需要預(yù)先進(jìn)行雙鏈DNA的變性等繁瑣步驟，只需要一部恒定溫度儀就能反應(yīng)和檢測，條件比較溫和；
(3)高特異性本發(fā)明根據(jù)轉(zhuǎn)基因水稻BT63的外源基因與內(nèi)源基因結(jié)合處設(shè)計了四條特異性引物，應(yīng)用上述四條引物，擴(kuò)增靶序列的6個區(qū)域，具有很強的品系特異性，且非常穩(wěn)定，形成引物二聚體概率低，保證了反應(yīng)的順利進(jìn)行；
(4)高靈敏度最低檢測極限可達(dá)到10個拷貝；
(5)鑒定簡便可通過觀察觀察加入SYBRGreen I顏色變化或者是否存在焦磷酸鎂沉淀來判斷擴(kuò)增與否，無需電泳等其他任何分析步驟，適合現(xiàn)場檢測。


圖I是實施例I的檢測結(jié)果圖(1-4 :待檢樣品；5 :陽性對照；6 :陰性對照)；
圖2是實施例2的檢測結(jié)果圖(1、2 :待檢樣品；3 :陰性對照，4 :陽性對照)；
圖3是實施例3的檢測結(jié)果圖(1-6依次為5%、0· 5%、0· 1%、005%、0· 01%、O. 005%的樣品DNA，7 :陰性對照8 :陽性對照)；
圖4是實施例4的檢測結(jié)果圖(1-20依次為轉(zhuǎn)基因水稻BT63、LLRICE601、LLRICE62、科豐6號、克螟稻，轉(zhuǎn)基因玉米BT176，轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788，轉(zhuǎn)基因土豆EH92-527-1，轉(zhuǎn)基因油菜T45，轉(zhuǎn)基因棉花GHB614，非轉(zhuǎn)基因水稻日本晴、珍汕97、明恢63、合江19、9311，非轉(zhuǎn)基因玉米、小麥、油菜、棉花、煙草)。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但并不局限于此。
上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。如無特殊說明，以下實施例中的“％”均指質(zhì)量百分比。實施例I含顯色劑的試劑盒及其檢測方法
轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，包括引物液、反應(yīng)液、DNA聚合酶、對照和顯色劑
Cl)引物液:含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40μΜ內(nèi)引物1、40μΜ內(nèi)引物2，四條引物為
外引物 I TCTTGCCCGGCGTCAAT (SEQ ID No :1)
外引物 2 TTCGTAGCCCCACCACTAC (SEQ ID No :2)
內(nèi)引物 I :TTGACTGGAGCGAGGCGATGGGATAATACCGCGCCACAT (SEQ ID No :3)
內(nèi)引物 2 :GACCGCTGTTATGCGGCCATTCCTCTAGAGTCGACCTGC (SEQ ID No :4)
(2)反應(yīng)液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是8:5:2;
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μ I ;
(4)對照陽性對照為濃度為5%的轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應(yīng)混合液；
(5)顯色劑熒光染料IX SYBR Green I。用上述試劑盒按以下方法對待測水稻品種進(jìn)行檢測
(1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化待測樣品DNA；
(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設(shè)置陽性對照反應(yīng)時，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于65°C反應(yīng)60min，并在80°C持續(xù)2min ；
(3)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)管中加入2μI顯色劑，混勻，若顯現(xiàn)綠色則為陽性，橙色則為陰性。本實施例中，陰性對照顯現(xiàn)橙色，陽性對照顯現(xiàn)綠色，待檢樣品1、2的PCR管顯綠色(圖I中管1、2)，表明待檢水稻樣品1、2中含有或全部為轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63及其衍生品種，含有轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63成分，待檢樣品3、4的PCR管顯橙色(圖I中管3、4)，則表明待檢樣品
