專利名稱：：水稻品種抗褐飛虱主基因Bph3的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了水稻品種抗褐飛虱主基因5pW的分子標(biāo)記方法，屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，專用于水稻抗褐飛虱品種的選育與種質(zhì)資源的利用。二
背景技術(shù)：
：水稻是我國的重要糧食作物。褐飛虱是一種水稻單食性害蟲，屬同翅目飛虱科。通過口針吸食水稻莖稈韌皮部汁液，為典型的刺吸式害蟲。嚴(yán)重時引起稻株下部變黑、腐爛發(fā)臭、倒癱，稱之為"虱燒"，導(dǎo)致水稻減產(chǎn)或失收。目前，對褐飛虱的防治主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥，但此措施不但增加了生產(chǎn)成本，且污染環(huán)境，因此，最為經(jīng)濟(jì)有效而不造成污染的防治措施是抗蟲品種的應(yīng)用。迄今，已發(fā)現(xiàn)和鑒定了13個抗褐飛虱主基因。其中，顯性基因6個，即^p/z-7(AthwalWa/"1971)、5p/-3(LakshiminarayanaandKhush，1977)、Bp/-6(KabirandKhush，1988)、5;/kP(IkedaWa/.，1985;NemotoWa/"1989a)、5;^-卿(Multani"1994;Ishii"a/"1994)和麟-卿(劉國慶等，2001)。隱性基因7個，艮卩6p/z-2(AthwalWa/"1971)、6p/z-4(LakshiminarayanaandKhush,1977)、6/^-5(Khush"a/.,1985)和6p/-7(KabirandKhush,1988)、6p/7-8(Ikeda,1985;NemotoWa/"1989a)、6;/z-"W和6p/z-"^(HirabayashiandOgawa,1999)。其他研究還進(jìn)行了抗褐飛虱的QTL(quantitivetraitlocus，數(shù)量性狀位點)定位研究，已鑒定了26個抗褐飛虱QTL。但真正用于水稻抗蟲育種的抗褐飛虱基因并不多。國際水稻研究所自1973年先后選育了一系列分別攜帶B;^-h6如-2和5如-3等抗褐飛虱主基因的水稻品種，在種植這些品種的地區(qū)有效地控制了褐飛虱的暴發(fā)。然而，由于褐飛虱新生物型的產(chǎn)生，抗褐飛虱品種逐漸喪失抗性或面臨抗性喪失的危險(PathakandKhush,1979;PathakandSaxena,1980;Heinrichs,1986;SaxenaandKhan,1989;Heinrichs,1994;GallagherWa/.,1994)。我國也先后育成一系列含有抗褐飛虱基因5/^-7的品種(組合)，對褐飛虱的防治起了積極的作用。呂仲賢等(2002)對1986-2000年國家和浙江省育種攻關(guān)協(xié)作組提供的3328份水稻新品種(系)進(jìn)行了抗褐飛虱鑒定和篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)從"七五"、"八五"到"九五"抗蟲品種鑒出率呈下降趨勢，水稻抗褐飛虱育種未受到足夠重視。目前，國內(nèi)褐飛虱以生物型2為主，致害力強(qiáng)的孟加拉型生物型比例上升，原來帶有5p/7-7的抗蟲品種，已逐漸失去抗性，因而迫切需要培育新的攜帶多個抗性基因的抗蟲品種。由于抗蟲性鑒定的復(fù)雜性，利用常規(guī)育種手段往往難以有效地聚合不同的抗蟲基因。而在找到與抗蟲基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上，借助分子標(biāo)記輔助選擇(Marker-assistedselection,MAS)技術(shù)則可以有目的地進(jìn)行抗蟲基因或QTL的聚合，選育持久抗性品種，延緩抗蟲品種的退化年限和防止褐飛虱新生物型的發(fā)生。三
