抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6及其分子標記方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6及其分子標記方法，利用廣西普通野生稻材料y11與感病品種廣恢998雜交、回交和自交獲得的BC3F7進行關聯(lián)分析和遺傳連鎖分析，獲得抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6，其位于分子標記RM20148-RM20297之間，分子標記RM20148引物，存在qSRBSDV6時擴增條帶為129bp條帶；分子標記RM20297引物，存在qSRBSDV6時擴增條帶為172bp條帶。本發(fā)明可通過抗南方水稻黑條矮縮病基因的分子標記來檢測抗性材料y11及其衍生品種（系）中是否含有南方水稻黑條矮縮病抗性基因位點，可預測其南方水稻黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗南方水稻黑條矮縮病水稻的選擇效率。
【專利說明】抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6及其分子標記方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子遺傳學領域，涉及廣西普通野生稻材料yll抗南方水稻黑條矮縮 病位點qSRBSDV6及其分子標記方法。

【背景技術】
[0002] 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全世界一半以上的人口以稻米為主要糧 食。南方水稻黑條矮縮自2001年首次被發(fā)現(xiàn)，在短短的幾年間病情蔓延迅猛，給我國南方 廣大稻區(qū)及越南北部水稻生產(chǎn)造成了極大損失。與普通水稻黑條矮縮病不同，南方水稻黑 條矮縮病是一種以白背飛虱為主要傳播媒介的水稻病毒病，其病原病毒為南方水稻黑條矮 縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，簡稱 SRBSDV)，是呼腸孤病毒科斐 濟病毒屬第2組的一個新種。目前生產(chǎn)上針對此類病害尚無特效農(nóng)藥，主要是植株早期通 過對白背飛虱的防治，減輕其危害，但防治效果不理想，且污染環(huán)境，破壞生態(tài)系統(tǒng)。培育和 利用抗病品種一直被公認為最經(jīng)濟有效和環(huán)境友好的防治病毒措施，篩選、發(fā)掘和創(chuàng)新抗 病種質(zhì)是抗南方水稻黑條矮縮病育種的前提和基礎。然而，有關抗南方水稻黑條矮縮病基 因分子機理的研宄極少，寄主的抗性研宄也剛剛起步，目前僅有少數(shù)幾篇有關抗性材料篩 選的報道，抗性基因挖掘及抗病育種研宄尚未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術的上述不足，本發(fā)明公開了抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6 及其分子標記方法。
[0004] 抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6,位于分子標記RM20148-RM20297之間；所 述分子標記RM20148引物，存在qSRBSDV6時的擴增條帶為129bp條帶；所述的分子標記 RM20297引物，存在qSRBSDV6時的擴增條帶為172bp條帶。
[0005] 所述抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6的分子標記方法：用分子標記RM20148 引物，或用分子標記RM20297引物擴增抗南方水稻黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用 分子標記RM20148引物能夠擴增出129bp擴增片段，或用用分子標記RM20297引物能夠擴 增出172bp擴增片段，則標志著水稻品種（品系）抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6的 存在。