3、4中不含轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63成分。參照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中檢測 BT63 品系的引物 T51F :GACTGCTGGAGTGATTATCGACAGA (SEQ ID No 5), T51R AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG(SEQ ID No :6)和探針FAM-TCGAGTTCATTCCAGTTACTGCAACACTCGAG-TAMRA (SEQ ID No :7)進(jìn)行熒光定量PCR檢驗，檢驗結(jié)果與上述LAMP方法結(jié)果一致。實施例2不含顯色劑的試劑盒及其檢測方 法
試劑盒中除缺少實施例I中的顯色劑外，其余同實施例I。用上述試劑盒按以下方法對待測水稻品種進(jìn)行檢測(1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化待測樣品DNA；
(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設(shè)置陽性對照反應(yīng)時，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于65°C反應(yīng)60min，并在80°C持續(xù)2min ；
(3)結(jié)果判斷將反應(yīng)管放置在濁度儀中按(2)中步驟反應(yīng)，觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來判斷擴(kuò)增結(jié)果，如果出現(xiàn)沉淀則為陽性，無沉淀則為陰性。本實施例中，陰性對照無沉淀，陽性對照產(chǎn)生沉淀，待檢樣品I的PCR管出現(xiàn)沉淀(圖2管1)，表明待檢水稻樣品I中含有或全部為轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種，含有轉(zhuǎn)基 因水稻BT63成分。待檢樣品2的PCR管沒有出現(xiàn)沉淀(圖2管2)，表明待檢樣品2中不含轉(zhuǎn)基因水稻BT63成分。參照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中檢測 BT63 品系的引物 T51F :GACTGCTGGAGTGATTATCGACAGA (SEQ ID No 5), T51R AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG(SEQ ID No :6)和探針FAM-TCGAGTTCATTCCAGTT ACTGCAACACTCGAG-TAMRA (SEQ ID No :7)進(jìn)行熒光定量PCR檢驗，檢驗結(jié)果與上述LAMP方法結(jié)果一致。實施例3 PCR反應(yīng)與本發(fā)明檢測方法靈敏度的比較
按下列配方制備轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒
Cl)引物液:含有5μΜ外引物1、5μΜ外引物2，40 μ M內(nèi)引物1、40μΜ內(nèi)引物2，四條引物為
外引物 I :TCTTGCCCGGCGTCAAT (SEQ ID No. I)
外引物 2 TTCGTAGCCCCACCACTAC (SEQ ID No. 2)
內(nèi)引物 I :TTGACTGGAGCGAGGCGATGGGATAATACCGCGCCACAT (SEQ ID No. 3)
內(nèi)引物 2 :GACCGCTGTTATGCGGCCATTCCTCTAGAGTCGACCTGC (SEQ ID No. 4)
(2)反應(yīng)液含有IOmMdNTP、10XThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是8:5:2;
(3)DNA聚合酶Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μ I ;
(4)對照陽性對照為濃度為5%的轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應(yīng)混合液；
(5)顯色劑熒光染料IX SYBR Green I。用上述試劑盒按以下方法對轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63進(jìn)行檢測
(1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化待測樣品DNA，分別稀釋成5%、0.5%、O. 1%、0· 05%、O. 01%、O. 005% 的樣品 DNA ；
(2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設(shè)置陽性對照反應(yīng)時，用濃度為5%的轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于65°C反應(yīng)60min，并在80°C持續(xù)2min ；