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供了水稻品種RathuHeenati抗褐飛虱主基因的分子標(biāo)記方法，通過檢測與這些抗褐飛虱主基因連鎖的分子標(biāo)記，可以預(yù)測水稻植株的褐飛虱抗性，加快抗褐飛虱水稻的選擇進(jìn)度。技術(shù)方案水稻品種抗褐飛虱主基因的分子標(biāo)記方法，水稻品種RathuHeenati對褐飛虱的抗性由一個主基因SpW控制，其特征在于用標(biāo)記引物A4，左端序列AAGCAGCATAAACTGATTGA右端序列TCATCTTCTGAAAAAGCAAT或者用標(biāo)記引物RM16533,左端序列TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC右端序歹UCATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC或者用標(biāo)記引物RH7841，左端序列TGCCAAGTATGTATGCCTAT右端序歹UTTTTAGAGACCGTGTCCTTG或者用標(biāo)記引物RH786，左端序歹UTTTGAAGTTCTTTCCATCTGA右端序列AAATGTGCTATCTGGGGTAAA或者用標(biāo)記引物RH007，左端序列CTTGCGTTCCGTAGGAGAAG右端序列TGAGTGTAACCCGAAGTGGC擴(kuò)增水稻抗褐飛虱品種或育種材料DNA，如果用引物A4能夠擴(kuò)增出193bp的擴(kuò)增片段，或用引物RM16533能夠擴(kuò)增出285bp的擴(kuò)增片段，或用引物RH7841能夠擴(kuò)增出213bp的擴(kuò)增片段，或用引物RH786能夠擴(kuò)增出176bp的擴(kuò)增片段，或用引物RH007能夠擴(kuò)增出182bp的擴(kuò)增片段，均標(biāo)志著該水稻品種抗褐飛虱主基因5pW的存在，該主基因位于水稻第4染色體短臂上。有益效果本發(fā)明所提供的水稻品種抗褐飛虱主基因的分子標(biāo)記方法，具有以下優(yōu)點(1)通過本發(fā)明在國際上首次用SSR標(biāo)記精細(xì)定位了水稻品種RathuHeenati中的抗褐飛虱的主基因S/^3。P)通過本發(fā)明分子標(biāo)記定位的主基因位置明確，鑒定方便。通過檢測這些與抗褐飛虱基因連鎖的分子標(biāo)記，即可以預(yù)測水稻植株的褐飛虱抗性，用于水稻品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有褐飛虱抗性，進(jìn)而快速篩選抗病品種或品系用于水稻育種。主基因位點的檢測方便快速，不受環(huán)境影響；(3)輔助育種選擇目標(biāo)明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗蟲基因的親本與栽培品種進(jìn)行一系列雜交，而且要對褐飛虱抗性進(jìn)行單株選擇。對水稻抗褐飛虱進(jìn)行表型鑒定復(fù)雜，同時受環(huán)境影響，首先要獲得蟲源、伺養(yǎng)褐飛虱，此外要獲得接種蟲源和水稻秧苗同步，非常困難，表型鑒定的結(jié)果可靠性低。因此抗蟲育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測抗褐飛虱主基因位點，可以在苗期就鑒定出高抗褐飛虱的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高抗褐飛虱水稻的選擇效率。(4)同時可用于抗蟲雜交品種的純度鑒定和苗期快速鑒定。四圖1水稻品種RathuHeenati抗褐飛虱基因在染色體上的分布。五具體實施例方式研究表明，抗褐飛虱基因資源主要存在于斯里蘭卡和印度秈稻和野生稻種中(IkedaandVaughau，1991)。Athwal"a/.(1971)報道Mudgo、C022和MTU15攜帶同一抗褐飛虱基因5/7/^，ASD7攜帶一個隱性抗蟲基因6p/7-2。AthwalandPathak(1972)報道MGL2含有抗蟲基因5;/z-7，Ptbl8含有6;/z-2。MartinezandKhush(1974)報道IR747B2-6含有5;/7-7，Rl154-243和IR4-93含有LakshiminarayanaandKhush(1977)報道斯里蘭卡抗蟲品種RathuHeenati由一個與^p/z-7獨立分離的顯性基因B/^-3控制；而品種Babawee則由一個與Z);/-2獨立分離的隱性基因6p/-4控制。