[0006] 篩選所述的抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6的分子標記的方法，包括以下 步驟： 步驟1 :以抗南方水稻黑條矮縮病的普通野生稻材料yll為供體，感南方水稻黑條矮縮 病的栽培稻品種廣恢998為受體，通過雜交、回交和自交構建了一套包含280個株系的水稻 染色體片段導入系BC3F 7; 發(fā)明人對648份普通野生稻和栽培稻材料進行了南方水稻黑條矮縮病的人工接種和 田間誘發(fā)鑒定，篩選到1份南方水稻黑條矮縮病發(fā)病率較低的材料一普通野生稻yll，該普 通野生稻材料yl 1連續(xù)三年三點田間鑒定均對南方水稻黑條矮縮病表現(xiàn)高抗，進一步進行 室內(nèi)接種鑒定，三次重復鑒定的結果表明該品種具有較高的南方水稻黑條矮縮病抗性。該 抗源的發(fā)掘為抗南方水稻黑條矮縮病基因的定位、克隆和育種利用提供了材料基礎。
[0007] 步驟2 :采用室內(nèi)接種鑒定結合田間誘發(fā)鑒定進行南方水稻黑條矮縮病的抗性鑒 定； 步驟3 :在導入系中取高抗和高感各30株，利用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨法)提 取水稻植株的DNA，構建DNA高、低池，利用基于簡化基因組測序技術SLAF-seq的水稻Super BSA方法對抗南方水稻黑條矮縮病基因進行主基因定位； 步驟4 :用高抗南方水稻黑條矮縮病導入系與受體親本廣恢998雜交獲得F2 :3家 系，對其中300個家系進行抗性鑒定，提取DNA，通過簡單重復序列標記SSR分析，利用 MAPMARKER/EXP3. 0軟件對多態(tài)性標記基因型和相應家系的南方水稻黑條矮縮病抗性級別 進行連鎖分析，并將Kosambi函數(shù)轉換為遺傳距離。利用Windows QTL Cartographer V2.0 軟件復合區(qū)間作圖法，以2cM為步長在基因組內(nèi)進行掃描，QTL的檢測采用5%總體顯著水 平，相應L0D統(tǒng)計量的顯著閥值用排列測驗方法進行估計，共重復抽樣1000次； 步驟5 :獲得抗南方水稻黑條矮縮病野生稻材料yll抗南方水稻黑條矮縮病位點 qSRBSDV6 -個，位于標記RM20148-RM20297之間，通過抗南方水稻黑條矮縮病主基因的分 子標記來檢測抗性材料yll及其衍生品種(系）中是否含有該主基因位點，預測其南方水稻 黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗南方水稻黑條矮縮病水稻的選擇效率。
[0008] 其中，步驟3所述主基因定位于第6染色體上；步驟3采用CTAB法，可以很好去除 多糖，更有利于提取和純化水稻植株的DNA。
[0009] 本發(fā)明所述的抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6在水稻育種中的應用。
[0010] 本發(fā)明所述的抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6在快速篩選抗南方水稻黑條 矮縮病品種或者品系中的應用。
[0011] 本發(fā)明所述的抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6的分子標記引物在在水稻育 種中的應用。
[0012] 本發(fā)明所述的抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6的分子標記引物在快速篩選 抗南方水稻黑條矮縮病品種或品系中的應用。
[0013] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果為： 本發(fā)明利用抗南方水稻黑條矮縮病的普通野生稻材料yll與感病品種廣恢998雜交、 回交和自交獲得的BC3F7進行關聯(lián)分析和遺傳連鎖分析，獲得一個抗南方水稻黑條矮縮病 位點qSRBSDV6,通過與qSRBSDV6連鎖的分子標記來檢測抗性材料yll及其衍生品種(系)中 是否含有抗南方水稻黑條矮縮病基因位點，可以預測其南方水稻黑條矮縮病的抗性水平， 大大提高抗南方水稻黑條矮縮病水稻的選擇效率。本發(fā)明所提供的抗南方水稻黑條矮縮病 主效基因位點的分子標記方法，具有以下優(yōu)點： (1)本發(fā)明在國際上首次用利用基于簡化基因組測序技術SLAF-seq的水稻Super BSA 方法和SSR分子標記定位了水稻抗南方水稻黑條矮縮病位點。
[0014] (2)通過本發(fā)明分子標記定位的抗性基因位點位置明確，鑒定方便快捷。通過檢測 這些與抗南方水稻黑條矮縮病基因位點連鎖的分子標記，即可以預測水稻植株的南方水稻 黑條矮縮病抗性水平，用于水稻品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有 南方水稻黑條矮縮病抗性，進而快速篩選抗病品種或品系用于水稻育種，抗性基因位點的 檢測方便快速，不易受環(huán)境影響。