(3)結(jié)果判斷將反應(yīng)管放置在濁度儀中按(2)中步驟反應(yīng)，觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來判斷擴(kuò)增結(jié)果，如果出現(xiàn)沉淀則有擴(kuò)增，無沉淀則無擴(kuò)增。也可以在(2)中得到產(chǎn)物中加入I μ I顯色劑，混勻，肉眼觀察。無擴(kuò)增反應(yīng)的管子呈現(xiàn)黃色，有擴(kuò)增反映的管子變成綠色。本實施例中，陽性對照、5%、0· 5%,O. 1%、0· 05%,O. 01%,O. 005%均出現(xiàn)沉淀顯示為有擴(kuò)增，陰性對照無沉淀顯示為無擴(kuò)增 ；加入顯色劑后，陽性對照、5%、0. 5%、0. 1%、0. 05%、O. 01%,O. 005%的PCR管顯綠色，陰性對照管子呈現(xiàn)黃色(見圖3)。PCR反應(yīng)引物采用本方法反應(yīng)中的外引物I和外引物2。PCR反應(yīng)為25 μ I體系，10XPCR Buffer (PCR 反應(yīng)緩沖液，Promega 公司)2· 5 μ I, IOmM dNTPs (Promega 公司)O. 5μ 1，上、下游引物分別對應(yīng)外引物I和外引物2，各O. 5μ l，Taq酶(5υ/μ I ,Promega公司)0. 5 μ 1，DNA模板I μ 1，用滅菌去離子水補至25 μ I。反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30s，58。。退火30s，72。。延伸30s，72。。延伸7min。PCR產(chǎn)物取10 μ I與2%瓊脂糖凝膠電泳，100V電壓下40min，通過凝膠成像分析儀觀察結(jié)果，.對應(yīng)條帶分別為M，DL600 DNAMarker (DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，最大DNA片段為600堿基對)；1，陽性對照；2，5% ； 3,0. 5% ；4,0. 1%； 5,0.05%； 6,0.01%； 7，O. 005% ; 8，陰性對照。其中 PCR 方法的靈敏度為O. 05%,而6，7顯示為陰性結(jié)果。由兩種方法比較可以看出，本發(fā)明的試劑盒的靈敏度的結(jié)果可以達(dá)到O. 005%的濃度，而PCR方法的靈敏度為O. 05%，而O. 01%或以下顯示為陰性結(jié)果；經(jīng)比對，本發(fā)明的試劑盒及方法靈敏度明顯高于PCR方法的敏感度，能檢測出更低含量的樣品。實施例4特異性實驗
用實施例I的鑒定方法分別對分離純化的轉(zhuǎn)基因水稻BT63、LLRICE601、LLRICE62、科豐6號、克螟稻，轉(zhuǎn)基因玉米BT176，轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788，轉(zhuǎn)基因土豆EH92-527-1，轉(zhuǎn)基因油菜T45，轉(zhuǎn)基因棉花GHB614，非轉(zhuǎn)基因水稻日本晴、珍汕97、明恢63、合江19、9311，非轉(zhuǎn)基因玉米、小麥、油菜、棉花、煙草進(jìn)行鑒定，同時參照EU Reference Laboratory for GMFood and Feed 中檢測 BT63 品系的引物 T51F :GACTGCTGGAGTGATTATCGACAGA (SEQ ID No:5)，T51R AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG (SEQ ID No :6)和探針 T51p :FAM_TCGAGTTCATTCCAGTTACTGCAACACTCGAG-TAMRA (SEQ ID No :7)進(jìn)行熒光定量 PCR 檢驗。鑒定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因水稻LLRICE601、LLRICE62、科豐6號、克螟稻，轉(zhuǎn)基因玉米BT176，轉(zhuǎn)基因大豆M0N89788，轉(zhuǎn)基因土豆EH92-527-1，轉(zhuǎn)基因油菜T45，轉(zhuǎn)基因棉花GHB614，非轉(zhuǎn)基因水稻日本晴、珍汕97、明恢63、合江19、9311，非轉(zhuǎn)基因玉米、小麥、油菜、棉花、煙草反應(yīng)管均為橙色，即無擴(kuò)增；轉(zhuǎn)基因水稻BT63的反應(yīng)管為綠色，即有擴(kuò)增(見圖4)。本結(jié)果與 EU Reference Laboratory for GM Food and Feed 中的突光定量 PCR 結(jié)果相一致，顯示出良好的特異性。
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測引物組，包括外引物I和外引物2、內(nèi)引物I和內(nèi)引物2，其核苷酸序列分別如下所示 外引物 ITCTTGCCCGGCGTCAAT (SEQ ID No :1);外引物 2 TTCGTAGCCCCACCACTAC (SEQ ID No 2)；內(nèi)引物 I :TTGACTGGAGCGAGGCGATGGGATAATACCGCGCCACAT (SEQ ID No :3);內(nèi)引物 2 :GACCGCTGTTATGCGGCCATTCCTCTAGAGTCGACCTGC (SEQ ID No :4)。