SidhuandKhush(1978)報道攜帶B/^-3或Z)如-4的水稻品種對所有的褐飛虱生物型都表現(xiàn)抗性。泰國水稻品種Col.5Thailand和Col.llThailand,緬甸水稻品種ChinSaba由同一個與6如-2和6如一都不等位的隱性抗蟲基因6p/-S控制(Ikeda，1985)。這些抗蟲基因的鑒定和遺傳研究為抗蟲品種的培育提供了基礎(chǔ)，其中S;^-7、6/^-2和5p/z-3已被應(yīng)用到抗蟲育種中。但是，由于抗蟲性鑒定的復(fù)雜性，利用常規(guī)育種手段往往難以有效地聚合不同的抗蟲基因。而在找到與抗蟲基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上，借助分子標(biāo)記輔助選擇(Marker-assistedselection,MAS)技術(shù)則可以有目的地進(jìn)行抗蟲基因和QTL的聚合，選育持久抗性品種，延緩抗蟲品種的退化年限和防止褐飛虱新生物型的發(fā)生。通過本發(fā)明抗蟲水稻品種RathuHeenati抗褐飛虱主基因和微效基因位點的鑒定和分子標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)，特別抗褐飛虱主基因位點可用來指導(dǎo)抗褐飛虱水稻品種的選育工作，用與之連鎖的分子標(biāo)記對抗蟲品種進(jìn)行篩選，使不同抗蟲主基因位點快速聚合在同一個植株中，從而大大提高育種效率。(一)RathuHeenati/02428F2群體構(gòu)建及表型鑒定(1)以抗褐飛虱品種RathuHeenati(Ikeda和Kaneda腦，JpnJBreed,31(3):279-285)為母本，感褐飛虱粳稻品種02428(鄒江石等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1989，22(1):6—14)為父本，配制雜種，構(gòu)建了包含156個單株的RathuHeenati/02428F2分離群體，每個F2單株通過自交獲得相應(yīng)的RathuHeenati/02428F2:3家系，進(jìn)行抗蟲鑒定。(2)采用苗期接種對親本、Fl、F2:3進(jìn)行抗蟲性鑒定，褐飛虱為生物型1和生物型2混合種群(Sun,LH等2005)。為確保親本、F！和F2:3群體中的每個家系生長一致，所有供試材料在播種前分別浸種催芽。每個家系(品種)分別取25粒種子播種于一個直徑8.5cm、高9.0cm,盛滿營養(yǎng)土的圓形塑料缽中(缽底部有一小孔，便于滲透吸水)，株距為2.5cm。各品種隨機(jī)種植3缽。每28個塑料缽置于一個65cmx44cmxl4cm的塑料箱內(nèi)(箱內(nèi)保持水層2cm左右)。播種7天后間苗，淘汰病弱苗，保留到每缽20株，待苗長到兩葉一心期時按10頭/苗的比例接種2-3齡褐飛虱若蟲，最后罩上尼龍紗網(wǎng)罩，當(dāng)感蟲品種TN1(Sun，LH等2005)全部死亡時，參照Athwal等(1971)、IRRI(1988)和Huang等(2001)的方法對每個單株進(jìn)行0，1,3,5，7或9級的抗性評價(表l)，對親本材料和群體的每個家系通過加權(quán)平均計算該家系的抗性級別，并根據(jù)抗性級別推測此單株基因型。表l本研究所用的抗感褐飛虱評價標(biāo)準(zhǔn)抗蟲級別苗期受褐飛虱為害表現(xiàn)抗性水平0葉片無萎縮，植株健康抗(R)1一張葉片發(fā)黃抗(R)一張到二張葉片發(fā)黃或一張葉片萎縮中抗(MR)一到三張葉片萎縮或一張葉片枯萎中抗(MR)7三到四張葉片萎縮或二到四張葉片枯萎，植株仍活著感(S)9植株枯死感(S)(二)RathuHeenati/02428F2群體的分子標(biāo)記分析(l)用SDS法提取親本、及F2群體各株系的DNA。(2)SSR分析參照Chenetal.(1997)的程序。lO^tl反應(yīng)體系包括10mMTris-HC1pH8.3,50mMKC1,1.5mMMgC12,50岸dNTPs,0.2pM引物，0.5UTaqpolymerase(TaKaRa，大連)禾卩20ngofDNA模板。