[0015] (3)輔助育種選擇目標明確，效率高。以往的傳統(tǒng)育種技術，在提高抗性育種方法 中，通常利用含抗病基因的供體親本與受體親本進行雜交、多次回交或聚合復交。而且要 對南方水稻黑條矮縮病的抗性進行單株選擇；然而，由于南方水稻黑條矮縮病不能經(jīng)過白 背飛虱的蟲卵傳毒，要經(jīng)過飼養(yǎng)白背飛虱、飼毒和接種傳毒等復雜的鑒定過程，鑒定難度很 大，表型鑒定的結果可靠性低；因此，抗南方水稻黑條矮縮病育種不僅費時費工，而且難度 大、成本高。通過利用本發(fā)明中的分子標記檢測南方水稻黑條矮縮病基因位點，可以在苗期 就鑒定出抗南方水稻黑條矮縮病的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約成本，而且大大提高了抗 南方水稻黑條矮縮病水稻的選擇效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是普通野生稻材料yll抗南方水稻黑條矮縮病基因在染色體上的位置。
[0017] 圖2是抗南方水稻黑條矮縮病基因緊密連鎖分子標記的電泳圖譜。
[0018]圖中：M:Mark;l:yll;2:廣恢998 ;3-12:極抗單株；13-22:極感單株。

【具體實施方式】
[0019] 下面結合附圖，對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步的詳細說明。
[0020] 材料與方法： 步驟1 :遺傳分析分尚群體的構建； 以抗南方水稻黑條矮縮病野生稻材料yll為父本，感南方水稻黑條矮縮病品種廣恢 998為母本，配制Fi雜種，再以廣恢998為母本，998/y11雜種為父本進行回交直到BC芯，之 后進行自交加代繁種獲得BC3F7群體。利用高抗南方水稻黑條矮縮病導入系農(nóng)14與受體親 本雜交再自交，獲得抗性分離群體F2 :3家系。
[0021] 步驟2 :采用室內(nèi)接種鑒定結合田間誘發(fā)鑒定進行南方水稻黑條矮縮病的抗性鑒 定； (1)田間誘發(fā)鑒定 材料分別種植于南寧市廣西農(nóng)科院水稻所實驗田、防城港市防城區(qū)那梭鎮(zhèn)那夏村感病 稻田、桂林市興安縣湘漓鎮(zhèn)分水塘村感病稻田。2012年-2014年連續(xù)三年進行三點鑒定，南 寧市和防城港市的鑒定在晚造進行，桂林市的鑒定在中造進行。每個材料插36株，設兩個 重復，常規(guī)水肥管理，不施用任何農(nóng)藥，鑒定材料旁邊種植感病品種TN1作為誘發(fā)品種。分 蘗初期隨機對從試驗田塊采集來的50頭白背飛虱進行南方水稻黑條矮縮病毒的TR-PCR檢 測，確定帶毒率。
[0022] 于水稻分蘗盛期統(tǒng)計發(fā)病率。此時發(fā)病植株表現(xiàn)出明顯的病狀：極明顯的矮縮，葉 片深綠、僵直，心葉從下葉葉鞘伸出，葉背的葉脈和莖桿上出現(xiàn)蠟白色或短條狀瘤突、莖節(jié) 有倒生氣須根。而健康植株生長旺盛，高度正常，發(fā)病植株和健康植株反差非常明顯。以每 個實驗點2個重復的發(fā)病百分率平均值作為品種的抗南方水稻黑條矮縮病表型值進行統(tǒng) 計。
[0023] (2)人工接種南方水稻黑條矮縮病毒鑒定 將親本、BC3F7群體株系、抗病和感病對照品種浸種催芽，播種約100粒露白發(fā)芽種子于 20cmX30cmX3cm的搪瓷盆內(nèi)，設2個重復。當秧苗長至1. 5-2葉時，淘汰弱苗，保留50株 整齊一致的健康苗。放入防蟲網(wǎng)箱，接入從南寧市石埠鎮(zhèn)采集并且經(jīng)過飼毒的白背飛虱，每 棵植株按2-3頭蟲的比例接種。每天驅蟲3-5次，確保每株稻苗均有白背飛虱停留。3d后 移走苗上的飛虱。把接種后的稻苗移栽到防蟲網(wǎng)室，待長至分蘗盛期進行病情調(diào)查。
[0024] 步驟3 :yll/廣恢998分離群體的抗南方水稻黑條矮縮病主基因定位 (1) 用CTAB法提取親本、F1及BC3F7群體株系的DNA，在導入系中取高抗、高感各30株， 利用CTAB法提取水稻植株的DNA，構建DNA高、低池； (2) 利用基于簡化基因組測序技術SLAF-seq的水稻Super BSA方法對抗病基因進行分 析和基因定位，實驗步驟如下： ① SLAF-seq實驗流程：根據(jù)前期信息學方法設計的酶切方案，對各樣品基因組DNA 進行酶切，對酶切片段進行平端化，5'磷酸化和3'端加A處理，連接測序接頭，構建每個樣 本的SALF-seq文庫，切膠選取目標片段，最后進行PCR擴增和高通量測序； ② 生物信息學分析：對測序得到的各樣品的reads數(shù)據(jù)進行評估，通過相似性聚類、 基因型糾錯后，得到SLAF標簽，對SLAF標簽進行多態(tài)性分析，得到樣品間的多態(tài)性標記，根 據(jù)得到的多態(tài)性標記進行基因定位，得到性狀相關的差異標記。