2.轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，包括以下成分 Cl)引物液含有權(quán)利要求I所述的引物組，濃度分別為4 6μΜ外引物1、4 6μΜ外引物2，32 48 μ M內(nèi)引物1、32 48 μ M內(nèi)引物2 ; (2)反應(yīng)液含有IOmMdNTP、10 X ThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM MgS04水溶液，三者的體積比是7 9 :4 6 :2 ; (3)DNA聚合酶濃度為7 9υ/μ I ; (4)對照陽性對照為轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA，陰性對照為不含目的基因的反應(yīng)混合液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述引物液中含有5μ M外引物1、5μΜ外引物2，40μΜ內(nèi)引物1、40μΜ內(nèi)引物2。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述DNA聚合酶為Bst DNA聚合酶，濃度為8U/ μ I。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63及其衍生品種的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述反應(yīng)液中，IOmM dNTP : 10XThermoPol反應(yīng)緩沖液150mM MgS04 = 8 :5 :2體積比。
6.利用權(quán)利要求2 5任一項所述的試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的方法，包括如下步驟 (1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化樣品DNA； (2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 5 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設(shè)置陽性對照反應(yīng)時，用轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于63 65°C反應(yīng)60 90min，并在80°C持續(xù)2min ； (3)結(jié)果判斷通過觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化來判斷擴(kuò)增結(jié)果。
7.根據(jù)權(quán)利要求2 5任一項所述的LAMP檢測試劑盒，其特征在于還含有顯色劑，所述顯色劑為熒光染料SYBRGreen I。
8.利用權(quán)利要求7所述的試劑盒檢測轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的方法，包括如下步驟 (1)待檢樣品DNA的提取采用CTAB法提取純化樣品DNA； (2)恒溫基因擴(kuò)增反應(yīng)在200ulPCR管配制反應(yīng)體系引物液I μ 1，反應(yīng)液12. 5μ I,DNA聚合酶I μ 1，待檢DNA 2 5 μ 1，用滅菌去離子水補齊到25 μ I ;設(shè)置陽性對照反應(yīng)時，用轉(zhuǎn)基因水稻ΒΤ63的DNA或含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA替代待檢DNA，設(shè)置陰性對照反應(yīng)時，用不含目的基因的反應(yīng)混合液替代待檢DNA ;將配制好的PCR管混勻后離心，并于63 65°C反應(yīng)60 90min，并在80°C持續(xù)2min ； (3)結(jié)果判斷在上述反應(yīng)管中加入I 2μ I顯色劑，混勻，根據(jù)顯色結(jié)果來判斷擴(kuò)增結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種的LAMP檢測引物組、檢測試劑盒及檢測方法。檢測引物組包括四條特異性引物；檢測試劑盒包括引物液、反應(yīng)液、DNA聚合酶和對照；試劑盒還可以有顯色劑。其檢測方法是通過提取待檢水稻品種的DNA、采用四條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在63～65℃對樣品DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，短時間擴(kuò)增效率可達(dá)到109～1010個拷貝，其鑒定采用加入SYBRGreenI觀察顏色變化或者利用濁度儀觀察反應(yīng)管內(nèi)沉淀的濁度變化判斷擴(kuò)增與否，確定待檢水稻品種是否含有或為轉(zhuǎn)基因水稻BT63及其衍生品種。本發(fā)明具有快速高效、操作簡便、高特異性、高靈敏度、鑒定簡便、適合現(xiàn)場檢測等優(yōu)點，適于推廣應(yīng)用。
文檔編號C12N15/11GK102634591SQ20121012879
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者劉津, 葉宇鑫, 吳少云, 石磊, 肖艷文, 高東微 申請人:廣州迪澳生物科技有限公司