擴(kuò)增反應(yīng)在PTC-200(MJResearchInc.)PCR儀上進(jìn)行:94°C4min;94。C1min,55°C1min，72°C1.5min，35個循環(huán)；72°C7min。擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的非變性PAGE膠分離，通過銀染顯色，銀染程序根據(jù)Sanguinettietal.(1994)的方法制定而成。擴(kuò)增的DNA條帶利用裝有熒光燈的燈箱進(jìn)行觀察。記錄結(jié)果，親本間有多態(tài)的引物在F2群體中進(jìn)行分析，獲取群體基因型資料；(3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用MAPMARKER/EXP3.0軟件對各個分子標(biāo)記的群體基因型資料構(gòu)建水稻的遺傳連鎖圖譜。(4)利用WindowsQTLCartographerV2.0軟件(Wangetal.，2003)復(fù)合區(qū)間作圖法(Compositeintervalmapping,CIM)，以2cM為步長在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。QTL的檢測采用5%總體顯著水平，相應(yīng)LOD統(tǒng)計量的顯著閾值用排列測驗(Permutationtest)(ChurchillandDoerge，1994)方法進(jìn)行估計，共重復(fù)抽樣1000次。同時估計了各位點的加性效應(yīng)和貢獻(xiàn)率。根據(jù)工具公共數(shù)據(jù)庫中提供的粳稻品種日本晴和秈稻品種9311的基因組序列，利用PowerBlast分析軟件，尋找秈、粳品種基因組序列中存在的插入/缺失位點，利用PrimerPremier5.0軟件開發(fā)InDel標(biāo)記。(三)結(jié)果與分析(1)抗性鑒定苗期集團(tuán)抗性鑒定顯示RathuHeenati、02428和的抗蟲級別分別為0.3、8.1和1.1，表明RathuHeenati抗褐飛虱而02428感褐飛虱并且RathuHeenati的抗蟲性由顯性基因控制，156個F2:3家系對褐飛虱的抗蟲級別頻率分布呈連續(xù)分布，最小為O.l，最大為9.00，并在l、5和8三個位置出現(xiàn)3個明顯的峰值。根據(jù)對褐飛虱的抗蟲級別將F2:3家系分為抗蟲、抗感分離和感蟲三種表現(xiàn)型，而相應(yīng)的F2單株的基因型則分別為記為RR(純合抗蟲)、Rr(雜合抗蟲)和rr(純合感蟲)三種。F2群體對褐飛虱的抗感分離符合1:2:1的比例(義2=1.69,^o.m.2=5.99)(表2)。表2RathuHeenati/02428F2分離群體156個單株對褐飛虱抗感分離比例F2基因型a)F2個體數(shù)W相應(yīng)F2:3家系表現(xiàn)型^RR44RS<2Rr702￡RS<7rr42RS27~a)RR，純合抗蟲；Rr，雜合抗蟲；rr，純合感蟲b)lRR:2Rr:lrr適合性測驗值x2為1.69(x2o.o5,2=5.99);c)本欄為抗蟲級別值域；RS,ResistanceScore(抗蟲級別)(2)連鎖分析連鎖分析將RathuHeenati中的抗褐飛虱基因Bph3定位在RM8213和RM5953之間，與兩標(biāo)記分別相距3.6cM和3.2cM(圖1)，該位點對褐飛虱抗性的貢獻(xiàn)率為83.9%，為抗性主基因位點。標(biāo)記RM8213條帶為168bp，RM8213引物左端序列AGCCCAGTGATACAAAGATG和右端序列GCGAGGAGATACCAAGAAAG;標(biāo)記RM5953條帶為195bp，RM5953引物左端序列AAACTTTCTGTGATGGTATC和右端序列ATCCTTGTCTAGAATTGACA。結(jié)果顯示抗性分離與兩個SSR標(biāo)記RM5953和RM8213的基因型值分離存在顯著相關(guān)，進(jìn)一步證明該抗褐飛虱基因與這兩個標(biāo)記的緊密連鎖，該主基因位于水稻第4染色體短臂上。