對得到的SLAF標簽，根據(jù) 等位基因數(shù)和基因序列之間的差異進行多態(tài)性分析，得到多態(tài)性的SLAF標簽，即Marker。 根據(jù)Marker的定位結果，統(tǒng)計Marker在各染色體上的數(shù)量，繪制Marker在染色體上的分 布圖； ③ 基因定位：對得到的8, 526個Marker，進行親本數(shù)據(jù)標準化，根據(jù)親本測序深度確 定等位基因的親本來源，選取一種基因型來源于1-2,另一種基因型來源于2-1的Marker共 6, 403個。對這6, 403個Marker，采用SNP-index關聯(lián)方法進行檢驗分析。
[0025] 步驟4 :利用第6染色體的SSR標記分析F2:3分離群體并對抗病基因進行分析。 SSR分析程序如下： ① 所述 12U1PCR 反應體系包括：DNA(10ng/yl)，2yl ;Primer(4pmol/yl)，1.5yl ; 2 X Taq PCR Master Mix (中科瑞泰），6 y 1 ;ddH20, 2. 5 y 1 ; ② 擴增反應在東盛龍ETC811擴增儀上進行，所述PCR反應條件為：95°C預變性5min， 95°C變性35s，55°C復性35s，72°C延伸lmin，35個循環(huán)，最后72°C延伸7min。擴增產(chǎn)物用 8%的非變性PAGE膠分離，通過銀染顯色。親本間有多態(tài)的引物在F2:3群體進行分析，獲取 樣本基因型資料； ③ 根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構建水稻的第6染色體圖譜，所用軟件為 MARKER/EXP3. 0,最小LOD值設為2,獲得連鎖圖譜； ?利用 Windows QTL Cartographer V2. 5 軟件復合區(qū)間作圖法（Composite interval mapping，CM)，以2cM為步長在基因組內(nèi)進行掃描。QTL的檢測采用5%總體顯著水平，相 應L0D統(tǒng)計量的顯著閾值用排列測驗方法進行估計，其重復抽樣1000次。同時估計了各位 點的加性效應和貢獻率。利用MARMAKER/EXP3. 0分析軟件進行南方水稻黑條矮縮病抗性與 SSR標記的分離分析，并將Kosambi函數(shù)轉換為遺傳距離（cM)。
[0026] 步驟5:結果與分析 yll和廣恢998經(jīng)南方水稻黑條矮縮病的田間和室內(nèi)鑒定，其平均發(fā)病率分別為4. 2% 和82. 2%，表明yll具有較高的南方水稻黑條矮縮病抗病性，而廣恢998高感南方水稻黑條 矮縮病。關聯(lián)分析結果表明，在第6號染色體上有檢測到一段明顯位于閾值線以下的區(qū)域， 該段區(qū)域即為找到的與抗南方水稻黑條矮縮病基因關聯(lián)的區(qū)域。該位點位于第6染色體長 臂上，遺傳物理距離為2Mb。通過SSR分子標記分析，利用高抗導入系與受體親本的F2 :3 家系構建了第6染色體的遺傳圖譜，結合表型數(shù)據(jù)，利用Windows QTL Cartographer V2. 5 軟件進行抗南方水稻黑條矮縮病的QTL檢測。如圖1所示，結果在水稻的第6染色體上標 記RM20148和RM20297之間檢測到一個抗南方水稻黑條矮縮病的QTL qSRBSDV6, L0D值為 7. 93,貢獻率為22. 7%，可解釋表型變異的22. 7%。
[0027] 分子標記RM20148引物： 上游引物：GAGCCGAACTGACCTCCACTGC 下游引物：CACTGCCTCCGGGTCAITGC 分子標記RM20297 : 上游引物：ITGGCACGGCCATATAACAAGC 下游引物：AAGITGATGGCCTTTGGITTGC 用分子標記RM20148引物或者用RM20297引物擴增抗南方水稻水稻黑條矮縮病品種或 育種材料DNA，如圖2所示，用分子標記RM20148能夠擴增出129bp的擴增片段，或用分子標 記RM20297引物能擴增出172bp的擴增片段，則標志著水稻品種抗南方水稻黑條矮縮病的 位點qSRBSDV6的存在。
[0028] 通過與上述基因位點連鎖的分子標記來檢測抗性材料yll及其衍生品種(系沖是 否含有抗南方水稻黑條矮縮病基因位點，可預測其南方水稻黑條矮縮病抗性水平，大大提 高抗南方水稻黑條矮縮病水稻的選擇效率。