(3)精確定位為進(jìn)一步精細(xì)定位主基因的位點，提高選擇效率，以抗褐飛虱品種RathuHeenati為母本，感褐飛虱粳稻品種02428為父本，配制雜種，構(gòu)建了包含5687個單株的F2分離群體，從中篩選標(biāo)記RM8213和RM5953發(fā)生交換的單株，獲得的交換單株通過自交獲得相應(yīng)的F2:3家系，進(jìn)行抗蟲鑒定。根據(jù)工具公共數(shù)據(jù)庫中提供的粳稻品種日本晴和秈稻品種9311的基因組序列，利用PowerBlast分析軟件，尋找秈、粳品種基因組序列中存在的插入/缺失位點，利用PrimerPremier5.0軟件開發(fā)InDel標(biāo)記，構(gòu)建了RM8213和RM5953之間的飽和連鎖圖譜，結(jié)合表型鑒定結(jié)果將^o力J定位在兩分子標(biāo)記A4和RM16533之間(圖1)。從上述5687株F2中隨即挑選250株，對該區(qū)間的3個Indel標(biāo)記RH784、RH786和RH007的選擇效率進(jìn)行評估，結(jié)果表明這三個標(biāo)記的選擇效率均達(dá)到97%左右(表3)。即用標(biāo)記引物A4，左端序列AAGCAGCATAAACTGATTGA右端序列TCATCTTCTGAAAAAGCAAT或者用標(biāo)記引物RM16533,左端序列TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC右端序列CATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC或者用標(biāo)記引物RH7841左端序列TGCCAAGTATGTATGCCTAT右端序列TTTTAGAGACCGTGTCCTTG或者用標(biāo)記引物RH786左端序歹UTTTGAAGTTCTTTCCATCTGA右端序列AAATGTGCTATCTGGGGTAAA或者用標(biāo)記引物RH007左端序列CTTGCGTTCCGTAGGAGAAG右端序列TGAGTGTAACCCGAAGTGGC擴(kuò)增水稻抗褐飛虱品種或育種材料DNA，如果用引物A4能夠擴(kuò)增出193bp的擴(kuò)增片段，或用引物RM16533能夠擴(kuò)增出285bp的擴(kuò)增片段，或用引物RH7841能夠擴(kuò)增出213bp的擴(kuò)增片段，或用引物RH786能夠擴(kuò)增出176bp的擴(kuò)增片段，或用引物RH007能夠擴(kuò)增出182bp的擴(kuò)增片段，均標(biāo)志著該水稻品種抗褐飛虱主基因5;W的存在，該主基因位于水稻第4染色體短臂上。表3F2群體的抗蟲指數(shù)按RH784、RH786和RH007標(biāo)記的基因型進(jìn)行分類<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>1/1表示02428的基因型，2/2表示RathuHeenati的基因型，1/2表示雜種基因型通過上述分子標(biāo)記鑒定主基因位點來預(yù)測水稻植株抗性，預(yù)計可迅速提高我國水稻抗褐飛虱品種的育種進(jìn)程。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>tgccaagtatgtatgcctat<210>6<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>標(biāo)記引物RH7841右端<222>(1)..(20)<223><400>6ttttagagaccgtgtccttg<210>7<211>21<212>DNA<213>人工合成<220><221>標(biāo)記引物RH786左端<222>(1)..(21)<223><400>7tttgaagttctttccatctga<210>8<211>21<212>DNA<213>人工合成<220><221>標(biāo)記引物RH786右端<222>(1)..(21)<223><400>8aaatgtgctatctggggtaaa<210>9<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>標(biāo)記弓I物RH007左端<222>(1)..