[0029] 以上內(nèi)容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬【技術領域】的普通技術人員來說，在 不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的 保護范圍。
【權利要求】
1. 抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6,其特征在于：其位于分子標記 RM20148-RM20297之間；所述分子標記RM20148引物，存在qSRBSDV6時的擴增條帶為129bp 條帶，所述的分子標記RM20297引物，存在qSRBSDV6時的擴增條帶為172bp條帶。
2. 權利要求1所述的抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6的分子標記方法，其特征在 于：用分子標記RM20148引物，或用分子標記RM20297引物擴增水稻抗南方水稻黑條矮縮病 品種或育種材料DNA，如果用分子標記RM20148引物能夠擴增出129bp擴增片段，或用分子 標記RM20297引物能夠擴增出172bp擴增片段，則標志著水稻品種（品系）抗南方水稻黑 條矮縮病位點qSRBSDV6的存在。
3. 篩選如權利要求1所述的抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6的分子標記的方法， 其特征在于：包括以下步驟： 步驟1 :以抗南方水稻黑條矮縮病的普通野生稻材料yll為供體，感南方水稻黑條矮縮 病的栽培稻品種廣恢998為受體，通過雜交、回交和自交構建了一套包含280個株系的水稻 染色體片段導入系BC3F7; 步驟2 :采用室內(nèi)接種鑒定結合田間誘發(fā)鑒定進行南方水稻黑條矮縮病的抗性鑒定； 步驟3 :在導入系中取高抗和高感各30株，利用CTAB法提取水稻植株的DNA，構建DNA 高、低池，利用基于簡化基因組測序技術SLAF-seq的水稻Super BSA方法對抗南方水稻黑 條矮縮病基因進行主基因定位； 步驟4 :用高抗南方水稻黑條矮縮病導入系與受體親本廣恢998雜交獲得F2 :3家 系，對其中300個家系進行抗性鑒定，提取DNA，通過簡單重復序列標記SSR分析，利用 MAPMARKER/EXP3. 0軟件對多態(tài)性標記基因型和相應家系的黑條矮縮病抗性級別進行連鎖 分析，并將Kosambi函數(shù)轉換為遺傳距離；利用Windows QTL Cartographer V2.0軟件復 合區(qū)間作圖法，以2cM為步長在基因組內(nèi)進行掃描，QTL的檢測采用5%總體顯著水平，相應 L0D統(tǒng)計量的顯著閥值用排列測驗方法進行估計，共重復抽樣1000次； 步驟5 :獲得抗南方水稻黑條矮縮病野生稻材料yll抗南方水稻黑條矮縮病位點 qSRBSDV6 -個，位于標記RM20148-RM20297之間，通過抗南方水稻黑條矮縮病主基因的分 子標記來檢測抗性品種yll及其衍生品種(系）中是否含有該主基因位點，預測其南方水稻 黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗南方水稻黑條矮縮病水稻的選擇效率。
4. 根據(jù)權利要求3所述的分子標記方法，其特征在于：步驟3所述主基因定位于第6染 色體上。
5. 權利要求1所述的抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6在水稻育種中的應用。
6. 根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于：所述抗南方水稻黑條矮縮病位點 qSRBSDV6在快速篩選抗南方水稻黑條矮縮病品種或者品系中的應用。
7. 權利要求1所述的抗南方水稻黑條矮縮病位點qSRBSDV6的分子標記引物在水稻育 種中的應用。
8. 根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于：所述抗南方水稻黑條矮縮病位點 qSRBSDV6的分子標記引物在快速篩選抗南方水稻黑條矮縮病品種或品系中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450694SQ201410683130
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月24日 優(yōu)先權日:2014年11月24日
【發(fā)明者】李丹婷, 農(nóng)保選, 夏秀忠, 秦碧霞, 張宗瓊, 楊行海, 曾宇, 鄧國富, 李戰(zhàn)彪, 劉開強 申請人:廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所