(20)<223><400>9cttgcgttccgtaggagaag<210>10<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>標(biāo)記引物RH007右端<222>(1)..(20)<223><400>10tgagtgtaacccgaagtggc<210>11<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>RM8213引物左端說明書第9/10頁2020212120<222>(1),,(20)<223><400>11agcccagtgatacaaagatg<210>12<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>RM8213引物右端<222>(1)..(20)<223><400>12gcgaggagataccaagaaag<210>13<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>RM5953引物左端<222>(1)..(20)<223><400>13aaactttctgtgatggtatc<210>14<211>20<212>DNA<213>人工合成<220><221>RM5953引物右端<222>(1)..(20)<223><400>14atccttgtctagaattgaca權(quán)利要求1、水稻品種抗褐飛虱主基因Bph3的分子標(biāo)記方法，水稻品種RathuHeenati對褐飛虱的抗性由一個主基因Bph3控制，其特征在于用標(biāo)記引物A4左端序列AAGCAGCATAAACTGATTGA右端序列TCATCTTCTGAAAAAGCAAT或者用標(biāo)記引物RM16533左端序列TTTGCTTAGTCGGCAGATGTCC右端序列CATAAGAACGTACCTCCACTGATTCC或者用標(biāo)記引物RH7841左端序列TGCCAAGTATGTATGCCTAT右端序列TTTTAGAGACCGTGTCCTTG或者用標(biāo)記引物RH786左端序列TTTGAAGTTCTTTCCATCTGA右端序列AAATGTGCTATCTGGGGTAAA或者用標(biāo)記引物RH007左端序列CTTGCGTTCCGTAGGAGAAG右端序列TGAGTGTAACCCGAAGTGGC擴(kuò)增水稻抗褐飛虱品種或育種材料DNA，如果用引物A4能夠擴(kuò)增出193bp的擴(kuò)增片段，或用引物RM16533能夠擴(kuò)增出285bp的擴(kuò)增片段，或用引物RH7841能夠擴(kuò)增出213bp的擴(kuò)增片段，或用引物RH786能夠擴(kuò)增出176bp的擴(kuò)增片段，或用引物RH007能夠擴(kuò)增出182bp的擴(kuò)增片段，均標(biāo)志著水稻品種抗褐飛虱主基因Bph3的存在，該主基因位于水稻第4染色體短臂上。全文摘要本發(fā)明涉及水稻品種抗褐飛虱主基因Bph3的分子標(biāo)記方法，屬于遺傳育種
技術(shù)領(lǐng)域：
。對水稻抗蟲品種RathuHeenati(♀)與感蟲品種02428(♂)雜交獲得的F₂各單株的基因型和F_2:3各家系的抗褐飛虱的抗性級別進(jìn)行遺傳連鎖分析，獲得抗蟲品種RathuHeenati抗褐飛虱主基因Bph3。將該基因定位在分子標(biāo)記A4和RM16533之間，且該區(qū)間的3個Indel標(biāo)記RH784、RH786和RH007的選擇效率均在97％左右。通過抗褐飛虱主基因的分子標(biāo)記來檢測抗蟲品種RathuHeenati及其衍生品種(系)中是否含有該主基因，可預(yù)測其對褐飛虱的抗性水平，大大提高抗褐飛虱水稻的選擇效率。文檔編號C12Q1/68GK101418349SQ20081024372公開日2009年4月29日申請日期2008年12月12日優(yōu)先權(quán)日2008年12月12日發(fā)明者萬建民,俊何,喜劉,劉世家,劉裕強(qiáng),寒吳,玲江,陳亮明申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)